靶向抑制Mus81基因表达的siRNA、siRNA质粒、干扰慢病毒及其构建方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种靶向抑制Mus81基因表达的siRNA、siRNA质粒、干扰慢病毒及其构建方法和应用，通过设计人Mus81基因的siRNA序列，并构建相应的siRNA质粒和干扰慢病毒，以慢病毒介导siRNA的方法，特异性抑制肝癌细胞中Mus81基因的表达，从而实现抑制肝癌细胞生长增殖、促进其凋亡并提高其化疗敏感性等多方面的效应，为肝癌的治疗提供了Mus81基因这样一个非常有效的药物作用靶点，对于肝癌的Mus81基因靶向治疗药物的制备具有重大意义。
【专利说明】革E向抑制Mus81基因表达的s i RNA、s i RNA质粒、干扰慢病毒及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程【技术领域】，尤其涉及靶向抑制MUS81基因表达的siRNA、siRNA质粒、干扰慢病毒及其构建方法以及在制备治疗肝癌药物中的应用。
【背景技术】
[0002]Mus81基因属于XPF核酸内切酶超家族，最早由Interthal H等于2000年首先在酵母菌中鉴定得到，因敲除该基因的酵母菌对乙烷磺酸盐和紫外线更敏感，Interthal H等称其为“对乙烧磺酸盐及紫外线敏感的第81号独立序列”(MMS and UV sensitive isolatenumber81, Mus81)。Chen XB等随后于2001年鉴定得到人Mus81基因，该基因定位于人11号染色体的长臂(llql3.1)，共包含16个外显子，其编码的Mus81蛋白具有两个可与DNA分子结合的螺旋-发卡-螺旋结构，在这二者之间有一个典型的XPF样核酸内切酶结构域。Mus81蛋白通过其N末端定位于细胞核内，利用其C末端与另一核酸内切酶Emel结合形成异源二聚体而发挥作用，并具有与检查点激酶Cdsl等多种蛋白相结合的位点。MusSl基因凭借其核酸内切酶的功能，在细胞有丝分裂、修复DNA双链断裂和维护基因稳定性中发挥了关键作用。
[0003]目前，现有技术通过动物胚胎干细胞和动物实验表明，MusSl在肿瘤的发生发展中可以发挥抑癌基因的作用。研究表明，敲除一个等位基因的Mus81+/-小鼠或两个等位基因均被敲除的MUS81+小鼠与野生型(Mus81+/+)小鼠相比，73%的MUS81+小鼠在I年内死于淋巴瘤、乳腺癌及卵巢癌等各种自发性肿瘤，部分小鼠体内甚至同时发生了两种以上的肿瘤，而野生型小鼠在此期间则几乎全部(95%)健康存活。最近研究也发现，p53缺失的小鼠只要再损失一个MusSl等位基因，其发生肉瘤的几率立即显著上升，表示MusSl和p53在肿瘤抑制中可能具有协同效应。此外，新近的研究显示，缺失MusSl基因的小鼠胚胎干细胞和小鼠均对顺钼和丝裂霉素敏感，而重新导入MusSl基因后，它们对顺钼和丝裂霉素的敏感性就明显下降，鉴于顺钼、丝裂霉素均是目前常用的肿瘤化疗药物，表明MusSl作为一个DNA损伤修复关键基因，其与肿瘤化疗药物敏感性的调控关系密切。
[0004]如上所述，MusSl之前的研究对象多为胚胎干细胞(如小鼠胚胎干细胞)和动物(如小鼠)，尚无有关抑制MusSl基因表达对人肝癌细胞的生长、增殖、凋亡等的影响，以及MusSl基因可否调控肝癌细胞化疗敏感性等的研究报道；而且，目前抑制MusSl基因的方法也多是基因敲除，该方法研究周期长、对技术条件的要求高且难以应用于临床治疗，因而存在明显的局限性。核糖核酸干扰(RNA interference,RNAi)是近年来兴起的一种基因沉默技术，长度为21-23个核苷酸组成的短的双链核糖核酸(dsRNA)能够在转录及转录后水平特异性地引起基因沉默，因其可简便、高效、特异地阻断体内特定基因的表达，使细胞表现出相应基因表型的缺失，从而得到了广泛的应用。目前，该技术在基因功能研究、肿瘤的基因治疗及新药的研究与开发等方面已显示出广阔的前景。特定的由21个碱基组成的小干扰核糖核酸(short interfering RNA, siRNA)是RNAi的主要效应物,但由于siRNA片段的半衰期过短，体外合成的siRNA片段转移到细胞内后，其发挥出的基因抑制作用一般是很短暂的。因此，临床研究中一般采取事先在体外构建能够表达siRNA片段的载体，再将载体转移至细胞内使其表达出siRNA片段的策略。目前常用的载体包括逆转录病毒、腺病毒和慢病毒。慢病毒表达载体相对于其它表达载体，具有免疫原性低、感染效率高、感染时间长、感染效果稳定且能感染分裂相和非分裂相细胞等优点，已成为肿瘤治疗领域中应用技术研发的强有力手段。RNAi基因沉默功能的实现依赖于siRNA序列的选择与高效表达载体的构建，目前，现有技术尚无靶向抑制MusSl基因表达的siRNA、siRNA质粒、干扰慢病毒及其在制备治疗肝癌药物中的应用。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种靶向抑制MusSl基因表达的siRNA、siRNA质粒、干扰慢病毒及其构建方法和应用，通过设计人Mus81基因的siRNA序列，并构建相应的siRNA质粒和干扰慢病毒，以慢病毒介导siRNA的方法，特异性抑制肝癌细胞中MusSl基因的表达，从而实现抑制肝癌细胞生长增殖、促进其凋亡并提高其化疗敏感性的作用。
[0006]本发明的目的通过以下技术方案予以实现:
[0007]本发明提供的一种靶向抑制Mus81基因表达的siRNA，所述siRNA序列为5，-GAGTTGGTACTGGATCACATT-3’(序列 I)。
[0008]本发明提供的一种靶向抑制Mus81基因表达的siRNA质粒，包括含有上述siRNA序列的双链DNA oligo ;所述双链DNA oligo的正义链序列为5’-CCGGGAGTTGGTACTGGATCACATTCTCGAGAATGTGATCCAGTACCAACTCTITTTG-3’(序列 2)，反义链序列为 5 ’-AATTCAAAMGAGTTGGTACTGGATCACATTCTCGAGAATGTGATCCAGTACCAACTC-3，(序列 3)，其两端含有 Age I 和 BamHI酶切位点粘端。
[0009]本发明提供的一种靶向抑制MusSl基因表达的干扰慢病毒，包括上述siRNA质粒以及慢病毒包装载体；并且其构建方法包括以下步骤:
[0010](I) siRNA质粒的构建
[0011](1-1)以Age I和BamH I限制性内切酶作用于GV248载体质粒以使其线性化，电泳鉴定其酶切片段，得到线性化的GV248质粒；
[0012](1-2)通过T4DNA连接酶将所述线性化的GV248质粒和纯化好的上述双链DNAoligo连接，得到连接产物；将连接产物转化到感受态大肠杆菌细胞，以连接转化产物长出菌溶于LB培养基作为模板进行PCR鉴定；
[0013](1-3) PCR鉴定采用的引物为:
[0014]上游:5’-GGAAAGAATAGTAGACATAATAGC-3’ (序列 4)；
[0015]下游:5，-GTGGATGAATACTGCCATTTGTCTC-3’(序列5)；
[0016]对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对，比对正确的克隆即为构建成功的含有Mus81干扰片段的siRNA质粒；
[0017](2)干扰慢病毒的构建
[0018]以所述siRNA质粒作为表达载体，慢病毒包装系统中的pGC-LV重组载体、pHelperl.0载体和pHelper2.0载体作为慢病毒包装载体，同时共转染293T细胞(人胚肾细胞)，在该细胞中进行病毒的包装并分泌到细胞外的培养基中，收集培养基离心后取得的上清液，即为包含所述siRNA质粒的干扰慢病毒。
[0019]本发明还提供了上述靶向抑制Mus81基因表达的siRNA、siRNA质粒或干扰慢病毒在制备治疗肝癌药物中的应用，以及包括上述靶向抑制Mus81基因表达的siRNA、siRNA质粒或干扰慢病毒的药物组合物。
[0020]本发明具有以下有益效果:
[0021]本发明通过设计人Mus81基因的siRNA序列，并构建相应的siRNA质粒和干扰慢病毒，采用慢病毒介导siRNA的方法，该干扰慢病毒能够高效感染肝癌细胞并特异性抑制后者中MusSl基因的表达，能够实现抑制肝癌细胞生长增殖、促进其凋亡并提高其化疗敏感性等多方面的效应，从而为肝癌的治疗提供了 MusSl基因这样一个非常有效的药物作用靶点，其治疗效果全面，对于肝癌的MusSl基因靶向治疗药物的制备意义重大，可用于相应RNA1、单克隆抗体及小分子拮抗剂等祀向治疗药物的开发。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]下面将结合实施例和附图对本发明作进一步的详细描述:
[0023]图1是GV248质粒D NA图谱；
[0024]图2是Mus81-siRNA慢病毒感染肝癌细胞7天后Mus81基因表达水平的结果示意图；
[0025]图3是靶向抑制Mus81基因表达后肝癌细胞生长曲线的结果示意图；其中:A，H印G2细胞；B, H印3B细胞；
[0026]图4是靶向抑制Mus81基因表达后HepG2细胞克隆形成数量的结果示意图；
[0027]图5是靶向抑制Mus81基因表达后Hep3B细胞克隆形成数量的结果示意图；
[0028]图6是靶向抑制Mus81基因表达后H印G2细胞凋亡水平的结果示意图；其中:A，流式细胞仪检测siRNA对照组细胞凋亡水平的结果；B，流式细胞仪检测Mus81-siRNA组细胞凋亡水平的结果；C，凋亡水平统计分析的直方图；
[0029]图7是靶向抑制Mus81基因表达后H印3B细胞凋亡水平的结果示意图；其中:A，流式细胞仪检测siRNA对照组细胞凋亡水平的结果；B，流式细胞仪检测Mus81-siRNA组细胞凋亡水平的结果；C，凋亡水平统计分析的直方图；
[0030]图8是靶向抑制Mus81基因后化疗药物对H印G2细胞的剂量-抑制率曲线；其中:A，5-氟脲嘧啶；B，丝裂霉素；C，阿霉素；D，表阿霉素；
[0031]图9是靶向抑制Mus81基因后化疗药物对H印3B细胞的剂量-抑制率曲线；其中:A，5-氟脲嘧啶；B，顺钼；C，阿霉素；D，表阿霉素。
[0032]图10是靶向抑制Mus81基因后HepG2细胞裸鼠皮下成瘤的裸鼠活体成像结果示意图；其中:A，裸鼠皮下肿瘤的活体成像结果；B，裸鼠皮下肿瘤总光子数的统计直方图；
[0033]图11是靶向抑制Mus81基因后H印G2细胞形成的裸鼠皮下肿瘤对5_氟脲嘧啶的敏感性结果示意图；其中:A，经5-氟脲嘧啶腹腔化疗后的裸鼠皮下肿瘤；B，裸鼠皮下肿瘤体积的统计直方图；
[0034]图12是靶向抑制Mus81基因后HepG2细胞形成的裸鼠皮下肿瘤对丝裂霉素的敏感性结果示意图；其中:A，经丝裂霉素腹腔化疗后的裸鼠皮下肿瘤；B，裸鼠皮下肿瘤体积的统计直方图；
[0035]图13是靶向抑制Mus81基因后HepG2细胞形成的裸鼠皮下肿瘤对表阿霉素的敏感性结果示意图；其中:A，经表阿霉素腹腔化疗后的裸鼠皮下肿瘤；B，裸鼠皮下肿瘤体积的统计直方图；
【具体实施方式】
[0036]图1~图13所示为本发明靶向抑制Mus81基因表达的siRNA、siRNA质粒、干扰慢病毒及其构建方法和应用的实施例，通过设计人Mus81基因的siRNA序列，并构建相应的siRNA质粒和干扰慢病毒，采用慢病毒介导siRNA的方法，特异性抑制肝癌细胞中Mus81基因的表达，从而实现抑制肝癌细胞生长增殖、促进其凋亡并提高其化疗敏感性的作用。
[0037]1、设计靶向抑制Mus81基因表达的siRNA序列
[0038]首先从Genebank中调取人Mus81基因的序列(BC009999)，然后利用上海吉凯基因化学技术公司的设计软件Genechem设计3条针对Mus81基因的siRNA序列，并从中筛选出干扰效果最佳的siRNA序列:5’-GAGTTGGTACTGGATCACATT-3’(见序列表中序列1)，命名为Mus81_siRNA 序列。
[0039]2、构建靶向抑制Mus81基因表达的siRNA质粒和siRNA对照质粒
[0040](2-1)设计包含上述Mus81_siRNA序列的双链DNA oligo，其正义链及反义链的序列如序列表中序列2及序列3所示，上述序列的结构如表1所示。上述双链DNA oligo由上海吉凯基因化学技术公司合成，把合成所得的DNA干粉溶解于退火缓冲液中，90°C水浴15分钟，然后自然冷却至室温，即形成包含干扰靶点序列的DNA双链，其两端含有Age I和BamH I酶切位点粘端。以Age I和BamH I限制性内切酶作用于GV248载体(上海吉凯基因化学技术有限公司提供，见图1)以使其线性化，酶切反应体系见表2，琼脂糖凝胶电泳鉴定其酶切片段。
[0041]表1 Mus81_siRNA双链DNA oligo的序列及结构
[0042]
【权利要求】
1.一种靶向抑制Mus81基因表达的siRNA，其特征在于:所述siRNA序列为5，-GAGTTGGTACTGGATCACATT-3’(序列 I)。
2.一种靶向抑制Mus81基因表达的siRNA质粒，其特征在于:包括含有权利要求1所述siRNA序列的双链DNA oligo ;所述双链DNA oligo的正义链序列为5’ -CCGGGAGTTGGTACTGGATCACATTCTCGAGAATGTGATCCAGTACCAACTCTTTTTG-3’(序列 2)，反义链序列为 5’-AATTCAAAAAGAGTTGGTACTGGATCACATTCTCGAGAATGTGATCCAGTACCAACTC-3’ (序列 3)，其两端含有 AgeI和BamH I酶切位点粘端。
3.一种靶向抑制MusSl基因表达的干扰慢病毒，其特征在于:包括权利要求2所述siRNA质粒以及慢病毒包装载体。
4.权利要求3所述靶向抑制MusSl基因表达的干扰慢病毒的构建方法，其特征在于包括以下步骤: (1)siRNA质粒的构建 (1-1)以Age I和BamH I限制性内切酶作用于GV248载体以使其线性化，电泳鉴定其酶切片段，得到线性化的GV248质粒； (1-2)通过T4DNA连接酶将所述线性化的GV248质粒和纯化好的权利要求2所述双链DNA oligo连接，得到连接产物；将连接产物转化到感受态大肠杆菌细胞，以连接转化产物长出菌溶于LB培养基作为模板进行PCR鉴定； (1-3) PCR鉴定采用的引物为: 上游:5’ -GGAAAGAATAGTAGACATAATAGC-3’(序列 4)； 下游:5’ -GTGGATGAATACTGCCATTTGTCTC-3’(序列 5)； 对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对，比对正确的克隆即为构建成功的含有Mus81干扰片段的siRNA质粒； (2)干扰慢病毒的构建 以所述siRNA质粒作为表达载体，慢病毒包装系统中的pGC-LV重组载体、pHelperl.0载体和pHelper2.0载体作为慢病毒包装载体，同时共转染293T细胞，在该细胞中进行病毒的包装并分泌到细胞外的培养基中，收集培养基离心后取得的上清液，即为包含所述siRNA质粒的干扰慢病毒。
5.权利要求1所述靶向抑制Mus81基因表达的siRNA在制备治疗肝癌药物中的应用。
6.权利要求2所述靶向抑制Mus81基因表达的siRNA质粒在制备治疗肝癌药物中的应用。
7.权利要求3所述靶向抑制MusSl基因表达的干扰慢病毒在制备治疗肝癌药物中的应用。
8.一种药物组合物，其特征在于包括权利要求1所述的靶向抑制MusSl基因表达的SiRNA0
9.一种药物组合物，其特征在于包括权利要求2所述的靶向抑制MusSl基因表达的siRNA质粒。
10.一种药物组合物，其特征在于包括权利要求3所述的靶向抑制MusSl基因表达的干扰慢病毒。
【文档编号】C12N15/867GK104164435SQ201410335062
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年7月14日 优先权日:2014年7月14日
【发明者】吴帆, 刘建伟, 戴丽冰 申请人:吴帆