诱导型异源双链产生子的改进的制作方法

诱导型异源双链产生子的改进的制作方法
【专利摘要】本发明发现，通过修饰诱导型异源双链产生子(IHG)分子，以便使识别标记自与待进行基因型分型的多态性位点直接相邻的核苷酸位点分隔开，能够改善异源双链条带的分辨。出乎意料地是，发现当使用所述的修饰IHG分子时，可显著地改善诱导型异源双链的分辨。
【专利说明】诱导型异源双链产生子的改进
[0001] 本申请是2005年10月10日提交的题为"诱导型异源双链产生子的改进"的中国 专利申请200580034310. 4的分案申请。

【技术领域】
[0002] 本发明涉及诱导型异源双链产生子（induced heteroduplex generator，IHG)分 子，其提供了对现有技术中已知的此类分子的改进。本发明进一步涉及用于在本发明改进 的IHG和靶基因组DNA序列之间形成诱导型异源双链的方法，以及涉及所述的诱导型异源 双链用于对动物（例如哺乳动物）、植物、病毒或细菌的DNA、通常是人DNA中的突变进行基 因型分型（genotyping)的分析方法。因此，本发明可被用于，例如，关于与遗传性疾病相关 的基因中的多态性和突变（例如囊性纤维化（CFTR基因）、苯丙酮酸尿症（PAH基因）、镰刀 形红细胞病和β -地中海贫血病（HBB基因），以及致癌基因和肿瘤抑制基因中的体细胞突 变。本发明也涉及包含本发明的诱导型异源双链产生子的试剂盒，所述试剂盒可用于分析 基因组DNA序列的方法中。

【背景技术】
[0003] 在生物体的基因组中检测DNA序列变异的能力（为了方便起见，以下简称"多态 性"，但没有限制作用），已经成为诊断疾病和病症中、以及预测对治疗方案的反应中的重要 工具。使用早期变异检测法，越来越可能在身体表现症状之前就诊断和治疗、甚至预防疾病 或病症的发生。而且，变异检测法可成为有用的研究工具，因为它可导致发现病症的遗传基 础，而所述的病症原因迄今不为人所知或被认为是非遗传性的。
[0004] 序列变异可以是很多不同的形式。例如，可以通过在基因的特定位点上将一个或 多个核苷酸残基取代为数目相同的其它核苷酸来产生变异。另一个实例是在基因的特定位 点上缺失一个或多个核苷酸。另一个实例是在基因的特定位点上插入一个或多个额外的核 苷酸。也可以是取代、缺失和插入的组合。序列变异的常见类型是单核苷酸多态性或SNP。 SNP涉及在基因的特定位点上一个核苷酸残基对另一个核苷酸的取代。虽然每个SNP仅涉 及一个核苷酸，但是单个基因可包含很多SNP。
[0005] 鉴定物种或者该物种的个体的特定基因是否含有序列变异，称为基因型分型。所 以，全长测序是实现基因型分型的方法，但其耗时耗力并且效率极低。
[0006] 在现有技术中已知的可选择性基因型分型法利用了所谓的诱导型异源双链产生 子（以前也称为通用异源双链产生子，并在下文中用术语"IHG"来指代）。它们是模拟基因 组DNA序列的合成DNA序列，但其含有与在基因组DNA内已知的多态性位点相对的核苷酸 位置上和（在现有技术中）与之相邻的（即直接相邻）核苷酸位置上遗传工程化引入的受 控的核苷酸取代、缺失、插入或其组合（统称为"识别标记（identifier)"）。为了检测基因 组DNA中的序列变异，分别用相同的基因座特异性PCR引物来扩增IHG和基因组DNA序列， 随后通过加热和缓慢冷却来使相应的PCR产物彼此杂交来产生DNA异源双链。然后，例如 通过非变性的聚丙烯酰胺微型胶电泳，来分辨（resolve)所产生的异源双链。根据在IHG 和基因组DNA之间错配的数目、类型和位置，产生以不同速率迁移的不同异源双链，因此产 生了不同等位基因的特征性条带图。
[0007] 下列参考文献论述了诱导型异源双链产生子的用途：
[0008] I. Bidwell，几，Clay，TM, Wood，NAP，Pursall，MC，Martin，AF，Bradley，BA and Huij KM(1993) Rapid HLA-DR-Dw and DP matching by PCR fingerprinting and related DNA heteroduplex technologies, pp99-116in:Handbook of HLA Typing Techniques[Eds KM Hui&JL Bidwell]CRC Press:Boca Raton，Florida.
[0009] 2. Wood, Nj Tyfieldj Lj Bi dwell, J (1993) Rapid classification of phenylketonuria genotypes by analysis of heteroduplexes generated by PCR-amplifiabIe synthetic DNA. Human Mutation2:131-137.
[0010] 3. Bidwel 1，几，Wood，NAP，Tyf ield，LA, Clay，TM, Culpan，D，Evans，JM，Pursal 1，M Cj Bradley, BA(1993)Universal heteroduplex generators:reagents for genotyping of HLA and of human diseases. Molecular Bases of Human Diseases (Ed. E. E. PoIIi). pp27-34. Elsevier/North-Holland, Amsterdam.
[0011] 4. Wood, Nj Standenj Gj Hows, Jj Bradley, Bj Bidwellj J. (1993) Diagnosis of sickle cell disease with a universal heteroduplex generator. Lancet342:1519-1520.
[0012] 5. Bidwell，几，Wood，NAP，Clay，TM, Pursall，MC，Culpan，D，Evans，J，Bradley，B A,Tyfieldj LA, Standenj Gj Huij KM(1994)DNA heteroduplex technology. IniChrambachj A, Dunn, MJj Radolaj BJ (Eds), Advances in Electrophoresis, Volume7, pp311-351. VCH Press, Weinheim.
[0013] 6. Clay，TM, Cuplan，D，Howell，WM，Sage，DA，Bradley，BA, BidwelI，几 ·（1994) UHG crossmatching: a comparison with PCR-SSO typing in the selection of HLA-DPBl-compatible bone marrow donors. Transplantation58:200-207.
[0014] 7. BidwelljJL (1994) Advances in DNA-based HLA-typing methods. Immunology Todayl5:303-307.
[0015] 8. Tyfield，LA, Stephenson，A，Bidwell，几，Wood，NAPICockburn，F，Harvie，A，S mith,I. (1994)Mutation analysis of the phenylalanine hydroxylase gene using heteroduplex analysis with synthetic DNA constructs. Acta Paediatrica83:47-48.
[0016] 9. Savage，DA，Wood，NAP，Bidwell，JL，Hui，KM. (1995)HLA_DRBl*01subtyping by heteroduplex analysis. Tissue Antigens45:120-124.
[0017] 10. Wood, Nj Standenj Gj Murray, EWj Lillicrapj Dj Holmbergj Lj Peake, IR, Bidwel I, J. (1995)Rapid genotype analysis in type2B von Willebrandi s disease using a universal heteroduplex generator. Brit J Haematol89:152-156.
[0018] 11. Wood，N，Standen，G，Old，J，Bidwell，J. (1995) Optimisation and properties of a UHG for genotyping of haemoglobins S and C. Hum Mutation5:166-172.
[0019] 12. Savage, DAj Wood, NAP, Bidwellj JLj Fitches, A, Old, JMj Huij KM. (1995) Detection of b_thalassaemia mutations using DNA heteroduplex generator molecules.Brit J Haemato190:564-571.
[0020] 13. Tyfieldj LA, Zschockej Jj Stephenson, A, Cockburnj Fj Harviej A, Bidwellj JLj W ood, NAP, Hunt, LP. (1995)Discordant phenylketonuria phenotypes in one family: the relationship between genotype and clinical outcome is a function of multiple effects. J Med Genet32:132-136.
[0021] H-WoodjNAPjBidwelljJL. (1996) UHG : he t erodup I ex and universal heteroduplex generator analysis. In: Laboratory protocols for mutation detection (ed Landegrenj U), pp105-112. Oxford University Press for the Human Genome Organisation.
[0022] 15. Wood，N，Bidwell，J. (1996)Genetic screening and testing by induced heteroduplex formation. Electrophoresisl7:247-254.
[0023] 16. Wood, Nj Standenj GRj Bowen, DJj Cummingj A, Lush, Cj Lee, Rj Bidwellj J. (1996) UHG-based mutation screening in type2B von Willebrandi s disease:-A_detection of a candidate mutation Ser547Phe. Thrombosis&Haemostasis75:363-367.
[0024] 17. Savage，DA，Tang，JP，Wood，NAP，Evans，J，Bidwell，几，Wee，JLK，Oei，AA，Hui ，KM(1996)A rapid HLA_DRBl*04subtyping method using PCR and DNA heteroduplex generators. Tissue Antigens47:284-292.
[0025] 18. Jack, Dj Bidwellj Jj Turner, Mj Wood, N. (1997) Simultaneous genotyping for all three known structural mutations in the human mannan-binding lectin gene. Human Mutation9:41-46.
[0026] 19. Culpan，D，Standen，GR，Wood，N，Mazurier，C，Gaucher，C，Bidwell，几（1997) Rapid mutation screening in Type2A von Willebrandi s disease using universal heteroduplex generators. Brit J Haematol96:464-469.
[0027] 20.Bowen, Djet al (1997)Genetic diagnosis of Factor V Leiden using heteroduplex technology. Thrombosis and Haemostasis77:119-122.
[0028] 21. Jackson, HAj Bowen, DJj Worwoodj M(1997)Rapid genetic screening for haemochromatosis using heteroduplex technology. Br J Haematol98:856-859.
[0029] 22. Tyfieldj LA, Stephenson, A, Cockburnj Fj Harviej A, Bidwellj JLj Wood, NAP, PiI z，DT，Harper，P，Smith，I(1997)Sequence variation at the phenylalanine hydroxylase gene in the British Isles. Am J Hum Genet60:388-396.
[0030] 23. Enayat，MS，Theophilus，BDM，Hill，FGH，Rose，PElCulpan，D，Bidwell，J，Sta nden, GR(1998)A new candidate mutation(K755E)causing Type2A Von Willebrandi s disease identified by UHG analysis. Br J Haematol79:240.
[0031] 24. Culpanj Dj Goodevej A, Bowen, DJj Standenj Gj Bi dwell, J (1988) Rapid genotypic diagnosis of type2A von Willebrandi s disease by heteroduplex analysis. Clin. Lab. Haem20:177-178.
[0032] 25. Bowen, DJj Standenj GRj Mazurierj Cj Gaucher, Cj Cummingj A, Keeney, Sj Bidwel I, J(1998)Type2N von Willebrand disease:rapid genetic diagnosis of G2811A(R854Q )，C2696T(R8IOT), T27OlA(H8I7Q) and G2823T (C858F)-detection of a novel candidate type2N mutation:C2801T(R854W). Thromb Haemost80:32-36.
[0033] 26. Morse, HR, Olomolaiyej OOj Wood, NAP, Keen, LJ and Bidwellj JL (1999) Induced heteroduplex genotyping of TNFa，IL_Ib，IL_6and IL-IOpolymorphisms associated with transcriptional regulation.Cytokinell:789-795.
[0034] 27. Wood，NAP，Thompson，SC, Smith，RM，Bidwe 11，几（2000) Identif ication of human TGF-blsignal (leader)sequence polymorphisms by PCR-RFLP. J Immunol Methods234:117-122.
[0035] 28. Bidwellj JLj Olomolaiyej 00, Keen, LJj Wood, NAP, Morse, HR, Laundyj GJj Thom pson, SJ(2000)Cytokine gene polymorphism. In:Human Blood Cells:Consequences of Genetic Polymorphism(Ed. King，M-J)，pp375_400. Imperial College Press，London.
[0036] 29. Wood，NAP，Keen，LJ，Tilley，LA, Bidwel 1，几（2001) Determination of cytokine regulatory haplotypes by induced heteroduplex analysis of DNA. J Immunol Meth249:191-198.
[0037] 30. Spink，CF，Keen，LJ，Middleton，PG，Bidwel 1，几（2004) Discrimination of suballeles present at the TNFd microsatellite locus using Induced Heteroduplex Analysis. Genes and Immunity5:76-79.
[0038] 31. Smith AJP，Keen LJ，Wood NAP，Elson CJ，Bidwell 几（2004) Haplotype analysis of ILIA,ILlBj ILlRN and ILlRlpromoter SNPs. In:HLA2002. Blackwell Munksgaardj Denmark.
[0039] 32.PhD thesis of NAP Wood dated Novemberl995entitled"An Investigation of the Potential of Universal Heteroduplex Generators in Identification of Point Mutations Within DNA"，held in the library of the University of Bristol.
[0040] W0-A-93/19201和GB-A-2338062也涉及利用IHG技术进行的基因型分型。
[0041] 上述专利文件及其它参考文献在此作为参考被引用以用于任何目的。
[0042] 然而，应当注意：在本PCT专利申请的每个指定国中，上述专利文件及其它参考文 献的内容并不一定是现有技术，因为现有技术状态是根据本国法律来进行判断的。因此，本 文所引用的任何特定文件，对于目前该申请所包含的任何权利要求，或者通过将来的修正 来引入的、或在任何后续申请或分案申请所包含或引入的、或在以该PCT专利申请为基础 所提交的任何其它相应申请或进一步申请中所包含的或被引入的任何权利要求，都不认为 是现有技术。
[0043] 虽然利用IHG进行基因型分型简单易用，并且操作快速可靠，但仍期望能改进异 源双链条带的分辨（resolution)，以便更容易地辨别等位基因特征性图谱。这将有助于，例 如，缩短凝胶电泳时间。
[0044] 发明概沭
[0045] 根据本发明，已经发现通过修饰IHG分子，以便使识别标记自与待进行基因型分 型的多态性位点直接相邻的位置间隔开，可改善异源双链条带的分辨。出乎意料地发现，当 使用这种修饰的IHG分子时，可显著改善诱导型异源双链的分辨。
[0046] 因此，根据本发明的第一个方面，提供了一种IHG，其是包含至少一个对应于基因 组DNA序列中的已知多态性位点的核苷酸位置的合成DNA序列，其特征在于：相对于所述 基因组序列而言，所述合成DNA序列在与所述对应于已知多态性位点的核苷酸位置间隔至 少一个碱基的距离的核苷酸位置处包含至少一个核苷酸替换、缺失和/或插入（本文称为： "识别标记"），且其中位于所述对应于多态性位点的核苷酸位置与所述核苷酸替换、缺失和 /或插入之间的核苷酸相对于所述基因组序列而言是未改变的，并且其中在所述基因组序 列包含多个已知的多态性位点的情况下，识别标记与对应于每一个已知的多态性位点的核 苷酸位置间隔至少一个碱基的距离。
[0047] 根据本发明的IHG分子优选适合用于在基因组DNA的已知的多态性位点上检测一 个或多个已知多态性（例如：遗传突变），更具体地是适合用于IHG检测方法，其中就分辨 异源双链的步骤（例如通过电泳）之后的条带分离而言，上述的IHG检测方法与其中IHG 识别标记不与对应于所述已知的多态性位点的所述核苷酸位置间隔开的相应方法比较，可 显著改善诱导型异源双链的分辨。
[0048] 应当理解：本文所用的术语"已知的多态性位点"具体涉及利用IHG分子进行具体 研究的多态性位点。基因组（野生型）DNA序列中的多态性位点是该DNA序列中相应于基 因的已知等位基因变体中的遗传改变的位点的位置。这种遗传改变的位点可以是单碱基取 代、插入或缺失，或连续的两个或多个取代、插入、添加或其组合。
[0049] 应当理解：本文所用的用语"核苷酸位置"在其范围内包括核苷酸序列的任何相关 的基因座，根据情况的需要，比如，举例来说，核苷酸序列的区域，核苷酸序列的区域被缺失 的基因座，在核苷酸序列的区域之间的点，以及核苷酸序列的个别碱基。
[0050] 举例来说，在多态性位点包含位于等位基因变体中的单碱基改变的情况下，IHG包 含对应于该多态性位点的单核苷酸位置，而IHG分子中的识别标记从该核苷酸位置被移开 至少一个碱基。在多态性位点包含连续三个碱基改变的情况下，IHG包含对应于所述多态 性位点的三个连续核苷酸位置，并且IHG分子中的识别标记从这组三个核苷酸位置被移开 至少一个碱基。
[0051] 在另一个实例中，在多态性位点包含位于等位基因变体中的单碱基缺失的情况 下，IHG包含对应于所述多态性位点的单核苷酸位置，并且IHG分子中的识别标记从该核苷 酸位置被移开至少一个碱基。在多态性位点包含三个连续碱基缺失的情况下，IHG可包含 对应于该多态性位点的三个连续核苷酸位置，并且IHG分子中的识别标记从这组三个核苷 酸位置的序列中被移开至少一个碱基。
[0052] 在更进一步的实例中，在多态性位点包含位于等位基因变体中的单碱基插入的情 况下，IHG包含跨越所述多态性位点的一对核苷酸位置，并且IHG分子中的识别标记从这些 核苷酸位置被移开至少一个碱基。在多态性位点包含三个连续碱基插入的情况下，IHG可 包含跨越该多态性位点的五个核苷酸位置，并且IHG分子中的识别标记从这组三个核苷酸 位置被移开至少一个碱基。
[0053] 多态性位点可包含连续取代、插入或缺失的组合。在所有情况下，识别标记与对应 于所述多态性位点的连续元件的该组核苷酸位置间隔至少一个碱基。
[0054] 根据本发明的第二个方面，提供了用于在靶基因序列及其相对应的IHG分子之间 形成诱导型异源双链的方法，所述方法包含：
[0055] (a)提供IHG分子群体；
[0056] (b)提供靶基因序列群体；以及
[0057] (c)在适于形成异源双链的条件下将（a)和（b)的相应群体进行组合；
[0058] 其中IHG分子符合本发明的第一个方面。
[0059] 可通过扩增IHG和靶基因序列来获得IHG分子和靶基因序列的群体。一种众所周 知的适宜扩增方法是PCR。
[0060] 在本发明的方法方面，可在适当的支持物上分辨诱导型异源双链（例如通过电 泳），然后分析来确定靶基因序列的基因型。与其中IHG识别标记不与对应于已知多态性位 点的核苷酸位置间隔开的相应方法比较，根据本发明所形成的诱导型异源双链的分辨，特 别是例如通过电泳分离异源双链的步骤之后的条带的分离，是改善的、优选是显著改善的。
[0061] 根据本发明的第三个方面，提供本发明第一个方面的IHG分子用于改善诱导型异 源双链在合适支持物上（例如通过电泳）的分辨的用途，与其中IHG识别标记不与对应于 已知多态性位点的核苷酸位置间隔开的相应方法比较，本发明可改善所述分辨。分辨改善 可以是异源双链所对应的条带在支持物上的分离得到改善。
[0062] 因此本发明的方法可用来预测人类对象将易感于与设计的IHG所针对的多态性 有关的特定遗传学状况或病症的可能性。因此，在另一个方面，本发明涉及用于预测与特 定基因型有关的特定状况或病症的存在、不存在、存在或不存在的可能性、或其严重度的方 法。在这种方法中，可从个体获得核酸样品，并且必要时，可研究多态性位点的特性直至所 需要的理解水平。通常这要求一个特定碱基或碱基序列的存在或不存在可与特定的遗传病 症或状况有关。然后可以基因组DNA序列中多态性位点的知识为基础来构建本发明的第一 个方面的IHG。使用这种IHG，实施根据本发明第二个方面的方法，和/或使用根据本发明 的第三个方面的IHG，并且对所分辨的诱导型异源双链进行分析来预测个体中特定状况或 病症的的存在、不存在、存在或不存在的可能性、或其严重度。
[0063] 根据本发明的第四个方面，提供了一种试剂盒，其包含根据本发明第一个方面的 IHG、适于IHG的正向和反向引物，并任选地包含对照DNA序列与使用说明书。
[0064] 附图简沭
[0065] 提供的附图仅仅用于解释说明，而不是用于限制本发明的范围。
[0066] 图1举例说明：使用现有技术中的IHG (IHGO)和本发明的IHG (IHGl、IHG2和 IHG3)，对IL-10基因的启动子的"-1082〃多态性进行基因型分型中所得到的异源双链图。
[0067] 图2举例说明：使用现有技术中的IHG(IHGO)和本发明的IHG(IHG1和IHG2)，对 肿瘤坏死因子（TNF)基因的启动子的"-238"多态性进行基因型分型的异源双链图。
[0068] 发明详沭
[0069] 根据本发明，相对于基因组序列而言，合成DNA序列在与对应于已知多态性位点 的核苷酸位置间隔至少一个碱基的距离的核苷酸位置处包含至少一个核苷酸替换、缺失和 /或插入，且其中位于所述对应于多态性位点的核苷酸位置与所述核苷酸替换、缺失和/或 插入之间的核苷酸相对于所述基因组序列而言是未改变的。在基因组序列包含多个已知的 多态性位点的情况下，识别标记与对应于每一个已知的多态性位点的核苷酸位置间隔至少 一个碱基的距离。
[0070] 核苷酸取代、缺失和/或添加距离对应于已知多态性位点的核苷酸位置的间隔优 选最多达约十个碱基，更优选最多达约八个碱基，例如从1到约6个碱基，最优选选自1、2、 3、4、5或6中任何数目的碱基。当有两个或更多个已知的多态性位点时，优选最多达10个 碱基的间隔涉及的是与识别标记最接近的多态性位点。
[0071] 根据本发明的一个【具体实施方式】，通过分析受试者，通常是受试人的遗传物质来 确定其基因的特定位点上的特定单核苷酸多态性（SNP)相关的基因型。包含SNP的基因至 少具有两个等位基因，其在本文中指作为参照等位基因和等位基因变体。已经任意指定了 参照的等位基因（原型或野生型等位基因），它通常对应于保藏于GenBank或TIGR的具有 给定登录号的基因的核苷酸序列。等位基因变体在基因中的SNP位点或多个SNP位点中每 一个含有核苷酸变体（即：与参照等位基因的相应位点不同的核苷酸）。
[0072] 在使用IHG技术进行基因型分型中，从受试者处获得核酸样品，扩增含有多态性 位点的基因节段来提供携带基因节段序列的扩增子群体。一般地，使用位于所述基因节段 两侧翼区的引物对，通过PCR实施扩增该基因节段。选择适合的引物，这些引物对所研究的 基因节段具有特异性。选择引物来扩增长度在大约90到400个碱基的基因节段，优选长度 是大约100到150个碱基对。一般优选多态性位点位于基因节段的中心区域，即大约在基 因节段的中间三分之一区域。众所周知，基因节段的PCR扩增将产生双链扩增子群体。可 在TO93/19201中得到用于PCR扩增的方法的更多细节。
[0073] 当检测的核酸是哺乳动物基因组DNA时，从个体或其它希望研究的具有特定特征 的基因型的对象处获得DNA的样品。（术语"个体"意指包括胎儿。）可从所有有核细胞 中提取DNA。一般地，为了方便，从外周血液细胞中获得DNA。可从胎盘细胞或羊水中获得 胎儿DNA。DNA的其它来源包括毛囊、干尸等。可通过任何适当的方法分离DNA，例如通过 Miller 等人所描述的快速盐析法（Miller，S.，Dykes，D.和 Polesky, H. (1988) 〃A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells" ；Nucl.Acids Res. 16:1215)。另夕卜，可以mRNA反转录成的cDNA的形式来分离DNA。
[0074] 也提供了 IHG分子群体，其具有对应于所述基因节段的、但被修饰的序列，如此处 所述修饰引入了受控的核苷酸取代、缺失、添加或其组合。一般地，通过扩增例如使用PCR， 来制备IHG组。再者，可在W093/19201中得到用于PCR扩增的方法的更多细节。选择用于 PCR的引物来扩增IHG分子。PCR扩增将产生双链IHG扩增子群体。IHG优选在长度上与所 考虑的基因节段基本上相同（不考虑IHG的任何必要的插入或缺失的碱基），或可能是不 同的长度，例如比基因节段更短或更长。然而，如果基因节段和IHG具有不同的长度（不考 虑IHG的任何必要的插入或缺失的碱基），则必须在基因节段和IHG的扩增群体之间有足够 的重叠度以允许形成异源双链。分别用于扩增IHG和基因节段的引物可以是相同的或不同 的。但是，一般地使用相同的引物，可得到具有基本上相同长度的扩增IHG和基因节段（不 考虑IHG的任何必要的插入或缺失的碱基）。如在W093/19201中所教导的，可标记引物。
[0075] 可在相同的或分开的小管中完成基因节段和IHG的PCR扩增（分别是"混合的"或 "分开的"PCR)。优选分开地进行扩增，然后把基因节段和IHG的扩增群体组合或集中以便 使异源双链的形成得以进行。
[0076] 例如在W0-A-93/19201中所述，首先加热IHG和基因节段的组合群体以便将双链 DNA分开成单链DNA，然后冷却来允许异源双链形成，从而完成在IHG和包含多态性位点的 基因节段的组合之间的异源双链的形成。
[0077] 根据影响它们表观分子量而不是其实际分子量的分子构象来分离形成的异源双 链。这可能通过例如电泳来实现。一般在不会完全变性核酸的凝胶中进行分离，例如非变 性聚丙烯酰胺凝胶。在实现所需的异源双链的分辨程度的条件下进行电泳。分离"表观尺 寸"（由其不同分子构象所引起）的差异小至大约IObp双链的分辨程度通常是足够的。也 可在凝胶中电泳分子量标记物（size marker)来用于评估泳动性并从而评估双链的表观尺 寸。另外，或可替代性地，还可以利用PCR来分开扩增具有与所研究基因的已知等位基因相 对应的序列的对照DNA分子，并使之与所使用的IHG形成异源双链，然后在凝胶中电泳所得 的样品以便在凝胶上为所产生的不同异源双链来提供标记物。
[0078] 异源双链的分布，即其分辨图谱是等位基因特异性的。然后可显示该分辨图谱或 PCR指纹。在PCR引物已经被标记的情况下，可显示该标记。将携带分离的标记双链的底物 与检测标记存在的试剂相接触。在未标记PCR引物的情况下，将携带PCR指纹的底物与例 如溴化乙锭或SYBR?绿（购自Molecular Probe)相接触，并在紫外光下显示核酸片段；或 者，可用银染法来显示异源双链。
[0079] 以上论述对以本领域众所周知的方式如何发展利用IHG技术进行基因型分型的 技术进行了一般概括。通过提供修饰的IHG分子，本发明提供了对现有技术的改进，其中所 述IHG分子中的所谓的"识别标记"被从对应于所研究的多态性位点的位置移开。如上所 述，对IHG的DNA序列进行修饰，从而在与对应于已知多态性位点的核苷酸位置间隔至少一 个碱基的距离的核苷酸位置处，引入至少一个核苷酸的取代、缺失和/或插入，而在所述对 应于多态性位点的核苷酸位置与所述核苷酸取代、缺失和/或插入之间的位置上的核苷酸 则相对于所述基因组序列而言是未改变的。
[0080] 所提供的IHG分子可以是双链或单链DNA分子。如果该分子长度小于大约150bp， 优选使用单链DNA。在下面的论述中，术语"碱基"和"碱基对"都被使用；它们并未严格地 仅指IHG的单链或双链形式之一，而是以适当的已知修饰形式适用于两种中的任一形式。 在根据本发明的方法中，使用例如PCR来扩增初始分子。按照惯例，和如此处所使用的，指 的是IHG的"编码"链的序列。在IHG中，"编码"链对应于基因组DNA的编码链，其中设计 IHG来模拟所述基因组DNA。"对应"意指除了能引起有意错配、并因此导致形成诱导型异源 双链的有意的缺失、取代和/或添加以外，IHG具有基因组DNA序列，而所设计的IHG用来有 效模拟所述基因组DNA序列。特别需要注意的是：在研究区域外，IHG序列与基因组DNA的 序列之间的精确杂交一致性对于实施本发明而言并不重要，本发明也不因此受到限制。如 果在IHG和基因组DNA之间的相应序列之间存在变异，则仍可获得可行的系统。实际上，在 某些情况下，期望在IHG和基因组DNA之间构建的有意错配，例如在分辨所得的异源双链中 产生特定期望的效果。当然，这种有意的错配不会大到阻止有效杂交来形成异源双链。
[0081] 在IHG中，在对应于多态性位点的位置上的核苷酸，可能与野生型基因组DNA的核 苷酸相同，或与等位基因变体的核苷酸相同。
[0082] 本发明可适合于在给定基因节段中探查多于一个的多态性位点。因此，例如当基 因节段包含两个或多个彼此相对接近的多态性位点时（例如彼此在大约300碱基对之内）， 可设计IHG来鉴定不同的等位基因的组合，并因此包含相应于每个多态性位点的"识别标 记"序列。在IHG包含两个或多个构建了有意错配的位点的情况下，异源双链条带的可能模 式的数目将增加，但是理论上，通过利用适当的对照数据可分析和解释任何等位基因组合 的条带模式。
[0083] 当识别标记是碱基对缺失，并且设计IHG以引入单个错配位点时，该缺失可能是 与基因组DNA序列相关的单个缺失或一连串碱基对缺失。一般地，缺失DNA的长度从1到 大约10个碱基对,例如从大约2到大约6个碱基对。
[0084] 当识别标记是碱基对取代，并且设计IHG以引入单个错配位点时，该取代可能是 与基因组DNA序列相关的单个取代或一连串碱基对取代。一般地，取代DNA的长度从1到 大约10个碱基对,例如从大约2到大约6个碱基对。
[0085] 当识别标记是碱基对插入，并且设计IHG以引入单个错配位点时，该插入可能是 与基因组DNA序列相关的单个插入或一连串碱基对插入。一般地，插入DNA的长度从1到 大约10个碱基对,例如从大约2到大约6个碱基对。
[0086] 当IHG包含两个或多个错配位点时，每个识别标记长度至少是一个碱基对，一般 地在1到大约5个碱基对之间，例如在长度上大约2或3个碱基对。在两个或多个识别标 记中间缺失、取代或插入的组合长度可达到基因组靶总长度的10%，一般是基因组靶总长 度的3%。
[0087] 识别标记也可由相对于基因组序列的缺失、取代或插入的组合所组成。
[0088] 目前，优选修饰是碱基对插入。优选的插入物是相同的碱基序列，例如一连串A或 G核苷酸，最优选一连串A核苷酸。但是，插入物可以是不同碱基的组合。
[0089] 可通过现有技术中众所周知的方法来人工合成本发明的IHG分子，例如参见 W093/19201 中所述。
[0090] 本发明的实施方式
[0091] 实施例1
[0092] 本实施例举例说明了本发明在检测IL-10基因中的-1082多态性中的应用。
[0093] 如下所示为用于-1082多态性PCR的引物序列：
[0094] 正向引物：AATCCAAGACAACACTACTAAGGC
[0095] 反向引物：CTGGATAGGAGGTCCCTTAC
[0096] 依照现有技术合成了具有如下序列的第一个IHG(IHGO):
[0097] IHGO
[0098] AATCCAAGACAACACTACTAAGGCTTGTTTGGGAGA^AAAAGGGGAAGTAGGGATAGGTAAGAGGAAAG TAAGGGACCTCCTATCCAG
[0099] 用粗体和星号（*)所指示的"A"残基是多态性的位点。下划线强调的四个"A"残 基串表示插入残基的序列，其当作"识别标记"。
[0100] 也合成了依照本发明的IHG分子，如下：
[0101] IHGl
[0102] AATCCAAGACAACACTACTAAGGCTTGTTTGGGAGA*GAAAAGGGAAGTAGGGATAGGTAAGAGGAAAG TAAGGGACCTCCTATCCAG
[0103] IHG2
[0104] AATCCAAGACAACACTACTAAGGCTTGTTTGGGAGA*GGAAAAGGAAGTAGGGATAGGTAAGAGGAAAG TAAGGGACCTCCTATCCAG
[0105] IHG3
[0106] AATCCAAGACAACACTACTAAGGCTTGTTTGGGAGA^GGGAAAAGAAGTAGGGATAGGTAAGAGGAAAG TAAGGGACCTCCTATCCAG
[0107] 除了四个识别性"A"残基的序列已经分别从多态性位点移开了 1、2或3个碱基 (向右，如图所示）之外，IHGl、IHG2和IHG3具有与IHGO相同的序列。
[0108] 在20 μ 1总反应体积中进行PCR扩增，其包含IOOng基因组DNA或IHG、0. 5U Taq 聚合酶（Advanced Biotechnologies)、5yM 的各种引物（正向和反向的）、1.5mM MgCl2、 200 μ M 的各种 dNTP、67mM Tris-HCl (ρΗ8· 8)、16mM(NH4)2SO4和 0· 01% Tween。在MJ-PTC-100 热循环仪（GRI，Braintree, UK)上进行PCR优化。基因组DNA和IHG的PCR参数如下：在 95°C预变性5分钟，随后32个循环的95°C下30秒钟、55°C下1分钟、72°C下30秒钟，再在 72 °C下最终延伸5分钟。
[0109] 组合并杂交配对PCR产物。
[0110] 杂交配对的参数是：95°C下2分钟，随后初始控制冷却步骤到65°C (温度变化速 率=I. (TC /s)，并保持1分钟。加入第二个控制冷却步骤至45°C (温度变化速率=0. 1°C / s)，并保持1分钟，最后的保温步骤在6 °C。
[0111] 在 15% 的非变性 PlOtOge丨k 聚丙烯酰胺凝胶（National Diagnostics, Hull,英 国）中利用"三倍宽（triple wide)" 微型胶系统（30cmX 8cm ;CBS Scientific Company， Del Mar，美国）来分辨异源双链，其中凝胶组成为37. 5:1 (w/v丙烯酰胺：双丙烯酰胺）。 在300V下电泳90分钟。用含0.5 μ g/ml溴化乙锭的IXTris硼酸盐EDTA(TBE)缓冲液 对凝胶进行后染色（post-stain)，并使用302nm UV透视仪进行检测。使用EDAS120系统 (Kodak)得到分析用的图象。
[0112] 获得的结果如图1所示。可见，当将识别标记从多态性位点移开后（而非与多态 性位点直接相邻）（即IHGUIHG2和IHG3)，异源双链条带的分离得到了改善。通过聚丙烯 酰胺凝胶产生了异源双链条带的更大的分离，这使得能够在缩短的凝胶电泳时间内鉴定等 位基因，因为等位基因的特异性图谱更易于辨别。在本实验中，IHG2获得了条带的最适分 离和等位基因特异性图谱的最适辨别。
[0113] 实施例2
[0114] 本实施例举例说明了本发明在检测肿瘤坏死因子（TNF)基因启动子-238多态性 中的应用。使用下列引物和IHG分子来进行实施例1相同的实验步骤：
[0115] TNF 左侧引物：GTTCAGCCTCCAGGGTCCTACACA
[0116] TNF 右侧引物：GGGAITTGGAAAGTTGGGGACACA
[0117] IHGO
[0118] GTTCAGCCTCCAGGGTCCTACACACAAATCAGTCAGTGGCCCAGAAGACCCCCCTCAGAATCG*AAAAG AGCAGGGAGGATGGGGAGTGTGAGGGGTATCCTTGATGCTTGTGTGTCCCCAACTTTCCAAATCCC
[0119] 用粗体和由星号（*)所指示的〃G〃残基是TNF中-238SNP的位点。下划线强调的 四个"A"残基列表示插入残基的序列，其当作"识别标记"。
[0120] 还合成了如下的本发明的IHG分子：
[0121] IHGl
[0122] GTTCAGCCTCCAGGGTCCTACACACAAATCAGTCAGTGGCCCAGAAGACCCCCCTCAGAATCG*GAAAA AGCAGGGAGGATGGGGAGTGTGAGGGGTATCCTTGATGCTTGTGTGTCCCCAACTTTCCAAATCCC
[0123] IHG2
[0124] GTTCAGCCTCCAGGGTCCTACACACAAATCAGTCAGTGGCCCAGAAGACCCCCCTCAGAATCG*GAGAA AACAGGGAGGATGGGGAGTGTGAGGGGTATCCTTGATGCTTGTGTGTCCCCAACTTTCCAAATCCC
[0125] 除了四个识别性"A"残基的序列已经分别从多态性位点移开了 2或3个碱基（向 右，如图所示）以外，IHGl和IHG2具有与IHGO相同的序列。
[0126] 杂交配对的参数是：95°C下2分钟，随后初始控制冷却步骤到65°C (温度变化速 率=I. (TC /s)，并保持1分钟。在45°C插入第二个控制冷却步骤（温度变化速率=0. 1°C / s)，并保持1分钟，最后的保温步骤在6 °C。
[0127] 图2显示了使用三个不同IHG试剂的两个基因组DNA样品杂交配对的结果，一个 是GG变体，另一个是GA变体。显示了在该基因座的三个可能基因型中的两个。泳道1和 泳道2显示两个基因组DNA样品与IHGO杂交配对的结果一该IHG试剂具有由与多态性位 点直接相邻的4个"A"残基所组成的识别标记。当相同的两个基因组DNA样品与IHGl和 IHG2杂交配对（具有分别位于与多态性位点距离2和3个碱基位置的识别标记）时，泳道 2-3和泳道4-5显示了所获得的异源双链带型。结果显示将识别性"A〃残基移到距离多态 性位点2个碱基处，具有有益的效果，与跟IHGO杂交配对相比，更容易辨别跟IHGl杂交配 对所获得的等位基因-特异性的带型。当将识别标记移到距离多态性位点3个碱基处时， 未发现条带的分离得到进一步的增加。在该情况下，以IHGl获得了最佳分离。
[0128] 上述内容概括地描述了本发明，而非进行限制。对于本领域普通技术人员来说是 显而易见的变化和修饰，都包含在本申请和后续专利的范围中。
【权利要求】
1. 一种IHG，其是包含至少一个对应于基因组DNA序列中的已知多态性位点的核苷酸 位置的合成DNA序列，其特征在于：相对于所述基因组序列而言，所述合成DNA序列在与所 述对应于已知多态性位点的核苷酸位置间隔至少一个碱基的距离的核苷酸位置处包含至 少一个核苷酸替换、缺失和/或插入，且其中位于所述对应于多态性位点的核苷酸位置与 所述核苷酸替换、缺失和/或插入之间的核苷酸相对于所述基因组序列而言是未改变的。
2. 根据权利要求1中所述的IHG，其中在基因组DNA序列中的多态性位点是单核苷酸 多态性（SNP)。
3. 根据权利要求1或2中所述的IHG，其中相对于所述基因组序列而言，所述合成DNA 中所包含的至少一个核苷酸取代、缺失和/或插入包括一个或多个碱基的插入。
4. 根据权利要求3中所述的IHG，其中相对于所述基因组序列而言，所述合成DNA中所 包含的至少一个核苷酸取代、缺失和/或插入由一个或多个碱基的插入组成。
5. 根据权利要求3或4中所述的IHG，其中插入是一连串相同的碱基的插入。
6. 根据权利要求5中所述的IHG，其中所述相同的碱基是A核苷酸。
7. 根据权利要求6中所述的IHG，其中所述相同的碱基是G核苷酸。
8. 根据权利要求1或2中所述的IHG，其中相对于所述基因组序列而言，所述合成DNA 中所包含的至少一个核苷酸取代、缺失和/或插入包括一个或多个碱基的缺失。
9. 根据权利要求8中所述的IHG，其中相对于所述基因组序列而言，所述合成DNA中所 包含的至少一个核苷酸取代、缺失和/或插入由一个或多个碱基的缺失组成。
10. 根据前述权利要求中任何一项所述的IHG，其中所述合成DNA序列是单链的。
11. 根据权利要求1到9中任何一项所述的IHG，其中所述合成DNA序列是双链的。
12. 根据前述权利要求中任何一项所述的IHG，其中在不考虑IHG中的任何插入或缺失 的碱基的情况下，所述合成DNA序列的长度与所研究的基因组DNA的基因节段基本上相同。
13. 根据权利要求1到11中任何一项所述的IHG，其中在不考虑IHG中的任何插入或 缺失的碱基的情况下，所述合成DNA序列的长度不同于所述研究的基因组DNA的基因节段 的长度。
14. 包含多个根据上述权利要求中任何一项所述的IHG的IHG群体。
15. 根据权利要求14中所述的IHG群体，其中群体是利用PCR扩增的产物。 16. DNA异源双链，其包含与包含所述已知多态性位点的基因组DNA杂交的权利要求1 到13中任何一项所述的IHG分子。
17. 根据权利要求16中所述的DNA异源双链的群体。
18. -种用于在靶基因序列和对应于所述靶基因序列的IHG分子之间形成诱导型异源 双链的方法，所述的方法包括： (a) 提供根据权利要求14或权利要求15中所述的IHG群体； (b) 提供所述靶基因序列群体；以及 (c) 在适于异源双链形成的条件下将（a)和（b)的相应群体进行组合。
19. 一种用于对靶基因序列进行基因型分型的方法，包括通过根据权利要求18中所述 的方法形成诱导型异源双链，在适当的支持物上分辨所述诱导型异源双链，并且分析所分 辨的诱导型异源双链来确定靶基因序列的基因型。
20. 根据权利要求19中所述的方法，其中利用电泳来进行诱导型异源双链的分辨。
21. -种预测生物体例如人或其它哺乳动物受试个体易感于与特定基因型相关的特定 遗传状况或病症的可能性的方法，该方法包含：根据权利要求19或权利要求20,对被认为 与遗传状况或病症有关的生物体靶基因序列进行基因型分型，并且分析基因型分型的结果 来预测生物体中所述特定状况或病症的存在或不存在、存在或不存在的可能性、或严重程 度。
22. 根据权利要求21的方法，其中在基因的特定位置上针对特定的单核苷酸多态性 (SNP)来进行基因型分型。
23. -种试剂盒，包含根据权利要求14或权利要求15中所述的IHG群体、和用于所述 IHG的正向和反向引物。
24. 根据权利要求23中所述的试剂盒，其还包含对照DNA序列和/或使用说明书。
25. 根据权利要求23或权利要求24中所述的试剂盒，用于根据权利要求19到22中任 何一项所述的方法。
26. -种用于对IL-10基因的启动子中的"-1082"多态性进行基因型分型的IHG，其具 有以下序列： AATCCAAGACAACACTACTAAGGCTTGTTTGGGAGAGAAAAGGGAAGTAGGGATAGGTAAGAGGAAAGTAAGG GACCTCCTATCCAG。
27. -种用于对IL-10基因的启动子中的"-1082"多态性进行基因型分型的IHG，其具 有以下序列： AATCCAAGACAACACTACTAAGGCTTGTTTGGGAGAGGAAAAGGAAGTAGGGATAGGTAAGAGGAAAGTAAGG GACCTCCTATCCAG。
28. -种用于对IL-10基因的启动子中的"-1082"多态性进行基因型分型的IHG，其具 有以下序列： AATCCAAGACAACACTACTAAGGCTTGTTTGGGAGAGGGAAAAGAAGTAGGGATAGGTAAGAGGAAAGTAAGG GACCTCCTATCCAG。
29. -种用于对肿瘤坏死因子基因中的"-238"多态性进行基因型分型的IHG，其具有 以下序列： GTTCAGCCTCCAGGGTCCTACACACAAATCAGTCAGTGGCCCAGAAGACCCCCCTCAGAATCGGAAAAAGCAG GGAGGATGGGGAGTGTGAGGGGTATCCTTGATGCTTGTGTGTCCCCAACTTTCCAAATCCC。
30. -种用于对肿瘤坏死因子基因中的"_238"多态性进行基因型分型的IHG，其具有 以下序列： GTTCAGCCTCCAGGGTCCTACACACAAATCAGTCAGTGGCCCAGAAGACCCCCCTCAGAATCGGAGAAAACAG GGAGGATGGGGAGTGTGAGGGGTATCCTTGATGCTTGTGTGTCCCCAACTTTCCAAATCCC。
31. -种基本上如实施例和附图所述的IHG或其群体。
32. -种基本上如实施例和附图所述的DNA异源双链或其群体。
33. -种基本上如实施例和附图所述的、用于在靶基因序列和对应于所述靶基因序列 的IHG分子之间形成诱导型异源双链的方法。
34. -种基本上如实施例和附图所述的、用于对靶基因序列进行基因型分型的方法。
35. -种基本上如实施例和附图所述的、预测生物体例如人或其它哺乳动物受试个体 对于与特定基因型相关的特定遗传状况或病症的易感性的方法。
【文档编号】C12Q1/68GK104293779SQ201410330731
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2005年10月10日 优先权日:2004年10月8日
【发明者】L·A·蒂利 申请人:Ihg法玛柯有限公司