一种编码三种活化型生长因子的序列及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种同时表达IGF1、EGF和FGF2三种生长因子的编码序列，利用本发明提供的编码序列，可以构建相应的表达载体，通过导入细胞而高效稳定地分泌具有生物活性的IGF1、EGF和FGF2三种生长因子，用于各种需要添加这三种生长因子的研究。与传统的添加各种重组生长因子相比，解决了由于细胞生长对生长因子的持续消耗而添加外源重组生长因子不能够稳定维持浓度的问题，也避开了各种商品化重组生长因子价格昂贵的缺点。另外构建的表达载体可根据需要选择转染不同细胞，构建各种不同的细胞共培养体系，实现丰富灵活的应用，将需要同时添加外源生长因子和采用共培养体系的工作步骤大大简化，也减少了成本。
【专利说明】—种编码三种活化型生长因子的序列及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属生物技术，涉及多个基因同时表达，具体地说，涉及一种可以在同一转录物上编码三种可分泌的活化的生长因子IGFUEGF和FGF2的序列。该序列可以用于构建真核细胞表达载体，并能够在导入真核细胞后在细胞中同时稳定表达上述无需加工直接具有活性的三种生长因子并分泌到细胞外。
【背景技术】
[0002]近年来，随着干细胞相关机制研究的深入及以各种方式获取干细胞的努力不断取得新的成果，干细胞巨大的分化潜能在修复和受损器官的再生方面显示出了广泛的应用前景，为多种疾病的治疗带来了希望。干细胞是一类能进行自我更新的多潜能细胞，在一定条件下可诱导分化成为多种组织细胞类型。根据来源不同，通过模拟体内特定细胞的正常分化成熟过程 ，干细胞可以被分别诱导分化为神经细胞、心肌细胞、各种血细胞、内耳细胞等终末分化的功能细胞。影响干细胞分化的因素很多，机制复杂。利用干细胞进行疾病治疗时，需要将干细胞有效地定向分化为特定类型的功能细胞，并且需要一定的分化细胞数量和纯度，以达到较好的疗效并尽量减少不良反应。为了达到这一目的，通常需要根据情况在培养体系中加入各种外源生长因子。在所有外源添加的生长因子中，胰岛素样生长因子I(IGF1)、表皮生长因子(EGF)和成纤维细胞生长因子2 (FGF2)是应用最多的生长因子。这三种生长因子通常同时使用，它们是强有力的促有丝分裂原，受体分布广泛，不仅能够维持细胞生存，促进细胞增殖，还参与多种细胞的分化过程，调节细胞的活动和功能。
[0003]另外，在很多肿瘤学研究中，原代肿瘤细胞或细胞系的生长也有许多情况下需要添加上述生长因子，以利于原代肿瘤细胞在离体后的存活、生长以及进行靶向药物研究时检测肿瘤细胞对相应生长因子或受体的依赖性。如研究表皮生长因子受体(EGFR)小分子抑制剂的作用及机制时需要添加相应的生长因子EGF来刺激肿瘤细胞生长、研究成纤维生长因子受体(FGFR)抑制剂类药物的作用机制时需要添加相应的生长因子通常为FGF2、研究肿瘤干细胞特性的球体形成实验中也需要在无血清培养液中添加两种生长因子EGF和FGF2。
[0004]但是由于生长因子本身在培养液中的稳定性受其半衰期影响，而细胞生长对生长因子的需求又是持续的，人为添加重组生长因子不能稳定地维持其作用，而且重组生长因子本身价格也很昂贵。因此如果能够通过细胞稳定表达有活性的生长因子，则可有效地在培养过程中稳定地维持生长因子的浓度。
[0005]因此可以通过构建可同时表达活化型IGF1、EGF和FGF2三种生长因子的表达载体、并导入到相应的细胞中(如建立用于共培养体系的工程细胞)，得到同时稳定表达三种生长因子的细胞系，用于进一步的研究，如与干细胞建立共培养体系，利用工程细胞持续稳定的分泌三种生长因子，诱导干细胞向特定细胞分化；与原代肿瘤细胞共培养，维持其体外生存、生长及增殖。
[0006]在真核细胞中，目的基因表达主要受到转录(包括转录后加工)和翻译(包括翻译后加工)两个水平的调控。在转录水平常常通过采用强启动子(如CMV启动子)来达到高水平的稳定的转录，而转录物尽量仅包括成熟的mRNA开放读框以避免需要额外的转录后加工(影响产生最终可供翻译的转录产物的效率)；而在翻译水平的调控则包括能够增强翻译起始、引导蛋白质定位(如分泌所需的信号肽)以及同样尽量减少合成的蛋白质为体现功能或活性而对翻译后加工的需求
因此，在本发明中我们按照如图1所示的设计思路，将IGFUEGF和FGF2三个生长因子编码序列串联连接，使它们在细胞内表达时可以处于同一个转录物上，即一次转录即可表达同时表达三种生长因子；为了减少翻译后加工效率对最终蛋白质产物的影响，使生长因子蛋白质合成后不必加工即有活性，我们没有采用完整的三种生长因子的编码序列，而是仅仅克隆了包含三种生长因子加工后有活性的部分编码序列；为了有效地使表达的生长因子分泌到细胞外，我们在每个生长因子前都融合了人免疫球蛋白1、轻链的信号肽；由于每个生长因子均为有起始密码和终止密码的独立编码框，因此我们在三个因子编码序列之间加上核糖体内部进入位点(Internal ribosome entry site, IRES),以保证三个生长因子均能有效地被核糖体识别而翻译成相应的蛋白质；为了提高翻译起始识别的效率，我们在每个生长因子编码序列起始密码前都添加了真核细胞中保守的Kozak序列。
[0007]根据上述设计，我们发明了一个同时编码IGF1、EGF和FGF2三种活化生长因子的人工序列，该序列可以用于进一步构建到表达载体上，并通过导入到细胞中，同时表达出三种具有生物活性的生长因子。
[0008]本发明可用于各种需要提供稳定外源IGFl、EGF和FGF2的研究，包括但不仅限于干细胞相关研究及肿瘤相关研究。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是提供一种同时表达IGF1、EGF和FGF2三种生长因子的编码序列，具有如SEQ ID No:1所示的核苷酸序列。其中第7位至第14位、第888位至第895位和第1718位至第1725位为Kozak序列?’第15位至第77位、第896位至第958位和第1726位至第1788位为Igk信号肽编码序列；第297位至第881位和第1127位至1711位为IRES序列?’第78至290位为活化型IGFl编码序列?’第959位至第1120位为活化型EGF编码序列；第1789位至2256位为活化型FGF2编码序列。
[0010]本发明的另一个目的是提供该编码序列的应用。该编码序列用于构建真核表达载体，在导入细胞(如293T细胞)后，可以稳定高效地表达IGFUEGF和FGF2三种活化的生长因子，用于进一步和各种研究。
[0011]本发明同现有技术相比具有以下优点及效果:
利用本发明提供的编码序列，可以构建相应的表达载体，通过导入细胞而高效稳定地分泌具有生物活性的IGF1、EGF和FGF2三种生长因子，用于各种需要添加这三种生长因子的研究。与传统的添加各种重组生长因子相比，解决了由于细胞生长对生长因子的持续消耗而添加外源重组生长因子不能够稳定维持浓度的问题，也避开了各种商品化重组生长因子价格昂贵的缺点。另外构建的表达载体可根据需要选择转染不同细胞，构建各种不同的细胞共培养体系，实现丰富灵活的应用，将需要同时添加外源生长因子和采用共培养体系的工作步骤大大简化，也减少了成本。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1为IGFl、EGF和FGF2三种因子编码序列的设计示意图。
[0013]图2 IRES序列、Ig K信号肽编码序列和活化型EGF编码序列的克隆。
[0014]图3慢病毒载体的构建及鉴定。
[0015]图4慢病毒感染HEK293T细胞。
[0016]图5 Western blot检测生长因子表达。
[0017]图6 CCK-8检测A549细胞增殖。
【具体实施方式】
[0018]本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。这些实施例仅用于说明，但不限制本发明。
[0019]实施例1:1RES序列、Ig k信号肽编码序列、活化型EGF、IGF1和FGF2编码序列的克隆与合成。
[0020]IRES序列的克隆:
采用PCR方法从pIRES2-EGFP质粒中克隆出IRES。引物分别为 IRES-F (SEQ ID No: 2): 5’ -ACTAGTGCCCCTCTCCCTCCCCCC-3?,
IRES-R (SEQ ID No:3): 5，-TCTAGATGTGGCCATATTATCATCGTG-3，(下划线部分分别为引入的5^ 1和油<3 I酶切位点)。
[0021]PCR扩增条件是94°C变性5min，然后94°C变性30sec、58°C退火30sec、72°C延伸30sec，共30个循环，最后72°C延伸7min。扩增产物(597bp，图2A)通过2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，并按照QIAGEN的QIAquicK Gel Extract1n Kit说明书进行切胶回收。取3 μ I切胶回收产物与pGEM-T Easy Vector连接，在T4 DNA连接酶作用下16°C连接过夜。连接产物转化到DH5 α感受态细胞中，氨苄青霉素抗性平板筛选培养，挑取阳性克隆，经EcoRI酶切鉴定正确后测序验证。
[0022]Ig K信号肽编码序列的克隆:
采用PCR方法从pSecTag2A质粒中克隆出Ig K信号肽编码序列。引物分别为Ig K _F(SEQ ID No:4): 5，-ACT AGT TAG CCA CCA TGG AGA CAG AC-3’(下划线部分为引入的分eI酶切位点，斜体加粗部分为引入的Kozak序列)；Ig κ-R (SEQ ID No:5): 5’-GTC ACCAGT GGA ACC TGG AA_3’。PCR扩增条件同上，扩增片段大小为77bp (图2A)，同上方法克隆并测序验证。
[0023] 活化型EGF编码序列的克隆:
以Trizol法提取大肠癌细胞SW620的总RNA，采用Promega公司的逆转录试剂M-MLVReverse Transcriptase逆转录合成cDNA,再以此cDNA为模板，PCR扩增出EGF编码序列。引物分别为 EGF-F (SEQ ID No: 6): 5’ -TTCCAGGTTCCACTGGTGACkkTkQTQkCTCTQkkTQTCCCC-3，(斜体加粗部分为引入的Ig丨、信号肽下游互补序列)，EGF-R (SEQ ID No: 7): 5f-JCTAGAmCGCAGTTCCCACCACTTCA-3’(下划线部分为引入的油a I酶切位点，斜体加粗部分为引入的终止密码)，PCR扩增条件同上，EGF片段大小为188bp (图2A)，同上方法克隆并测序验证。
[0024]以Ig K信号肽和EGF编码序列片段为模板，分别以Ig K-F (SEQ ID No:4)和EGF-RCSEQ ID No: 7)为上下游引物进行overhangPCR扩增，扩增条件同上，扩增获取245bpIg K -EGF目的片段(图2B)，同上方法克隆PCR产物并测序验证。
[0025]活化型IGFl和FGF2编码序列的合成:
带有Kozak序列和Ig K信号肽编码序列的活化型IGFl和FGF2序列分别由公司直接合成，序列如下:
IGFl (296bp，下划线部分分别为引入的分el和ZhI酶切位点，斜体加粗部分为引入的Kozak序列，斜体下划线部分为引入的Ig k信号肽编码序列)(SEQ ID: 8):
5，-kCXkGlTAGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACT^/mGGACCGGAGACGCTCTGCGGGGCTGAGCTGGTGGATGCTCTTCAGTTCGTGTGTGGAGACAGGGGCTTTTATTTCAACAAGCCCACAGGGTATGGCTCCAGCAGTCGGAGGGCGCCTCAGACAGGCATCGTGGATGAGTGCTGCTTCCGGAGCTGTGATCTAAGGAGGCTGGAGATGTATTGCGCACCCCTCAAGCCTGCCAAGTCAGCTTAATCTAGA-3>FGF2 (551bp，下划线部分分别为引入的分el和油<31酶切位点，斜体加粗部分为引入的Kozak序列，斜体下划线部分为引入的Ig k信号肽编码序列)(SEQ ID: 9):
5，-kCXkGlTAGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACT^/mGCAGCCGGGAGCATCACCACGCTGCCCGCCTTGCCCGAGGATGGCGGCAGCGGCGCCTTCCCGCCCGGCCACTTCAAGGACCCCAAGCGGCTGTACTGCAAAAACGGGGGCTTCTTCCTGCGCATCCACCCCGACGGCCGAGTTGACGGGGTCCGGGAGAAGAGCGACCCTCACATCAAGCTACAACTTCAAGCAGAAGAGAGAGGAGTTGTGTCTATCAAAGGAGTGTGTGCTAAC CGTTACCTGGCTATGAAGGAAGATGGAAGATTACTGGCTTCTAAATGTGTTACGGATGAGTGTTTCTTTTTTGAACGATTGGAATCTAATAACTACAATACTTACCGGTCAAGGAAATACACCAGTTGGTATGTGGCACTGAAACGAACTGGGCAGTATAAACTTGGATCCAAAACAGGACCTGGGCAGAAAGCTATACTTTTTCTTCCAATGTCTGCTAAGAGCTGATAATCTAGA-3，。
[0026]实施例2:慢病毒表达载体的构建
按照图1的设计，将上述已获得的各个片段依次连接并克隆至慢病毒载体质粒PLVX-1RES-ZsGreenl中，用内切酶&oRI和油a I双酶切鉴定插入片段的方向，正向插入时片段大小为8.2kb和2280bp (图3)，表明构建成功。正确插入的质粒命名为pLVX_3GF。
[0027]用QIAGEN Plasmid Midi Kits 提取质粒 pLVX_3GF、pMD2G 和 pSPAX2，分别各取10 稀释于Iml不含血清不含抗生素的高糖DMEM中，轻柔混匀，再加入30 μL AttracteneTransfect1n Reagent于上述培养基中，轻柔混匀后室温静置20min以形成转染复合物。人胚肾HEK293T细胞常规培养于含10%胎牛血清的高糖DMEM培病毒的培养液上清，用
0.45 μ m滤器过滤,4 ° C保存备用。
[0028]实施例3:三种生长因子在HEK293T细胞中的表达
接种HEK293T细胞于3.5cm培养皿中(培养基不含抗生素)，24h后(细胞达到70%汇合度)吸去培养液，加入500养基中，于37 °C、5% CO2的饱和湿度培养箱中培养。将Iml消化离心后的HEK293T细胞悬液和Iml转染复合物轻轻混匀后加入到1cm培养皿中，于37°C、5% CO。的饱和湿度培养箱中培养，6-8 h后补足培养基至10ml。分别在转染48 h及72h后，收集含μL含病毒颗粒的上清和Polybrene (忙备液10mg/ml,终浓度8 μ;〗/ml)，6 h后补足培养液，24h后更换新鲜培养液，细胞继续培养48h后，荧光显微镜下观察感染情况(图4A)，并采用有限稀释法(I个细胞/孔接种到96孔板中)筛选可表达绿荧光蛋白的稳定感染的细胞克隆(图4B)，将稳定感染的细胞克隆命名为HEK293T/3GF。
[0029]利用Western blot法检测感染后目的蛋白的表达:
细胞中因子检测:收获HEK293T/3GF细胞及未感染的HEK293T对照细胞，PBS洗涤细胞3次，离心收集细胞，加入冰预冷的裂解液(25 mM Tris-HCl，pH 7.6, 150 mMNaCl,1% NP-40, 1% 脱氧胆酸钠，0.1% SDS,含蛋白酶抑制剂 Complete? Protease InhibitorCocktail),并置于冰上裂解30min, 15000r/min,4° C离心15min收集上清,用DC蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，取20 μ」总蛋白进行20% SDS-PAGE凝胶电泳后转膜，10%牛奶室温封闭Ih后，分别加入EGF、FGF2和IGFl三种抗体(1:500) 4° C孵育过夜。TBST( TBSiJP 0.l%Tween20)洗膜3 X lOmin，加过氧化物酶标记的二抗(1:5000)室温孵育2h，洗膜
3X 1min,化学发光法检测信号。
[0030]培养液中因子检测:收集HEK293T/3GF细胞及未感染的HEK293T对照细胞的培养液各10ml，离心去除细胞碎片，-80° C冷冻干燥，溶于500 μL ddH20,各取20 μL进行20%SDS-PAGE，同上转膜后检测因子表达。
[0031]Western blot结果如图5所示,均在6~18 kDa之间分别检测到了目的蛋白EGF(6.2kDa)、IGFl (6kDa)和FGF2(17.2 kDa)，表明HEK293T/3GF细胞成功表达三种生长因子并可将生长因子分泌到培养液上清中。
[0032]实施例4:三种生长因子功能检测
HEK293T/3GF细胞及HEK293T对照细胞常规培养于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中，于37 °C、5% CO2的饱和湿度培养箱中培养。待细胞长至80%汇合度后再培养48h后收集上清，作为条件培养液。人肺癌细胞A549细胞以每孔1.5 X 14个细胞接种于96孔板，实验组加入50 μL HEK293T/3GF细胞的条件培养液和50 μL的新鲜的含10%胎牛血清的1640培养液，对照组加入50 μL ΗΕΚ293Τ细胞的条件培养液和50 μL的新鲜的含10%胎牛血清的1640培养液。继续培养48h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，在培养箱内孵育2h后用酶标仪检测450nm吸光度值。采用SPSS18.0软件进行统计分析，以means土S.E.Μ.表示，两组均数比较采用t检验；P〈0.05认为差异有统计学意义。
[0033]结果表明，和HEK293T对照条件培养液相比，HEK293T/3GF细胞条件培养液确实能够明显促进A549细胞的生长，差异有统计学意义(P〈0.05)，说明HEK293T/3GF细胞分泌的生长因子确实是具有活性的、能够促进A549细胞生长的生长因子(图6)。
【权利要求】
1.一种同时表达IGFUEGF和FGF2三种生长因子的编码序列，其核苷酸序列如SEQ IDNo:1所示，其中第7位至第14位、第888位至第895位和第1718位至第1725位为Kozak序列?’第15位至第77位、第896位至第958位和第1726位至第1788位为Igk信号肽编码序列；第297位至第881位和第1127位至1711位为IRES序列?’第78至290位为活化型IGFl编码序列；第959位至第1120位为活化型EGF编码序列?’第1789位至2256位为活化型FGF2编码序列。
2.一种根据权利要求1所述的编码序列在构建真核表达载体中的应用，其特征在于，在真核细胞中表达同时表 达IGFUEGF和FGF2三种生长因子，用于进一步研究。
【文档编号】C12N15/12GK104178492SQ201410330202
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年7月13日 优先权日:2014年7月13日
【发明者】叶景佳, 曹江, 郑丹丹, 杨蓓蓓 申请人:浙江大学