一种PGC1-α基因DNA甲基化检测试剂及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物技术及医学领域，具体涉及一种PGC1-α基因DNA甲基化检测试剂及其应用。发明人发现并通过实验证明，PGC1-α基因中位点(+171)的甲基化是DR代谢记忆的早期诊断标志。本发明在上述研究基础上，制备了用于检测PGC1-α基因位点+171甲基化的检测试剂，并提供了相应的检测试剂盒。本发明提供的甲基化检测试剂，可以定性或定量的检测被测试对象PGC1-α基因位点+171是否发生了甲基化及甲基化程度，从而预测被测试对象是否有DR代谢记忆及患病风险，给临床实践以指导作用。
【专利说明】—种PGC1-a基因DNA甲基化检测试剂及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术及医学领域，具体涉及一种PGCl-α基因DNA甲基化检测试剂及其应用。
【背景技术】
[0002]过氧化物酶体增殖物激活受体Y辅助激活因子I a (peroxisomeproliferator-activated receptor y coactivatorl α , PGCl-α ),由 PPARGC1A 基因编码，是转录辅助激活因子PGCl家族中最出名的成员，也是近年来细胞及线粒体代谢研究的热点之一。PGCl-α —方面能增强线粒体的合成功能；另一方面能够减少线粒体代谢副产物的堆积，它可通过调控许多ROS清除酶的活性而减少ROS的毒性作用。因而，PGCl- α对整个线粒体代谢发挥了积极的调节作用。不仅如此，PGCl-α还具有能够促进脂肪代谢、减轻体重，能调控骨骼肌细胞中肌纤维类型的转换，能促进糖异生等代谢过程的重要作用。正因如此，PGCl-α已成为治疗糖尿病(Diabetes mellitus, DM)等代谢疾病的新靶点。研究发现，PGCl-α在DM患者的肌肉中表达是降低的，这可能与DM和胰岛素抵抗引起的代谢紊乱有关。胰岛中编码PGCl-α的基因PPARGC1A基因启动子区甲基化的增加可导致胰岛β细胞功能下降引起胰岛功能紊乱。但是，目前PGCl-a在糖尿病视网膜病变(Diabeticretinopathy, DR)及其代谢记忆中发挥的作用尚不明确,有待进一步研究。
[0003]DR是糖尿病最常见和最严重的眼部并发症，是工作年龄段人群最主要的致盲原因。目前全球DM患者人数高达3.47亿，近30%的DM患者有不同程度的DR，3730万DR患者的视力受到威胁。控制血糖是治疗DM及其并发症的关键。然而多个大型的临床研究发现，若早期血糖控制不佳，即使后续血糖控制达标，仍较早期血糖控制良好的患者更易发生DR等并发症，这种现象称之为“代谢记忆”(Metabolic memory, MM)。
[0004] 随着后基因组时代的到来，表观遗传学(Epigenetics)已成为生命学科的研究前沿。表观遗传学是针对遗传学而言的，是指研究DNA序列不发生改变的可遗传的基因表达变化的科学，它可以解释一些经典遗传学所不能解释的问题。目前表观遗传学研究主要集中DNA甲基化及组蛋白乙酰化上。DNA甲基化修饰是基因组表观遗传调控中主要的方式，人类肿瘤的发生、发展与DNA甲基化的异常有关，基因启动子区CpG岛高甲基化可导致抑癌基因表达沉默进而导致肿瘤发生。DNA甲基化是指在甲基化转移酶的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移到CG 二核苷酸胞嘧啶的5号碳原子上，形成5甲基胞嘧啶。DNA甲基化异常是细胞癌变过程中早期、频发事件，因此特异基因的甲基化可作为癌症早期诊断的分子标志物、治疗靶点和判断预后手段。
[0005]本发明研究了 PGCl-α及其表观遗传修饰在DR代谢记忆中的作用。研究在体外培养的视网膜微血管内皮细胞中PGCl-a和S0D2mRNA及蛋白的表达水平，分析高糖对PGCl-a和S0D2mRNA及蛋白表达的影响以及是否具有代谢记忆现象。同时检测编码PGCl- α的PPARGC1A基因启动子区CpG岛的甲基化状态，找到了一个与代谢记忆效应相关的甲基化位点。进一步的，本发明还根据该甲基化位点设计并合成了其甲基化检测引物并制备了适用于该甲基化位点的检测试剂盒，所述试剂盒可用于DR代谢记忆早期诊断，具有很好的临床应用价值。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于证实PGCl- α基因及其表观遗传修饰在DR代谢记忆中的作用。所述的对PGCl- α基因及其表观遗传修饰的检测可用于DR代谢记忆早期诊断。
[0007]本发明的另一个目的在于制备出PGCl-α基因甲基化检测试剂，所述检测试剂可用于DR代谢记忆的早期诊断、筛查和患病风险预测。
[0008]发明人发现并通过实验证明，PGCl-a基因的一个位点(+171位点，具体见序列表中SEQ ID N01，所述+171位点位于SEQ ID NOl第459个碱基处)在高糖引起的糖代谢记忆细胞中高度甲基化，而在正常对照中均处于非甲基化状态，提示PGCl-a基因中位点(+171)的甲基化是糖尿病代谢记忆的早期诊断标志。
[0009]本发明在上述研究基础上，提供一种检测试剂，采用所述的检测试剂组分中的一种或几种可以检测PGCl-a基因位点+171的甲基化程度。
[0010]进一步，所述的检测试剂包括DNA亚硫酸氢盐修饰试剂盒和PGCl-α基因位点+171甲基化检测试剂盒。
[0011]所述的PGCl-a基因位点+171甲基化检测可以是现有甲基化检测技术中任意一种能检测PGCl-α基因位点+171是否甲基化的检测方法。已知现有常用的CpG岛甲基化检测方法有甲基化敏感的限制性内切酶方法、NaHSO3法(Sodium bisulfite法)、芯片技术方法。NaHSO3法包括BSP测序法(BSP sequencing)、联合NaHSO3限制性分析法(COBRA)、甲基化特异性PCR (Methylat1n Specific PCR，MSP)、荧光定量法(Methylight)。芯片技术方法包括甲基化高密度芯片(CpG Islands microarray)、差异甲基化杂交(DifferentialMethylat1n Hybridizat1n, DMH)、甲基化特异性寡核苷酸芯片(methylat1n specificoligonucleotide microarray, MSO microarray)。
[0012]进一步，所述的PGCl-α基因位点+171甲基化检测试剂盒采用BSP测序法对PGCl-α基因位点+171甲基化进行检测。所述的试剂盒包括一对BSP检测引物。进一步，所述BSP检测引物采用序列表SEQ ID N02和SEQ ID N03。
[0013]所述BSP测序法基本原理是根据重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶(C)脱氨基转变成尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶保持不变。基因组DNA经亚硫酸盐处理后，设计BSP引物并扩增目的的片段，此时尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶，最后对PCR物进行测序就可判断CpG位点是否发生甲基化。
[0014]进一步，所述的PGCl-α基因位点+171甲基化检测试剂盒采用MSP测序法对PGCl-a基因位点+171甲基化进行检测。所述的试剂盒包括一对甲基化检测引物和一对非甲基化检测引物。进一步，所述甲基化检测引物采用序列表SEQ ID N04和SEQ ID N05 ;所述的非甲基化检测引物采用序列表SEQ ID N06和SEQ ID N07。所述的甲基化检测试剂盒还包括全甲基化基因组DNA阳性对照、非甲基化基因组DNA阴性对照以及PCR扩增体系所需的其他常用试剂，如dNTP、DNA聚合酶、缓冲液等。
[0015]所述甲基化特异PCR基本原理是指亚硫酸氢盐可以氧化去除基因组DNA中胞嘧啶的氨基，在此反应中除m5C外其余胞嘧啶均可被转变为尿嘧啶。然后将这些靶序列用特异引物进行扩增，经过扩增的DNA，所有尿嘧啶均转化为可检测的胸腺嘧啶，只有m5C以胞嘧啶形式被扩增。这种方法是目前所使用的在给定基因组靶序列中分析m5C最常用的方法。可以检测到每个CpG位点的甲基化情况。基于此原理，发展出亚硫酸氢盐去氨基反应后，结合PCR扩增的快速方法来检测m5C，称为甲基化特异PCR，MSP)，这种MSP方法运用，特别设计的针对甲基化的和非甲基化序列的引物，从而得到特异扩增的甲基化或非甲基化靶序列。目前已经被广泛应用到CpG岛甲基化检测。
[0016]本发明的另一个目的在于提供PGCl- α基因位点+171在制备一种DR代谢记忆诊断试剂中的应用。
[0017]进一步，所述的诊断试剂通过检测PGCl-α基因位点+171是否发生甲基化来确定被检测对象是否有DR代谢记忆。
[0018]本发明的优点:
[0019]本发明制备的PGCl-a基因位点+171甲基化检测试剂，可以定性或定量的检测被测试对象PGCl-α基因位点+171是否发生了甲基化及甲基化程度，从而预测被测试对象是否有DR代谢记忆及患病风险，能够做出早期、快速的诊断，给临床实践以指导作用。利用本发明引物、反应体系及其条件检测PGCl-a基因DNA甲基化其检测灵敏度高，可达5% ;操作简单、稳定性好。本发明为DR记忆代谢的早期诊断及防治提供了有力的技术支持，具有很好的临床应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1.各组HRMECs细胞活力；
[0021]图2.高糖对HRMEC中S0D2转录水平的影响；
[0022]图3.高糖对HRMEC中PGCl-a转录水平的影响；
[0023]图4.第I天时各组细胞S0D2和PGCl-a蛋白表达量灰度图；
[0024]图5.第7天时各组细胞S0D2和PGCl-a蛋白表达量灰度图；
[0025]图6.BSP-PCR产物鉴定图。
图7.PPARGC1A基因启动子区待测CpG位点示意图及编号
【具体实施方式】
[0026]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解:在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
[0027]实施例1实验分组
[0028]实验材料与试剂:
[0029]正常人视网膜微血管内皮细胞(Humanretinal microvascular endothelialcells, HRMECs, cAP-001OTM)，美国 Ang1-Proteomie 公司；内皮细胞基础培养基(ENDO-Basal medium), ScienCell ;胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS) ,ScienCell ;内皮细胞生长因子(Endothelial cell growth supplement, ECGS), ScienCell ;青霉素-链霉素双抗(Penicillin-Streptomycin), ScienCell ;牛血衆纤维粘连蛋白(Fibronectin, FN),ScienCell ;0.25%膜蛋白酶(Trypsin),Poputech ;D_ 葡萄糖(D-Glucose), Sigma ;D_ 甘露醇(D-Mannitol), Sigma。
[0030]将HRMECs根据干预处理因素分为5组，具体分组及处理方法见表1。
[0031]表1.实验分组及处理
[0032]
【权利要求】
1.一种PGCl-α基因DNA甲基化检测试剂，其特征在于，所述的甲基化检测试剂是针对PGCl-α基因位点+171的甲基化检测试剂，所述PGCl-α基因位点+171位于SEQ ID NOl第459个碱基处。
2.根据权利要求1所述的甲基化检测试剂，其特征在于，所述甲基化检测试剂包括DNA亚硫酸氢盐修饰试剂盒和PGCl- α基因甲基化检测试剂盒。
3.根据权利要求1所述的甲基化检测试剂，其特征在于，所述甲基化检测试剂包括采用下列方法中任意一种或几种的组合对PGCl-α基因位点+171的甲基化情况进行检测所需的试剂:甲基化敏感的限制性内切酶方法、NaHSO3法、芯片技术方法；所述NaHSO3法包括BSP测序法、联合NaHSO3限制性分析法、甲基化特异性PCR、荧光定量法；所述芯片技术方法包括甲基化高密度芯片、差异甲基化杂交、甲基化特异性寡核苷酸芯片。
4.根据权利要求2所述的甲基化检测试剂，其特征在于，所述甲基化检测试剂盒采用BSP测序法对PGCl-α基因位点+171甲基化进行检测。
5.根据权利要求2或4任意一项所述的甲基化检测试剂，其特征在于，所述的甲基化检测试剂盒包括一对BSP检测引物，所述检测引物序列为SEQ ID Ν02和SEQ ID Ν03所示。
6.根据权利要求2所述的甲基化检测试剂，其特征在于，所述甲基化检测试剂盒采用MSP测序法对PGCl-α基因位点+171甲基化进行检测。
7.根据权利要求2或6任意一项所述的甲基化检测试剂，其特征在于，所述的甲基化检测试剂盒包括一对甲基化检测引物和一对非甲基化检测引物，所述甲基化检测引物序列为SEQ ID Ν04和SEQ ID Ν 05所示，所述非甲基化检测引物序列为SEQ ID Ν06和SEQ ID Ν07所示。
8.PGCl-α基因位点+171在制备一种诊断试剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的诊断试剂通过检测PGCl-α基因位点+171发生甲基化程度来确定被检测对象是否有DR代谢记忆。
10.根据权利要求8或9任意一项所述的应用，其特征在于，采用权利要求1-7任意一项所述的检测试剂检测PGCl-α基因位点+171甲基化程度。
【文档编号】C12Q1/68GK104178565SQ201410334876
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年7月15日 优先权日:2014年7月15日
【发明者】张古沐阳, 陈有信, 马楠, 田蓉, 张辰茜, 张梦雨 申请人:陈有信