一种提高解淀粉芽孢杆菌生产鸟苷产量的方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高解淀粉芽孢杆菌生产鸟苷产量的方法，该方法以温敏型质粒pKS2为载体，通过同源重组的方法去除嘌呤操纵子(purEKBCSQLFMNHD)的启动子部分片段，其优选序列片段是缺失purE基因前-193～-29bp片段，缺失该片段后的菌株解除了purR(嘌呤操纵子的阻遏蛋白)的阻遏效应和该段片段的回文结构带来的转录衰减作用。purF编码磷酸核糖焦磷酸(PRRR)转酰胺酶基因通过点突变脱敏，其优选是217亮氨酸突变为异亮氨酸(L217I)，其所受产物腺苷酸，鸟苷酸的反馈抑制被解除。经过改造后的基因工程菌鸟苷生产能力明显提高。
【专利说明】一种提高解淀粉芽孢杆菌生产鸟苷产量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，具体地说，涉及一种提高解淀粉芽孢杆菌生产鸟苷产 量的方法。 技术背景
[0002] 鸟嘌呤核苷，即鸟苷，是嘌呤核苷类的一种，是鸟嘌呤N-9与D-核糖的C-1通过 β_糖苷键相连形成的。鸟苷在食品和医药工业有非常广泛的用途。在食品工业，鸟苷磷酸 酯为鸟苷酸，鸟苷酸和肌苷酸组成呈味核苷酸钠作为新一代的核苷类食品增鲜剂，是味精 鲜味的十几倍，是目前方便面调味包、调味品（如鸡精、酱油等）的主要呈味成分之一。在 医药工业，鸟苷作为很多高效药物的中间体，比如流感病毒、艾滋病毒和疱疹病毒等抗病毒 药物。例如许多乙肝病毒药物，如拉米夫定、恩替卡韦等，中间体都是鸟苷。
[0003] 目前，微生物发酵生产是鸟苷主要的生产方法，微生物发酵生产菌主要是芽孢杆 菌类，包括解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌很短小芽孢杆菌等。芽孢杆菌类作为生产鸟苷的 出发菌株的特点是磷酸戊糖途径比较活跃，嘌呤核苷磷酸化酶活力低。在微生物体内，鸟 苷的生物合成途径有两条：分别是从头合成途径和补救合成途径。在工业微生物生产中， 通过添加碳源、氮源、无机盐和生长因子为原材料，经过一系列酶促反应，从头合成生成鸟 苷。在芽孢杆菌中，生产核苷需要经过一个包含12个基因的操纵子（purEKBCSQLFMNHD)， 称为嘌呤操纵子。嘌呤核苷酸生物合成的调控机制非常复杂，包括转录阻遏、转录衰减及末 端产物反馈抑制等。而嘌呤操纵子的调控直接导致嘌呤核苷的产量。purR是嘌呤操纵子 的阻遏蛋白，调控一系列有关噪呤代谢基因表达，Aloke等[Aloke Kumar Bera，Jianghai Zhu,Howard Zalkin, et al. Fuctional Dissection of the Bacillus subtilis pur Operator site. Jouranl of Bacteriology, 2003, 185(14) :4099-4109]报道purR基因特异 性的锚定在purE基因前两个14个核苷酸反向重复称之为"PurBox"上，阻碍嘌呤操纵子的 转录。嘌呤操纵子的转录除了受purR的阻遏作用外，还受转录衰减的调控。Daniel等报 道[Daniel J. Ebbole and Howard zalkin. Detection of pur Operon-attenuated mRNA and Accumulated Degradation Intermediates in Bacillus subtilis. The Journal of Biological Chemistry. 1988,263(22):10894-10902]调控操纵子的转录从 purE 基因上游 242个核苷酸开始，在这之间有两个回文结构，使转录提前终止，这个终止转录并不依赖〇 因子。因此，通过对嘌呤操纵子上游基因进行操作可以解除purR表达的阻遏蛋白对嘌呤操 纵子的转录起始的阻遏效应，也可以避免回文结构使嘌呤操纵子的转录提前结束。
[0004] purF编码PRPP转酰胺酶是芽孢杆菌属内鸟苷合成途径上的一个关键酶，催化 PRPP生成5-磷酸核糖胺，促进胞内的PRPP进入嘌呤（pur)合成途径。何逵夫等（何逵夫，马 跃超，杜姗姗，谢希贤，徐庆阳，陈宁.解淀粉芽孢杆菌关键酶基因过量表达对鸟苷积累的 影响.微生物学报.2012, 52 (6) : 718?725)通过换用强启动子增强purF的表达来增加鸟 苷的产量，指出过量表达策略能使鸟苷产量提高，这可能与胞内的核苷酸浓度很低以至于 反馈抑制没有形成有关。但关键酶的反馈抑制并未解除。PRPP转酰胺酶主要受到腺苷酸的 反馈抑制，还受到GMP的反馈抑制作用。Shimaoka等（Shimaoka Μ·，Takenaka Υ·，Kurahashi 0. , etal. Effect of amplification of desensitized purF and prs on inosine accumulation in Escherichia coli[J].J Biosci Bioeng, 2007, 103 (3) :255-61)将脱敏 的PurF和Prs导入到大肠杆菌中表达，成功地提高了肌苷的产量。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现在技术的不足，提供一种提高解淀粉芽孢杆菌生产鸟苷 产量的方法。
[0006] 本发明的方法涉及的宿主菌是解淀粉芽孢杆菌，通过对该菌进行两个位点的改 造。两个改造位点一个是嘌呤操纵子（purEKBCSQLFMNHD)的启动子部分片段即是缺失purE 基因前-193?-29bp片段；第二个是purF编码磷酸核糖焦磷酸（PRRR)转酰胺酶基因氨基 酸217亮氨酸突变为异亮氨酸（L217I)的点突变。经过改造后的基因工程菌鸟苷生产能力 提1?。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] -种提高解淀粉芽孢杆菌生产鸟苷产量的方法，包括如下步骤：嘌呤操纵子 (purEKBCSQLFMNHD)的启动子部分片段即purE基因（编码磷酸核糖氨基咪唑碳酸化酶） 前-193?-29bp片段缺失；或是将purF基因（编码磷酸核糖焦磷酸PRRR转酰胺酶）的 217位氨基酸亮氨酸突变为异亮氨酸（L217I)。所述purE基因前-193?-29bp片段缺 失，其DNA序列如SEQIDN0:1所示。所述purF基因氨基酸序列217位突变，其DNA序列如 SEQIDN0:2 所示。
[0009] 在上述方法中，所述构建解淀粉芽孢杆菌B. amyloliquefaciensXH- Δ p〇 : PCR 扩增解淀粉芽孢杆菌 DSM7 菌株（BacillusamyloliquefaciensDSM7 :ATCC23350) 嘌呤启动子基因的DNA片段，然后通过融合PCR将purE基因前-193?-29bp片 段缺失，融合PCR扩增产物连接入pKS2质粒基因，最后将重组的pKS2质粒转化 入解淀粉芽孢杆菌B. amyloliquefaciensXH，经过同源重组，得到解淀粉芽孢杆菌 B. amyloliquefaciensXH-Δp〇 ；
[0010] 在上述方法中，所述构建解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens XH7- Λ po-purF-217 :PCR 扩增解淀粉芽抱杆菌 DSM7 菌株 (BacillusamyloliquefaciensDSM7 :ATCC23350)purF 基因，然后通过融合 PCR 将 purF 基因 217位氨基酸突变（L217I)由原来的亮氨酸突变为异亮氨酸，融合PCR扩增产物连接入pKS2 质粒基因，最后将重组的pKS2质粒转化入解淀粉芽孢杆菌B. amyloliquefaciensXH-Δρ〇， 经过同源重组，得到解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens ΧΗ7- Λ p〇-purF-217。 toon] 利用改造后所得解淀粉芽孢杆菌工程菌生产鸟苷的方法，包括以下步骤：将解 淀粉芽抱杆菌 Bacillus amyloliquefaciens XH7- Λ p〇-purF-217 在 37 °C 的固体活 化培养基中培养24?36h，得到活化的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens XH7- Λ p〇-purF-217 ;然后将活化的解淀粉芽孢杆菌 Bacillus amyloliquefaciens XH7-Λ po-purF-217以单菌落接入摇瓶种子培养基，37 °C培养6?7h，按体积比10 %的 接种量接种到摇瓶发酵培养基中，37°C发酵60?72h，将发酵液加热、离心，将上清液过 0. 22 μ m的膜HPLC检测鸟苷含量。
[0012] 所述固体活化培养基成分（重量百分比）：1%蛋白胨，1%氯化钠，0.5%酵母抽提 物，1 %葡萄糖，1.5%琼脂，余量为水；摇瓶种子培养基成分（重量百分比）：葡萄糖1.5%， 蛋白胨1%，酵母膏〇. 5%，NaClO. 5%，余量为水，pH7. 2 ;摇瓶发酵培养基成分（重量百分 比）：葡萄糖8%，硫酸镁0.6%，酵母粉0.8%，硫酸二氢钾0. 15%，硫酸铵1.0%，氯化钾 0· 15%，味精1.6%，碳酸钙0.3%，余量为水，ρΗ7· 2。
[0013] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0014] (1)本发明是在一株解淀粉芽孢杆菌菌株上进行基因工程操作达到积累、提高鸟 苷产量的目的。涉及两个新的改造位点，一是优选序列片段操纵子（purEKBCSQLFMNHD) 的启动子部分片段即缺失purE基因前-193?-29bp片段，缺失该片段后的菌株解除了 purR(嘌呤操纵子的阻遏蛋白）的阻遏效应和该段片段的回文结构带来的转录衰减作用。 二是purF编码磷酸核糖焦磷酸（PRRR)转酰胺酶基因优选是217亮氨酸突变为异亮氨酸 (L217I)，其所受产物腺苷酸，鸟苷酸的反馈抑制被解除。
[0015] (2)通过温敏性质粒以同源重组的方法在基因组染色体上的改造，无抗生素标记 和外源DNA片段。所构建的工程菌因目的基因整合到染色体上，遗传稳定性高，从而导致生 产性能稳定。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1是实施例中1扩增purE基因起始密码子-193?-29bp截断的PCR产物电泳 图；
[0017] 图2是实施例中2扩增含有purF基因 L2171突变位点的PCR产物电泳图；
[0018] 图3是（a)实施例中1嘌呤启动子缺失片段和（b)实施例中2purF基因点突变片 段构建示意图；
[0019] 图4是实施例中1嘌呤启动子截断片段DNA的载体构建示意图；
[0020] 图5是实施例中2含有purF(L217I)突变片段的载体构建示意图。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0022] 以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、DNA片 段酶切、连接、凝胶电泳都采用常规的方法，具体可参见《分子克隆实验指南》（第三版） (SambrookJ, Russell DW，JanssenK, Argentine J.黄培堂等译，2002,北京：科学出版社）。
[0023] 实施例1 :
[0024] 以解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciensXH7为出发菌株的产鸟苷工程菌 B. amyloliquefaciens XH- Λ po 的构建
[0025] (1)含有嘌呤启动子截断片段的获得：含有解淀粉芽孢杆菌DSM7菌株（Bacillus amyloliquefaciens XH7:CP002927)嘌呤启动子基因的DNA片段通过用该细菌的染色体 DNA作为模板进行PCR而获得，引物为SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4扩增同源臂左臂，引物为 SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6扩增同源臂右臂，基因 PCR扩增的产物胶回收，然后取等摩尔比 例的扩增产物作为模板，所用正向引物和反向引物分别为SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 6,扩增 出与purE基因起始密码子-193?-29bp截断基因大小相符的DNA片段，如图1所示，图中 泳道1为DNA marker ;泳道2、3均为RCR产物（purE基因起始密码子-193?-29bp截断 的基因）。通过Sanger测序结果证明获得片段是将purE基因起始密码子-193?-29bp的 DNA片段截断的DNA片段。
[0026] (2)同源替换载体的构建：将温敏性质粒PKS2用spel、kpnl双酶切，spel、kpnl 双酶切上下同源臂然后用cycle pure柱纯化产物，以T4DNA连接酶连接，所使用的同源臂 是解淀粉芽孢杆菌DSM7的yebG和purE基因，将融合PCR的产物插入，即成功构建融合质 粒 PKS2-Apo。
[0027] (3)目的菌株的获得：将构建好的融合质粒PKS2-Apo转化芽孢杆菌XH7， 通过同源重组的方式整合到芽孢杆菌XH7基因组上，转化方法参见以下文献记载 Natalia P, Zakataeva, Oksana V et al. A simple method to introduce marker-free genetic modification into chromosome of naturally nontransformab1e Bacillus amyloliquefaciens strains[J].Appl Microbiol Biotechnol. 2010, 85:1201-1209),得到 新的菌株 B. amyloliquefaciens XH7- Λ po〇
[0028] 实施例2 :
[0029] 以解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciensXH-Λ po为出发菌株的产鸟苷 工程菌 B. amyloliquefaciensXH7_ Λ po-purF-217 的构建
[0030] (l)purF基因扩增和突变片段的获得：含有解淀粉芽孢杆菌XH7菌株（Bacillus amyloliquefaciens XH7:CP002927)嘌呤启动子基因的DNA片段通过用该细菌的染色体 DNA作为模板进行PCR而获得，引物为SEQ ID No7、SEQ ID No8扩增同源臂左臂，引物为 SEQIDN〇9、SEQIDNolO扩增同源臂右臂，基因 PCR扩增的产物胶回收，然后取等摩尔比例的 扩增产物作为模板，所用正向引物和反向引物分别为SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 10,扩增出 一条含有purF基因 L217I突变位点的大小相符的DNA片段。如图2所示，图中泳道1为 DNAmarker ;泳道2、3均为RCR产物（含有purF基因 L2171突变位点基因片段）。通过Sanger 测序结果证明获得片段大小是有purF基因 L217I突变位点的基因，即leu(DNA:CTT)突变 为 ile(DNA:ATT)。
[0031] (2)同源替换载体的构建：将温敏性质粒PKS2用spel、kpnl双酶切，spel、kpnl 双酶切上下同源臂然后用cycle pure柱纯化产物，以T4DNA连接酶连接，所使用的同源臂 是解淀粉芽孢杆菌XH7的purF基因，将融合突变位点的purF产物插入，即成功构建融合质 粒 PKS2-purF-217。
[0032] (3)将融合基因整合到产核苷菌株基因组上获得purF突变的菌株：将构 建好的融合质粒PKS2-purF-217转化芽孢杆菌XH7- Λρο,通过同源重组的方式整 合到芽孢杆菌ΧΗ7基因组上，转化方法参见以下文献记载Natalia P，Zakataeva， Oksana V et al. A simple method to introduce marker-free genetic modification into chromosome of naturally nontransformable Bacillus amyloliquefaciens strains [J] · Appl Microbiol Biotechnol. 2010, 85:1201-1209)，得到新的菌株 Bacillus amyloliquefaciens XH7_ Λ p〇-purF_217〇
[0033] 实施例3 :
[0034] 构建的解淀粉芽抱杆菌工程菌 Bacillus amyloliquefaciensXH- Λ po 和 B. amyl oliquefaciensXH7- Λ po-purF-217摇瓶发酵产鸟苷能力的检测
[0035] (1)从保藏的甘油管中（甘油浓度18%，-80°C保藏）划线于优选的固体活化培 养基（重量百分比）（成分：1%蛋白胨，1%氯化钠，0.5%酵母抽提物，1%葡萄糖，1.5%琼 月旨，余量为水）上，37°C培养24?36h ;挑取固体平板上长出的单菌落，接种于摇瓶种子培 养基（重量百分比）（成分：葡萄糖1.5%，蛋白胨1%，酵母膏0.5%，NaC10.5%，ρΗ7·2) 中，37°C培养6?7h，按体积比10%的接种量接种到摇瓶发酵培养基（重量百分比）（葡萄 糖8%，硫酸镁0.6%，酵母粉0.8%，硫酸二氢钾0. 15% ;硫酸铵1.0%，氯化钾0. 15%，味 精1.6%，碳酸钙0.3% (分消），余量为水，ρΗ7·2。）中，37°C发酵60?72h。
[0036] (2)将发酵液于沸水中保温5min，5000rpm转速离心2min，将上清液过0· 22μηι的 膜HPLC检测鸟苷含量。HPLC检测鸟苷的条件是：流动相甲醇：水=10:90(体积比）；检测 柱：Phenomenex Gemini5 μ mC18 规格 250*4. 6mm ;检测波长：紫外 254nm ;流速：lml/min ;柱 温：25?30°C。鸟苷标准品购于sigma公司。摇瓶结果如下表所示：
[0037] 表1两株工程菌摇瓶发酵产鸟苷评估结果（三次重复均值）
[0038]
【权利要求】
1. 一种提高解淀粉芽孢杆菌生产鸟苷产量的方法，其特征在于包括如下步骤：嘌呤操 纵子的启动子部分片段即purE基因前-193?-29bp片段缺失；或是将purF基因的217位 氨基酸亮氨酸突变为异亮氨酸。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述purE基因前-193?-29bp片段缺失， 其DNA序列如SEQ ID NO: 1所示。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述purF基因氨基酸序列217位突变，其 DNA序列如SEQ ID N0:2所示。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述构建解淀粉芽孢杆菌 B. amyloliquefaciensXH-Λρο :PCR扩增解淀粉芽孢杆菌DSM7菌株嘌呤启动子基因的DNA 片段，然后通过融合PCR将purE基因前-193?-29bp片段缺失，融合PCR扩增产物连接入 pKS2质粒基因，最后将重组的pKS2质粒转化入解淀粉芽孢杆菌B. amyloliquefaciens XH， 经过同源重组，得到解淀粉芽孢杆菌13.311171〇1丨9116€3(^6118乂!1-八卩〇; 所述构建解淀粉芽抱杆菌Bacillus amyloliquefaciens XH7-Ap〇-purF_217 :PCR扩 增解淀粉芽孢杆菌DSM7菌株purF基因，然后通过融合PCR将purF基因217位氨基酸突变 由原来的亮氨酸突变为异亮氨酸，融合PCR扩增产物连接入pKS2质粒基因，最后将重组的 pKS2质粒转化入解淀粉芽孢杆菌B. amyloliquefaciensXH-Δρο,经过同源重组，得到解淀 粉芽抱杆菌 Bacillusamyloliquefaciens XH7- Λ p〇-purF_217〇
5. 利用权利要求4所得解淀粉芽孢杆菌工程菌生产鸟苷的方法，其特征在于包括以下 步骤：将解淀粉芽抱杆菌 Bacillusamyloliquefaciens XH7- Λ po-purF-217 在 37°C的固 体活化培养基中培养24?36h，得到活化的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amylol iquefaciens XH7- Λ p〇-purF-217 ;然后将活化的解淀粉芽孢杆菌 Bacillus amyloliquefaciens XH7-Λ po-purF-217以单菌落接入摇瓶种子培养基，37 °C培养6?7h，按体积比10 %的 接种量接种到摇瓶发酵培养基中，37°C发酵60?72h，将发酵液加热、离心，将上清液过 0. 22 μ m的膜HPLC检测鸟苷含量。
6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述固体活化培养基成分（重量百分比）： 1%蛋白胨，1%氯化钠，0.5%酵母抽提物，1%葡萄糖，1.5%琼脂，余量为水；摇瓶种子培养 基成分（重量百分比）：葡萄糖1.5%，蛋白胨1%，酵母膏0.5%，NaClO. 5%，余量为水， PH7. 2 ;摇瓶发酵培养基成分（重量百分比）：葡萄糖8%，硫酸镁0.6%，酵母粉0.8%，硫酸 二氢钾0. 15%，硫酸铵1.0%，氯化钾0. 15%，味精1.6%，碳酸钙0.3%，余量为水，pH7. 2。
【文档编号】C12R1/07GK104232674SQ201410336004
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年7月15日 优先权日:2014年7月15日
【发明者】廖瑜玲, 谢畅丰, 李红, 潘力, 谢清华 申请人:广东肇庆星湖生物科技股份有限公司, 华南理工大学