出芽短梗霉苹果酰辅酶a连接酶及其重组表达载体和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.10所示，含有439位氨基酸，cDNA序列如SEQ?ID?NO.9所示，基因组序列如SEQ?ID?NO.8所示，将cDNA序列经重组表达后能够获得分子量约为68kDa的重组蛋白，经酶学性质检测发现，重组表达的苹果酰辅酶A连接酶的活性为0.176U，最适反应温度为25℃，最适pH为8.0，最适ATP底物浓度为0.2mM，并且具有较广的底物选择性，可以催化不同单体苹果酸、草酸、草酰乙酸、琥珀酸、柠檬酸、丁酸或丙二酸反应，并提高聚苹果酸的产量。
【专利说明】出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶及其重组表达载体和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，具体涉及出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶基因，还涉 及表达苹果酰辅酶A连接酶的重组表达载体和应用。
【背景技术】
[0002] 聚苹果酸（Polymalic acid，PMA)是一种新型的可完全生物降解的聚酯型聚合物， 由于其具有良好的水溶性，生物降解性和生物相容性，可作为药物载体与微胶囊材料、生物 医学材料、吸水材料、化妆品、食品包装等材料，具有广泛的应用前景。
[0003] 聚苹果酸主要由出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans)发酵生产，对聚苹果 酸的生物合成途径研究表明，聚苹果酸是以TCA循环产生的苹果酸为底物进行合成。然 而，迄今为止，以苹果酸为单体聚合生产聚苹果酸的聚合途径及相关基因尚未阐明。基于 前期文献调研，聚苹果酸的聚合途径可能涉及两个酶即苹果酰辅酶A连接酶（malate-CoA ligase，Mcl)和聚苹果酸合成酶（polymalic acid synthase, Pas)参与反应，但是相关基 因及序列在A. pullulans中未见报道，苹果酰辅酶A连接酶在ATP及辅酶A参与下，实现对 单体苹果酸的酰基化，聚苹果酸合成酶催化聚合反应。微生物产生的聚酯型聚合物通常需 要对单体酰基活化后，在聚合酶的催化作用下生产聚合物（Biomacromolecules, 2012, 13:2 964-2972)。因此，单体酰基活化酶的底物特异性对于聚合单体的选择及新型共聚物材料的 创制具有重要意义。本发明首次从真核生物出芽短梗霉中克隆得到苹果酰辅酶A连接酶基 因，对实现出芽短梗霉代谢工程改造及提高聚苹果酸合成产率具有重要意义。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶；本发明 的目的之二在于提供表达出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶的重组表达载体；本发明的目的 之三在于提供出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶在催化单体中的应用；本发明的目的之四在 于提供出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶在出芽短梗霉中提高聚苹果酸产量中的应用。
[0005] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0006] 1.出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶，所述苹果酰辅酶A连接酶的氨基酸序列如SEQ ID N0. 10 所示。
[0007] 优选的，编码所述苹果酰辅酶A连接酶的cDNA如SEQ ID NO. 9所示。
[0008] 优选的，所述苹果酰辅酶A连接酶的基因组序列如SEQ ID NO. 8。
[0009] 2.表达所述出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶的重组表达载体。
[0010] 优选的，所述重组表达载体由SEQ ID N0. 9所示序列连入pET32a (+)载体的BamH I和Hind III酶切位点而得。
[0011] 3.所述的出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶在催化单体与辅酶A反应中的应用，所 述单体为苹果酸、草酸、草酰乙酸、琥珀酸、柠檬酸、丁酸、丙二酸中的应用。
[0012] 优选的，出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶在催化苹果酸与辅酶A生成苹果酰辅酶 A中的应用。
[0013] 4、所述的出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶在出芽短梗霉中提高聚苹果酸产量中 的应用。
[0014] 本发明的有益效果在于：本发明首次从真核生物出芽短梗霉克隆了编码苹果酰 辅酶A的基因组序列和cDNA序列，经比对发现，出芽短梗霉同褐螺菌属Phaeospirillum molischianum苹果酰辅酶A连接酶编码氨基酸同源性为51 %，同红杆菌属Rhodobacter capsulatus苹果酰辅酶A连接酶氨基酸同源性49%，表明本发明克隆得到的苹果酰辅酶A 连接酶为一种新酶蛋白，本发明还公开了将表达苹果酰辅酶A连接酶的重组载体，将苹果 酰辅酶A连接酶重组表达后最适反应温度为25°C，但在20-40°C条件下均具有较好的催化 活性；最适酶促反应pH为8. 0,且在高浓度的ATP下对酶活性具有抑制作用，经苹果酰辅酶 A连接酶单体选择性实验表明，出芽短梗霉来源的苹果酰辅酶A连接酶具有较宽的底物选 择性，草酸、草酰乙酸、琥珀酸、柠檬酸、丁酸、丙二酸等均可作为该酶的催化底物。因此，本 发明获得的苹果酰辅酶A连接酶可作为新型共聚物材料聚合的起始酶，开发新型高分子可 降解材料。本发明还发现在出芽短梗霉中过表达出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶能够提高 聚苹果酸的产量，为通过代谢工程提高聚苹果酸的产量提供了有力工具。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0016] 图1为苹果酰辅酶A连接酶SDS-PAGE分析结果图。
[0017] 图2为温度对苹果酰辅酶A连接酶活力的影响。
[0018] 图3为pH对苹果酰辅酶A连接酶活力的影响。
[0019] 图4为ATP浓度对苹果酰辅酶A连接酶的影响。
[0020] 图5为苹果酰辅酶A连接酶对不同底物的选择性。
[0021] 图6为重组质粒pBARGPEl-Mcl酶切验证结果图。
【具体实施方式】
[0022] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等 著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0023] 本发明通过生物信息学分析，根据苹果酰辅酶A连接酶基因的保守序列，设计兼 并引物，从出芽短梗霉中克隆得到聚苹果酸聚合途径中的苹果酰辅酶A连接酶的核心片 段，采用IPCR的方法成功克隆到了 cDNA全长基因，并纯化该酶，研究其酶学特性及功能验 证。
[0024] 实施例1、苹果酰辅酶A连接酶基因的克隆
[0025] 利用生物信息学分析NCBI中已报道的苹果酰辅酶A连接酶基因序 列，序列来自莫氏褐螺菌（Phaeospirillum molischianum，WP_002730336);布 鲁氏菌（Brucell， WP_0〇85〇3553a);荚膜红细菌（Rhodobacter capsulatus， WP_013066464);深红红螺菌（Rhodospirillum rubrum，WP_011388966);脱氮副球 菌（Paracoccus denitrificans，WP_01174690);将序列进行比对分析后在保守区设计 兼并引物，上游引物为：5'-argghggtatggacattgagg-3'（SEQIDN0·l)，下游引物为： 5，-ccrccraaratgttgacraag-3，(SEQ ID NO. 2)，其中 r = a/g，y = c/t，m = a/c，k = g/ t，s = c/g,w = a/t,h = a/c/t,b = c/g/t, v = a/c/g, d = a/g/t,n = a/c/g/t),然后以 出芽短梗霉（Aureobasidium pullans)CCTCC N0:M2012223基因组为模板，进行PCR扩增， 扩增条件为：94°C预变性5min ;94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸3〇8,30个循环；721： 后延伸lOmin ;25°C保温lOmin。然后将PCR产物经琼脂糖电泳，并回收目的片段，回收产物 连接PMD19-T Vector，经测序获得如SEQ ID NO. 3所示序列，记为苹果酰辅酶A连接酶基因 核心片段，该片段为666bp的核苷酸片段。
[0026] 然后根据IPCR原理，设计扩增苹果酰辅酶A连接酶全长的引物，具体如表1所示：
[0027] 表1.IPCR引物序列
【权利要求】
1. 出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶，其特征在于：所述苹果酰辅酶A连接酶的氨基酸 序列如SEQ ID NO. 10所示。
2. 根据权利要求1所述的出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶，其特征在于：编码所述苹 果酰辅酶A连接酶的cDNA如SEQ ID NO. 9所示。
3. 根据权利要求1所述的出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶，其特征在于：所述苹果酰 辅酶A连接酶的基因组序列如SEQ ID NO. 8。
4. 表达权利要求1-3任一项所述出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶的重组表达载体。
5. 根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体由SEQ ID NO. 9所示序列连入pET32a(+)载体的BamH I和Hind III酶切位点而得。
6. 权利要求1-3任一项所述的出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶在催化单体与辅酶A反 应中的应用，所述单体为苹果酸、草酸、草酰乙酸、琥珀酸、柠檬酸、丁酸或丙二酸。
7. 权利要求1-3任一项所述的出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶在出芽短梗霉中提高聚 苹果酸产量中的应用。
【文档编号】C12N9/00GK104099302SQ201410345101
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月18日 优先权日:2014年7月18日
【发明者】邹祥, 吴小燕, 涂光伟 申请人:西南大学