一种e2f3基因沉默对前列腺癌动物模型中全血e2f3影响的方法
【专利摘要】本发明公开了一种E2F3基因沉默对前列腺癌动物模型中全血E2F3影响的方法，通过免疫组化研究不同前列腺癌组织中E2F3的表达情况，明确E2F3与前列腺癌分级、分期及预后的关系；通过构建针对E2F3的AAV病毒载体，沉默E2F3基因并进行相关的外功能实验；通过建立裸鼠前列腺癌模型，成功应用AAV病毒载体进行体内实验并明确E2F3基因沉默前后裸鼠全血中E2F3mRNA表达情况。本发明的E2F3基因作为前列腺癌基因治疗的高效靶点，为后续的以E2F3为靶点的前列腺癌基因治疗体内实验奠定基础；针对E2F3的重组RNA干扰AAV病毒能够抑制肿瘤细胞的增殖并能够促进细胞的凋亡，并有效抑制动物模型肿瘤的生长并降低了外周血标本内E2F3的表达，为以E2F3为靶点的肿瘤基因沉默疗法提供了可靠的理论和实验基础。
【专利说明】—种E2F3基因沉默对前列腺癌动物模型中全血E2F3影响的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于E2F3基因【技术领域】，尤其涉及一种E2F3基因沉默对前列腺癌动物模型中全血E2F3影响的方法。
【背景技术】
[0002]前列腺癌是欧美最常见的男性恶性肿瘤之一，目前在美国前列腺癌的发病率已经超过肺癌，成为第一位危害男性健康的肿瘤，在我国，随着生活方式的改变、人口的老龄化及诊断技术的提高，前列腺癌的发病率也呈持续增长趋势，在北京及上海等现代化程度较高的城市，前列腺癌已经超过膀胱癌，成为最为常见的泌尿系统肿瘤。
[0003]肿瘤的发生、发展与细胞周期调节失控密切相关，细胞周期调控发生异常，使受损害的DNA得不到及时修复，细胞继续分裂，因遗传不稳定，可转变为癌细胞，E2F3是E2F转录因子家族成员之一，也是细胞周期调控过程中起重要作用的调控蛋白之一，其是细胞由Gl期进入S期最重要的细胞因子，调控着细胞增殖，E2F3联系着Cyclins、⑶Ks、Rb及细胞增殖等相关基因，这些基因在细胞周期不同阶段起作用，并且随着细胞的转变而发生变化，Maddiso等的研究表明，Rb的失活引起E2F表达增多，可引起早期前列腺癌，促进前列腺癌的发展进程和转移，Foste等应用免疫组化的方法研究发现前列腺癌组织中E2F3的表达率达到67%，而在良性前列腺组织中仅有2.3%细胞核表达E2F3，在正常人前列腺标本中无E2F3的表达，上述的研究结果表明，E2F3在前列腺癌的发病机制中处于非常重要的地位，而有效的沉默E2F3基因的表达为系统的研究E2F3与前列腺癌的关系奠定基础。
[0004]随着RNAi技术的出现，基因沉默技术在保持高效的基础上更为特异的沉默靶mRNA，从而使相应蛋白表达下降，因为RNAi技术通过抑制宿主细胞mRNA转录后的基因表达而发挥作用，利用RNAi技术进行抗肿瘤基因治疗有望成为癌症治疗的新的突破口，当前RNAi技术在疾病诊治中应用的困难主要集中在两方面，即靶目标的有效性以及siRNAs或shRNAs靶点转运的高效性，其一，靶目标的有效性是进行RNAi应用研究的重要前提，在设计siRNAs或shRNAs时，必须高度重视其靶向有效性的基础研究；尤其是当进入临床试验时，更应当注意其设计的有效性，以避免产生体内的非特异性反应或者更为严重的目前还尚未明了的潜在不良反应，其二，siRNAs或shRNAs靶点转运的高效性包括分子体内稳定性和穿透细胞膜所涉及到的转运问题，早期的RNAi多应用脂质体进行质粒载体或siRNA直接向细胞内转染，这种情况常常因为转染效率的低下而导致基因沉默效果不佳，AAV干扰载体的出现为更加高效的进行基因沉默奠定了基础。
[0005]AAV载体具有逆转录病毒和腺病毒的许多优点，并且与其它几种病毒相比，腺相关病毒载体具有安全性好、无致病性、免疫原性低、物理性质稳定、感染细胞谱广，可介导外源基因长期稳定表达等优点，被视为最有如途的基因治疗载体之一，成为目如基因治疗载体研究的热点，由于AAV载体的容量较大,在表达干扰序列的同时，还能够同时表达众多的蛋白，这为多靶点进行前列腺癌基因治疗提供便利，由于AAV病毒在人体具有良好的组织相容性，其已成为肿瘤基因治疗的高效载体而受到重视，既往的研究表明AAV载体能够高效的转染前列腺癌细胞系，但其在体内试验中AAV病毒载体是否能够有效的进行RNAi干扰序列的表达，是否能够有效的降低靶mRNA的表达，这就需要建立前列腺癌动物模型而得到验证。
[0006]动物实验是细胞实验和临床实验之间的重要过渡环节，简便而实用的动物实验模型在肿瘤的研究中具有十分重要的作用，由于具有种植方便、成瘤快、肿瘤生长一致性好、便于观察等特点，裸鼠皮下注射前列腺癌细胞制备移植瘤已经成为探索前列腺的发生、发展与转归机理的重要评价方法，但是由于前列腺癌细胞对于前列腺内的微环境及前列腺内的激素水平的影响非常敏感，这使得前列腺癌原位模型能够更为真是的反映实验效果，从而越来越多的实验研究采取前列腺癌原位模型进行体内实验研究，但前列腺癌原位模型在构建时非常复杂，常需要对裸鼠进行外科操作，这不仅降低了裸鼠的生存率，增加了各种术后并发症的危险，还一定程度上降低了成瘤的一致性，我研究所前列腺癌研究室已经掌握了 LNCaP细胞裸鼠前列腺前叶肿瘤原位模型构建技术，并且专人负责操作，尽量的降低了成瘤大小不一致及腹腔种植等的发生率，动物模型与细胞水平实验相比较，还具有一个显著的优势:实验动物的血液标本能够用来进行相关基因及蛋白的检测，这也便于一些肿瘤标记物更为便捷的应用于临床，血清PSA(前列腺特异抗原)检测的发展及其在临床中的广泛应用，明显的提高了前列腺癌的早期诊断率并提高了前列腺癌患者的5年生存率，但PSA存在一定的局限性，PSA在4-10ng/dl时，有近80 %的患者为前列腺良性疾病；而？3八小于4ng/dl时，有15%的患者却仍被检查前列腺癌，这就有可能导致一部分患者经受不必要的前列腺穿刺活检，而另外一部分患者病情延误，尽管对PSA界值、PSMA、PSA密度、PSA速率等的研究在一定程度上能够提高前列腺癌的诊断准确性，但临床急需更为准确的诊断指标，这对于前列腺癌的早期的诊断和预防、病程监测、探索对前列腺癌的治疗方法以及评估预后有着重要的意义。
[0007]Jean等的研究发现，前列腺癌患者的全血标本中，E2F3mRNA表达显著高于前列腺增生患者及正常人群，而通过我们的前期研究也发现E2F3蛋白的表达与前列腺癌的分期及分级密切相关，那么E2F3是否可以与PSA联合应用，成为诊断前列腺癌的新的分子标记物，弥补PSA的不足？上述的动物实验可以使我们在进行E2F3基因沉默前后测定动物全血中的E2F3基因mRNA的表达，从而进一步明确E2F3基因mRNA的表达在临床应用的潜力及价值。
【发明内容】
[0008]本发明实施例的目的在于提供一种E2F3基因沉默对前列腺癌动物模型中全血E2F3影响的方法，旨在为前列腺癌基因治疗的一个有效的祀点，为前列腺癌的诊断与治疗提供理论基础。
[0009]本发明实施例是这样实现的，一种E2F3基因沉默对前列腺癌动物模型中全血E2F3影响的方法，该E2F3基因沉默对前列腺癌动物模型中全血E2F3影响的方法包括:
[0010]步骤一，通过收集不同前列腺癌石蜡标本，采用real-timePCR、WESTERN、免疫组化，分析E2F3及其所调基因在前列腺癌中的表达情况；
[0011]步骤二，建立以AVV为载体的RNAi平台，并分析干扰序列对前列腺癌LNCaP细胞中E2F3基因沉默的影响；
[0012]步骤三，并经体外实验证实E2F3基因沉默对LNCaP细胞中E2F3及相关调控基因的影响及对细胞增殖及凋亡的影响；应用裸鼠进行原位前列腺癌动物模型的构建；
[0013]步骤四，应用AAV干扰载体进行肿瘤的局部注射后明确肿瘤组织中E2F3在mRNA及蛋白质水平的表达情况及对肿瘤生长抑制情况，最后应用实时定量PCR进行全血E2F3mRNA的检测，明确作为前列腺癌肿瘤标记物的可能性。
[0014]进一步，该E2F3基因沉默对前列腺癌动物模型中全血E2F3影响的方法具体包括以下步骤:
[0015]第一步，取不同临床分期、病理分级的前列腺癌石蜡切片组织进行免疫组化染色，在蛋白质水平研究E2F3及AR的表达情况及二者的表达与前列腺癌临床特点及预后之间的关系，根据Gleason分级和评分标准进行病理分级并根据Whitmore-Jewett系统进行临床分期；
[0016]第二步，合成三对针对于E2F3基因的SiRNA对应模版DNA序列，通过RT-PCR方法筛选出最为有效的干扰片段；根据筛选结果，将相应shRNA表达框克隆到腺相关病毒载体中，包装纯化病毒后，转染膀胱移行细胞癌肿瘤细胞株，检测病毒载体的长效基因沉默的效果，以及细胞增殖凋亡相关指标；
[0017]第三步，采用LNCaP细胞在裸鼠前列腺前页进行接种，建立原位前列腺癌动物模型。
[0018]进一步，取不同临床分期、病理分级的前列腺癌石蜡切片组织进行免疫组化染色，在蛋白质水平研究E2F3及AR的表达情况及二者的表达与前列腺癌临床特点及预后之间的关系；根据Gleason分级和评分标准进行病理分级并根据Whitmore-Jewett系统进行临床分期。
[0019]进一步，针对E2F3的AAV干扰穿梭质粒的构建及病毒的包装、浓缩与纯化包括以下步骤:
[0020]步骤一，对已制备的E2F3RNAi质粒载体进行双酶切，插入干扰片断后，将U6-RiE2F3序列PCR后克隆进T载体，然后亚克隆至pAAV-MCS ;酶切、PCR、测序验证载体构建成功并证明ITR的存在；
[0021]步骤二，待AAV-293细胞达到70% _80 %融合后，分别将干扰穿梭质粒与pRC、pHelper按照1:1:1浓度与细胞电转，24小时后收集细胞；
[0022]步骤三，采用氯仿处理-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提三个步骤分离、浓缩、纯化病毒；
[0023]步骤四，应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测病毒纯度；将纯化的病毒经钨酸盐染色后，置于150目的镍网上，扫描电镜观察。
[0024]进一步，含有干扰序列的rAAV对E2F3及相关调控基因表达影响的方法包括:
[0025]步骤一，对LNCaP细胞进行病毒转染，通过绿色荧光的观察、重组病毒载体与质粒载体在转化效率、沉默效率、细胞毒性；
[0026]步骤二，rAAV干扰载体对LNCaP细胞中E2F3及ARmRNA及蛋白质表达水平的影响；
[0027]步骤三，接种LNCaP细胞于24孔板中，待细胞80_90%融合，弃培养液，并向每孔中分别加入不同浓度的rAAV-U6-RiE2F3-GFP，分别提取总RNA和总蛋白，观察干扰效果，不同浓度及不同作用时间的rAAV-RiE2F3干扰载体对LNCaP细胞中E2F3沉默的影响及细胞杀伤作用；
[0028]步骤四，应用流式细胞术研究rAAV-U6-RiE2F3-GFP转染前后LNCaP细胞细胞周期及凋亡的变化情况。
[0029]进一步，裸鼠原位前列腺癌模型的建立包括以下步骤:
[0030]步骤一，将LNCaP细胞进行消化后浓度调整至I X 107个/ml，置于无菌Eppendorf管内，冰块上送到动物房中；
[0031]步骤二，裸鼠前列腺位置的确定:取仰卧位，75%酒精棉球消毒小鼠腹部及腹部以下皮肤，下腹正中切口，从两侧分离到精囊及输精管，沿着输精管向下游离至膀胱颈，暴露前列腺；选择该叶作为LNCaP细胞的种植位置；
[0032]步骤三，应用细胞悬液种植肿瘤细胞后定期观察裸鼠体重变化，并且进行成瘤情况的判定，应用免疫组化的方法验证前列腺癌动物模型的成功建立。
[0033]进一步，含有干扰序列的rAAV对E2F3及相关调控基因表达影响的方法包括:
[0034]步骤一，应用rAAV干扰载体进行肿瘤局部注射并于治疗后4周处死裸鼠，观察肿瘤大小及重量的变化；观察病毒作用后对裸鼠各个脏器组织学影响；
[0035]步骤二，rAAV干扰载体对原位前列腺癌中E2F3mRNA及蛋白质表达水平的影响；检测E2F3基因沉默后其下游调控基因的表达情况；
[0036]步骤三，应用流式细胞术研究rAAV-U6-RiE2F3_GFP注射前后肿瘤细胞细胞周期及凋亡的变化情况；应用电镜技术了解AAV干扰病毒对肿瘤细胞超微结构的影响；
[0037]步骤四，用摘眼球放血方法收集裸鼠血液标本，应用实时定量PCR比较不同组间全血E2F3基因mRNA表达情况。
[0038]进一步，E2F3在前列腺癌组织中的表达与AR的异常表达具有相关性；构建前列腺原位癌模型并通过腹腔注射干扰病毒的方法，抽取种植成功小鼠静脉血检测mRNA表达情况发现治疗组外周血标本中E2F3mRNA表达明显下降；治疗组中前列腺肿瘤提及明显缩小。
[0039]本发明提供的E2F3基因沉默对前列腺癌动物模型中全血E2F3影响的方法，通过免疫组化研究不同前列腺癌组织中E2F3的表达情况，明确E2F3与前列腺癌分级、分期及预后的关系；通过构建针对E2F3的AAV病毒载体，沉默E2F3基因并进行相关的外功能实验；通过建立裸鼠前列腺癌模型，成功应用AAV病毒载体进行体内实验并明确E2F3基因沉默前后裸鼠全血中E2F3mRNA表达情况。本发明的E2F3基因可以作为前列腺癌基因治疗的高效靶点，为后续的以E2F3为靶点的前列腺癌基因治疗体内实验奠定基础；针对E2F3的重组RNA干扰AAV病毒能够抑制肿瘤细胞的增殖并能够促进细胞的凋亡，并通过上述机制能有效抑制动物模型肿瘤的生长并降低了外周血标本内E2F3的表达，为以E2F3为靶点的肿瘤基因沉默疗法提供了可靠的理论和实验基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0040]图1是本发明实施例提供的E2F3基因沉默对前列腺癌动物模型中全血E2F3影响的方法的流程图；
[0041]图2是本发明实施例提供的pAAV-MCS及pRNAT_U6.l_siE2F3/Neo质粒及Mlu单酶切电泳结果示意图；
[0042]图中:M:DL1, 5000Marker ;1，2:pRNAT_U6.l_siE2F3/Neo 质粒；3:Mlu 单酶切PRNAT-U6.l-siE2F3/Neo 质粒(约 6400bp) ;4:pAAV_MCS 质粒；5:Mlu 单酶切 pAAV-MCS 质粒(4600bp)；
[0043]图3是本发明实施例提供的以PRNAT-U6.l-siE2F3/Neo质粒为模板的干扰序列PCR结果不意图；
[0044]图中:M:DL2000Marker ;1，2，3:Mlu-U6-MCS-CMV-GFP_Mlu 片段(约 1700bp)；
[0045]图4是本发明实施例提供的pAAV_siE2F3环状质粒示意图；
[0046]图中:M:DL1,5000Marker ；1, 2:已插入目的片段的 pAAV-MCS ；
[0047]图5是本发明实施例提供的pAAV_siE2F3质粒BglII单酶切示意图；
[0048]图中:Ml: DLl, 5000Marker ；M2: DL2000Marker ; 1，2，3:线性 pAAV_siE2F3 质粒片段(约 6300bp)；
[0049]图6是本发明实施例提供的pAAV_siE2F3质粒Mlu、BamHl、HandIII酶切效果示意图；
[0050]图中:M1:DL1,5000Marker ；M2:DL2000Marker ；l:Mlu 单酶切后出现两条片段(约1650bp 及 4200bp) ;2:BamHl 单酶切后出现两条片段(约 2750bp 及 3550bp) ;3:HandIII 单酶切后出现两条片段(约2750bp及3550bp) ；4:BamHl和HandIII单酶切后出现两条片段(约 2750bp 及 3550bp)；
[0051]图7是本发明实施例提供的pAAV_siE2F3质粒PCR鉴定结果示意图；
[0052] 图中:Ml:DLl，5000Marker ;1，4:应用Mlu为两边酶切位点设计的引物扩增片段(约1700bp) ；2,3:应用ITR引物扩增片段(约3500bp)；
[0053]图8是本发明实施例提供的转染病毒后LNCaP细胞RNA提取后进行电泳示意图；
[0054]图9是本发明实施例提供的RT-PCR证实LNCaP细胞转染重组干扰AAV病毒后E2F3mRNA表达降低示意图；
[0055]图10是本发明实施例提供的RT-PCR证实LNCaP细胞转染重组干扰AAV病毒后E2F3mRNA表达下降降低情况示意图；
[0056]图11是本发明实施例提供的RT-PCR证实LNCaP细胞转染重组干扰AAV病毒后ARmRNA表达降低情况示意图；
[0057]图12是本发明实施例提供的E2F3在不同组织中的表达情况示意图；
[0058]图中:1:DL2000marker ;2_5:1 X PBS 对照组；6_7:重组干扰病毒组；
[0059]图13是本发明实施例提供的E2F3蛋白表达在不同前列腺组织中的表达情况示意图；
[0060]图中:1:1 XPBS对照组；2:空质粒对照组；3:重组干扰病毒组。
【具体实施方式】
[0061]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0062]下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
[0063]如图1所示，本发明实施例的E2F3基因沉默对前列腺癌动物模型中全血E2F3影响的方法包括以下步骤:
[0064]SlOl:通过收集不同前列腺癌石蜡标本，采用real-timePCR、WESTERN、免疫组化等技术手段，分析E2F3及其所调基因在前列腺癌中的表达情况；
[0065]S102:建立以AVV为载体的RNAi平台，并分析干扰序列对前列腺癌LNCaP细胞中E2F3基因沉默的影响；
[0066]S103:并经体外实验证实E2F3基因沉默对LNCaP细胞中E2F3及相关调控基因的影响及对细胞增殖及凋亡的影响；应用裸鼠进行原位前列腺癌动物模型的构建；
[0067]S104:应用AAV干扰载体进行肿瘤的局部注射后明确肿瘤组织中E2F3在mRNA及蛋白质水平的表达情况及其对肿瘤生长抑制情况，最后应用实时定量PCR对不同实验组进行全血E2F3mRNA的检测，明确其作为前列腺癌肿瘤标记物的可能性。
[0068]在步骤S104中，实验结果表明:E2F3与前列腺癌的恶性程度密切相关，其不仅是前列腺癌的诊断与预后指标，而且为前列腺癌的基因靶向治疗提供理论依据。本发明明确E2F3及AR在不同病理分级、临床分期的前列腺癌组织中的表达情况；明确E2F3及AR表达之间的相关性及其与前列腺癌预后的关系；构建以U6为启动子的AAV干扰穿梭质粒，并包装出高纯度rAAV-RiE2F3腺相关病毒生物制剂；通过前列腺癌细胞系进行体外实验，明确E2F3基因沉默后AR及相关基因的表达情况及细胞的生长情况。上述实验表明E2F3基因可以作为前列腺癌基因治疗的高效祀点，这也为后续的以E2F3为祀点的前列腺癌基因治疗体内实验奠定基础。通过采用LNCaP细胞在裸鼠前列腺前页进行接种，建立原位前列腺癌动物模型。并进行针对E2F3干扰病毒的腹腔注射体内实验研究。针对E2F3的重组RNA干扰AAV病毒能够抑制肿瘤细胞的增殖并能够促进细胞的凋亡，并通过上述机制能有效抑制动物模型肿瘤的生长并降低了外周血标本内E2F3的表达。本发明为以E2F3为靶点的肿瘤基因沉默疗法提供了可靠的理论和实验基础。
[0069]本发明的工作原理:
[0070]本发明通过免疫组化研究不同前列腺癌组织中E2F3的表达情况，明确E2F3与前列腺癌分级、分期及预后的关系；通过构建针对E2F3的AAV病毒载体，沉默E2F3基因并进行相关的外功能实验；通过建立裸鼠前列腺癌模型，成功应用AAV病毒载体进行体内实验并明确E2F3基因沉默前后裸鼠全血中E2F3mRNA表达情况。
[0071]本发明的具体包括以下四个方面:
[0072]1、取不同临床分期、病理分级的前列腺癌石蜡切片组织进行免疫组化染色，在蛋白质水平研究E2F3及AR的表达情况及二者的表达与前列腺癌临床特点及预后之间的关系，根据Gleason分级和评分标准进行病理分级并根据Whitmore-Jewett系统进行临床分期。
[0073]2、设计合成三对针对于E2F3基因的siRNA对应模版DNA序列，通过RT-PCR方法筛选出最为有效的干扰片段。根据上述筛选结果，将相应shRNA表达框克隆到腺相关病毒载体中(AAVHelper-FreeSystem, Strategene),包装纯化病毒后,转染膀胱移行细胞癌肿瘤细胞株，检测病毒载体的长效基因沉默的效果，以及细胞增殖凋亡相关指标。
[0074]3、采用LNCaP细胞在裸鼠前列腺前页进行接种，建立原位前列腺癌动物模型。并进行针对E2F3干扰病毒的腹腔注射体内实验研究。
[0075]结合以下的实验对本发明的原理做进一步的说明:
[0076]1.不同前列腺癌组织中E2F3的表达情况:
[0077]取不同临床分期、病理分级的前列腺癌石蜡切片组织进行免疫组化染色，在蛋白质水平研究E2F3及AR的表达情况及二者的表达与前列腺癌临床特点及预后之间的关系；根据Gleason分级和评分标准进行病理分级并根据Whitmore-Jewett系统进行临床分期。
[0078]2.针对E2F3的AAV干扰穿梭质粒的构建及病毒的包装、浓缩与纯化:
[0079]①对已制备的E2F3RNAi质粒载体进行双酶切，插入干扰片断后，将U6_RiE2F3序列PCR后克隆进T载体，然后亚克隆至pAAV-MCS。酶切、PCR、测序验证载体构建成功并证明ITR的存在；
[0080]②待AAV-293细胞达到70% -80%融合后，分别将干扰穿梭质粒与pRC、pHelper按照1:1:1浓度与细胞电转，24小时后收集细胞；
[0081]③采用“氯仿处理-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提”三个步骤分离、浓缩、纯化病毒；
[0082]④应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测病毒纯度；将纯化的病毒经钨酸盐染色后，置于150目的镍网上，扫描电镜观察。
[0083]3.含有干扰序列的rAAV对E2F3及相关调控基因表达影响的体外功能实验:
[0084]①对LNCaP细胞进行病毒转染，通过绿色荧光的观察、MTT实验等研究重组病毒载体与质粒载体在转化效率、沉默效率、细胞毒性等；
[0085]②研究rAAV干扰载体对LNCaP细胞中E2F3及ARmRNA及蛋白质表达水平的影响；
[0086] 接种LNCaP细胞于24孔板中，待细胞80_90%融合，弃培养液，并向每孔中分别加入不同浓度的rAAV-U6-RiE2F3-GFP，分别提取总RNA和总蛋白，观察干扰效果，研究不同浓度及不同作用时间的rAAV-RiE2F3干扰载体对LNCaP细胞中E2F3沉默的影响及细胞杀伤作用。
[0087]③应用流式细胞术研究rAAV-U6-RiE2F3-GFP转染前后LNCaP细胞细胞周期及凋亡的变化情况。
[0088]4.裸鼠原位前列腺癌模型的建立:
[0089]①将LNCaP细胞进行消化后浓度调整至IX 107个/ml，置于无菌Eppendorf管内，冰块上送到动物房中；
[0090]②裸鼠前列腺位置的确定:取仰卧位，75%酒精棉球消毒小鼠腹部及腹部以下皮肤。下腹正中切口，从两侧分离到精囊及输精管，沿着输精管向下游离至膀胱颈，暴露前列腺。因裸鼠前列腺前叶位置好，体积较大，所以选择该叶作为LNCaP细胞的种植位置。
[0091]③应用细胞悬液种植肿瘤细胞后定期观察裸鼠体重变化，并且进行成瘤情况的判定，应用免疫组化的方法验证前列腺癌动物模型的成功建立。
[0092]5.含有干扰序列的rAAV对E2F3及相关调控基因表达影响的体内功能实验:
[0093]①应用rAAV干扰载体进行肿瘤局部注射并于治疗后4周处死裸鼠，观察肿瘤大小及重量的变化；观察病毒作用后对裸鼠各个脏器组织学影响；
[0094]②研究rAAV干扰载体对原位前列腺癌中E2F3mRNA及蛋白质表达水平的影响；检测E2F3基因沉默后其下游调控基因的表达情况；
[0095]③应用流式细胞术研究rAAV-U6-RiE2F3-GFP注射前后肿瘤细胞细胞周期及凋亡的变化情况。应用电镜技术了解AAV干扰病毒对肿瘤细胞超微结构的影响；
[0096]④用摘眼球放血方法收集裸鼠血液标本，应用实时定量PCR比较不同组间全血E2F3基因mRNA表达情况。
[0097]本发明应用免疫组织化学方法检测不同病理分期及组织分级的前列腺癌标本和前列腺增生组织中E2F3、AR蛋白的表达情况；通过构建重组病毒干扰质粒pAAV-siE2F3并包装重组干扰病毒后进行相关体内及体外实验，以明确E2F3在前列腺癌发生机发展机制中的作用。
[0098]本发明结果显示:E2F3在前列腺癌的发生、发展中起着重要作用。E2F3的高表达提示预后不良；AR在前列腺癌的发生、发展中及进展成激素非依赖型起着重要作用；E2F3在前列腺癌组织中的表达与AR的异常表达具有相关性；E2F3、AR可望成为诊断前列腺癌和评估预后的指标。在前期进行质粒干扰载体构建的基础上，构建了针对E2F3基因的AAV干扰载体穿梭质粒，经过多种限制性内切酶酶切检测、目的基因PCR检测及测序证实pAAV-siE2F3重组质粒构建成功。同时，本发明通过PCR证实pAAV_siE2F3重组质粒存在ITR，并在此基础上成功进行了病毒的包装与纯化。本发明介绍的改造AAVHelper-Free系统进行RNAi的方法操作简便、价格低廉并且不影响后续实验。在进一步的体外细胞功能试验中，证实重组干扰病毒质粒能够有效的降低前列腺癌细胞系LNCaP细胞中E2F3基因mRNA表达，并发现E2F3基因表达明显降低后LNCaP细胞系中ARmRNA的表达明显降低。成功周建了前列腺原位癌模型并通过腹腔注射干扰病毒的方法进行体内实验，抽取种植成功小鼠静脉血检测mRNA表达情况发现治疗组外周血标本中E2F3mRNA表达明显下降。治疗组中前列腺肿瘤提及明显缩小。
[0099]实验数据及结果:
[0100]第一部分:前列腺癌组织中E2F3、AR的表达及其与前列腺癌的关系:
[0101]一、E2F3在前列腺良性增生组织和癌组织中的表达:
[0102]1.E2F3在前列腺良性增生组织和癌组织中的表达(表1):
[0103]E2F3蛋白主要定位在细胞核，偶见于细胞浆，免疫组化产物阳性呈黄或黄棕色颗粒，为灶性或弥漫状分布。PCa中的E2F3表达显著高于BPH ;且在PCa中的表达多着色较深，而在BPH为弱阳性或阳性。经两两组间比较表明:E2F3在二者中的表达不同，在BPH与PCa中的表达差异有显著性(X 2 = 26.67，P = 0.000)，即PCa中E2F3表达水平明显高于 BPH。
[0104]表1 E2F3在良性前列腺增生和前列腺癌组织中的表达E2F3
[0105]
【权利要求】
1.一种E2F3基因沉默对前列腺癌动物模型中全血E2F3影响的方法，其特征在于，该E2F3基因沉默对前列腺癌动物模型中全血E2F3影响的方法包括: 步骤一，通过收集不同前列腺癌石蜡标本，采用real-timePCR、WESTERN、免疫组化，分析E2F3及其所调基因在前列腺癌中的表达情况； 步骤二，建立以AVV为载体的RNAi平台，并分析干扰序列对前列腺癌LNCaP细胞中E2F3基因沉默的影响； 步骤三，并经体外实验证实E2F3基因沉默对LNCaP细胞中E2F3及相关调控基因的影响及对细胞增殖及凋亡的影响；应用裸鼠进行原位前列腺癌动物模型的构建； 步骤四，应用AAV干扰载体进行肿瘤的局部注射后明确肿瘤组织中E2F3在mRNA及蛋白质水平的表达情况及对肿瘤生长抑制情况，最后应用实时定量PCR进行全血E2F3mRNA的检测，明确作为前列腺癌肿瘤标记物的可能性。
2.如权利要求1所述的E2F3基因沉默对前列腺癌动物模型中全血E2F3影响的方法，其特征在于，该E2F3基因沉默对前列腺癌动物模型中全血E2F3影响的方法具体包括以下步骤: 第一步，取不同临床分期、病理分级的前列腺癌石蜡切片组织进行免疫组化染色，在蛋白质水平研究E2F3及AR的表达情况及二者的表达与前列腺癌临床特点及预后之间的关系，根据Gleason分级和评分标准进行病理分级并根据Whitmore-Jewett系统进行临床分期； 第二步，合成三对针对于E2F3基因的siRNA对应模版DNA序列，通过RT-PCR方法筛选出最为有效的干扰片段；根据筛选结果，将相应shRNA表达框克隆到腺相关病毒载体中，包装纯化病毒后，转染膀胱移行细胞癌肿瘤细胞株，检测病毒载体的长效基因沉默的效果，以及细胞增殖凋亡相关指标； 第三步，采用LNCaP细胞在裸鼠前列腺前页进行接种，建立原位前列腺癌动物模型。
3.如权利要求2所述的E2F3基因沉默对前列腺癌动物模型中全血E2F3影响的方法，其特征在于，取不同临床分期、病理分级的前列腺癌石蜡切片组织进行免疫组化染色，在蛋白质水平研究E2F3及AR的表达情况及二者的表达与前列腺癌临床特点及预后之间的关系；根据Gleason分级和评分标准进行病理分级并根据Whitmore-Jewett系统进行临床分期。
4.如权利要求2所述的E2F3基因沉默对前列腺癌动物模型中全血E2F3影响的方法，其特征在于，针对E2F3的AAV干扰穿梭质粒的构建及病毒的包装、浓缩与纯化包括以下步骤: 步骤一，对已制备的E2F3RNAi质粒载体进行双酶切，插入干扰片断后，将U6_RiE2F3序列PCR后克隆进T载体，然后亚克隆至pAAV-MCS ;酶切、PCR、测序验证载体构建成功并证明ITR的存在； 步骤二，待AAV-293细胞达到70% -80%融合后，分别将干扰穿梭质粒与pRC、pHelper按照1:1:1浓度与细胞电转，24小时后收集细胞； 步骤三，采用氯仿处理-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提三个步骤分离、浓缩、纯化病毒； 步骤四，应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测病毒纯度；将纯化的病毒经钨酸盐染色后，置于150目的镍网上,扫描电镜观察。
5.如权利要求2所述的E2F3基因沉默对前列腺癌动物模型中全血E2F3影响的方法，其特征在于，含有干扰序列的rAAV对E2F3及相关调控基因表达影响的方法包括: 步骤一，对LNCaP细胞进行病毒转染，通过绿色荧光的观察、重组病毒载体与质粒载体在转化效率、沉默效率、细胞毒性； 步骤二，rAAV干扰载体对LNCaP细胞中E2F3及ARmRNA及蛋白质表达水平的影响； 步骤三，接种LNCaP细胞于24孔板中，待细胞80-90 %融合，弃培养液，并向每孔中分别加入不同浓度的rAAV-U6-RiE2F3-GFP，分别提取总RNA和总蛋白，观察干扰效果，不同浓度及不同作用时间的rAAV-RiE2F3干扰载体对LNCaP细胞中E2F3沉默的影响及细胞杀伤作用； 步骤四，应用流式细胞术研究rAAV-U6-RiE2F3-GFP转染前后LNCaP细胞细胞周期及凋亡的变化情况。
6.如权利要求2所述的E2F3基因沉默对前列腺癌动物模型中全血E2F3影响的方法，其特征在于，裸鼠原位前列腺癌模型的建立包括以下步骤: 步骤一，将LNCaP细胞进行消化后浓度调整至I X 107个/ml，置于无菌Eppendorf管内，冰块上送到动物房中； 步骤二，裸鼠前列腺位置的确定:取仰卧位，75%酒精棉球消毒小鼠腹部及腹部以下皮肤，下腹正中切口，从两侧分离到精囊及输精管，沿着输精管向下游离至膀胱颈，暴露前列腺；选择该叶作为LNCaP细胞的种植位置； 步骤三，应用细胞悬液种植肿瘤细胞后定期观察裸鼠体重变化，并且进行成瘤情况的判定，应用免疫组化的方法验证前列腺癌动物模型的成功建立。
7.如权利要求2所述的E2F3基因沉默对前列腺癌动物模型中全血E2F3影响的方法，其特征在于，含有干扰序列的rAAV对E2F3及相关调控基因表达影响的方法包括: 步骤一，应用rAAV干扰载体进行肿瘤局部注射并于治疗后4周处死裸鼠，观察肿瘤大小及重量的变化；观察病毒作用后对裸鼠各个脏器组织学影响； 步骤二，rAAV干扰载体对原位前列腺癌中E2F3mRNA及蛋白质表达水平的影响；检测E2F3基因沉默后其下游调控基因的表达情况； 步骤三，应用流式细胞术研究rAAV-U6-RiE2F3-GFP注射前后肿瘤细胞细胞周期及凋亡的变化情况；应用电镜技术了解AAV干扰病毒对肿瘤细胞超微结构的影响； 步骤四，用摘眼球放血方法收集裸鼠血液标本，应用实时定量PCR比较不同组间全血E2F3基因mRNA表达情况。
8.如权利要求2所述的E2F3基因沉默对前列腺癌动物模型中全血E2F3影响的方法，其特征在于，E2F3在前列腺癌组织中的表达与AR的异常表达具有相关性；构建前列腺原位癌模型并通过腹腔注射干扰病毒的方法，抽取种植成功小鼠静脉血检测mRNA表达情况发现治疗组外周血标本中E2F3mRNA表达明显下降；治疗组中前列腺肿瘤提及明显缩小。
【文档编号】C12N15/864GK104131088SQ201410334972
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年7月14日 优先权日:2014年7月14日
【发明者】胡海龙, 孙岩, 陈涛, 谢林国 申请人:天津市泌尿外科研究所