一种检测肠癌热点基因突变位点的组合物及其使用方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测肠癌热点基因突变位点的组合物，所述组合物包括SEQ?NO：1至SEQ?NO：17的引物序列，还包括SEQ?NO：18至SEQ?NO：21的block序列。本发明对肠癌相关突变的检测方法具有特异性强、灵敏度高、受污染小、操作简单快速、安全性等优点，检测结果具有较好的准确性和重复性，尤其适合从血浆等体液中检测肠癌驱动基因的热点突变，可以实时、无创地对肠癌患者进行诊断，复发监控和疗效评估，具有重要的价值。
【专利说明】
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因检测领域，特别是涉及检测肠癌驱动基因热点突变的组合物。 -种检测肠癌热点基因突变位点的组合物及其使用方法
【背景技术】
[0002] 肠癌是结直肠癌和直肠癌的总称，大肠癌的发病率从高到低依次为直肠、乙状结 肠、盲肠、升结肠、降结肠及横结肠，近年有向近端（右半结肠）发展的趋势。肠癌的发病与 生活方式、遗传、大肠腺瘤等关系密切。
[0003] 研究发现，肠癌的发生与KRAS、BRAF、PIK3CA热点基因的突变有很大的关系。 K-ras基因位于12号染色体短臂上，35kb，属于Ras基因家族的一员。在Ras基因中，K_Ras 对人类癌症影响最大，它好像分子开关：正常时能控制调控细胞生长的路径；发生异常时， 则导致细胞持续生长，并阻止细胞自我毁灭。它参与细胞内的信号传递，当K-ras基因突变 时，该基因永久活化，不能产生正常的ras蛋白，使细胞内信号传导紊乱，细胞增殖失控而 癌变。K-ras基因检测是目前医生了解大肠癌患者癌基因状况最直接、最有效的方法。看 K-ras基因有没有突变，可以筛选出抗EGFR(表皮生长因子受体）靶向药物治疗有效的大肠 癌患者，实现肿瘤病人的个体化治疗，从而延长患者生存期。BRAF基因基因编码一种丝/苏 氨酸特异性激酶，参与调控细胞内多种生物学事件，如细胞生长、分化和凋亡等。在结直肠 癌患者中，BRAF基因突变率为15%，美国国家癌症综合治疗联盟《结直肠癌临床实践指南》 (V3. 2011)建议，在使用爱必妥或帕尼单抗等靶向药物时，须检测肿瘤组织KRAS基因状态， 如果KRAS无突变，应考虑检测BRAF基因状态。磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K)是EGFR下游信号 分子，可被生长因子受体酪氨酸激酶（如EGFR)激活，使丝/苏氨酸激酶（AKT)磷酸化产生 多种生物学效应，包括调节细胞增殖、存活和细胞周期调控等。研究发现PIK3CA基因产生 突变与结肠癌等多种癌症发病存在相关性，32%的结肠癌患者体内基因 PIK3CA存在突变 而在成胶质细胞瘤、胃癌、乳腺癌和肺癌患者中，该基因存在突变的比例分别为 8%和4%。NRAS基因是RAS基因家族中的一员，参与细胞内的信号传递。目前，应用于肠 癌靶向治疗的药物主要有爱必妥（默克公司）和帕尼单抗（安进公司），然而靶向药物在不 同患者中有不同的疗效，有效率约为20?50%。通过对肠癌患者进行靶基因突变检测，能 够科学的判断该病人能否适应靶向药物治疗，指导病人用药，实现病人的个体化医疗。
[0004] 目前检测基因突变的方法主要有以下几种：
[0005] (1)直接测序法。直接测序法是运用探针进行PCR扩增并对扩增产物进行测序和 TA克隆并再次测序以最终确定突变的碱基位置。该方法比较繁琐、耗时长，而且由于自身的 限制导致其灵敏度不高，只能对含量大于20 %的基因突变进行检测。因此，此法不适合在临 床中的应用与大量的临床样本分析。
[0006] (2)变性高效液相色谱法（DHPLC)。该方法的原理是基于发生错配的杂合双链DNA 与完全匹配的纯合双链DNA解链特征的差异将他们分离开。通过洗脱峰的不同判断有无突 变存在。DHPLC可检测出含有单个检测的突变、插入或者缺失的异源双链片段。该法对已知 和未知的突变位点均可以检测，敏感性在5%左右，但检测过程中需要打开反应管，容易造 成污染，而且阳性结果不能确认其具体未知，最终还需测序确认。
[0007] (3)高分辨率熔解曲线（HRM)。高分辨率熔解曲线是基于核酸的物理性质，通过饱 和染料结合于PCR扩增产物，监控产物熔解曲线的变化分析基因突变。检测敏感性在5%左 右，对于阳性结果并不能确定其具体位置，最终还需要通过测序加以确认。
[0008] (4)探针扩增阻滞突变法（ARMS)。利用PCR引物的3'端末位碱基必须与其模板 DNA互补才能有效扩增的原理，设计针对突变位点的特异性PCR扩增引物，在严格的条件 下，只有在引物3'碱基与模板配对时PCR扩增反应才能正常进行，从而检测出突变。通过 设计两个5'端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补，对于纯和性突变，分别加 入两种引物及3'端引物进行两个平行的PCR，结合有与突变DNA完全互补的引物才可以延 伸并得到PCR扩增产物，该检测方法的灵敏度在1 %左右。
[0009] (5)等位基因特异的Taqman聚合酶链式反应（CAST-PCR)。CAST-PCR法采用优化 TaqMan探针，通过一段特异设计的MGB探针来阻止引物与野生型DNA结合，选择性的优先扩 增突变型DNA，该检测方法的灵敏度在0. 1?1%左右。
[0010] 但这些技术的灵敏度都不高，检测的特异性差，误诊率高，不能满足对肠癌检测的 需求。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的是提供一种肠癌热点基因无创检测的组合物，该组合物及其使用方 法特异性强且灵敏度高。
[0012] 为达上述目的，本发明的技术方案是：一种检测肠癌热点基因突变位点的组合物， 所述组合物包括SEQ N0 :1至SEQ N0 :17的引物序列，还包括SEQ N0 :18至SEQ N0 :21的 block序列。
[0013] 其中，所述组合物在用于PCR扩增时的反应体系为：1?10XPCR缓冲液、0. 1? ImM dNTPs、0.1 ?luM正向引物、0.1 ?ΙμΜ反向引物、0.1 ?2μΜ block、0.05?2ng/ μ L 模版 DNA、Eva Green 染料 0· 5 ?2 μ L、0. 01 ?0· 10U/ μ 1 TaqDNA 聚合酶、1 ?5mM 氯 化镁。
[0014] 其中，所述block序列为PCR扩增反应中所用，是一段与野生型DNA序列完全匹配 的可偏向性扩增突变DNA序列的突变型特异性引物。
[0015] 其中，所述模板DNA浓度可以低至0. 1?lng/μ L。
[0016] 其中，所述肠癌热点基因为KRAS、BRAF、PIK3CA基因野生型和KRAS、BRAF、PIK3CA 基因突变型。
[0017] 其中，所述 KRAS、BRAF、PIK3CA 基因包含 G12R、G12S、G12C、G12A、G12D、G12V、G13D、 E542K、E545K、E545D、H1047L、H1047R、H1047、V600E。
[0018] 本发明还提供了一种检测肠癌热点基因突变位点的组合物的使用方法，所述使用 方法的步骤为：
[0019] 第一步：将待测样品、阴性质控品、阳性质控品和无模版对照进行PCR扩增反应， 其中所述PCR扩增反应以待测DNA为模板，设计针对目的基因突变位点的特异性引物，同时 加入LNA锁核酸修饰，通过对待测DNA样品中的目的基因进行偏向性PCR扩增反应；
[0020] 第二步：根据仪器检测结果中Ct值和MeltCure的判读，判断所述待测样品中目的 基因的突变情况。
[0021] 其中，通过PCR扩增反应结果中扩增曲线和熔解曲线主峰来鉴别DNA特定突变。
[0022] 其中，所述根据Ct值和MeltCure的判读来判断待测样品中目的基因的突变情况， 其具体步骤为：
[0023] 1).运行CT值的计算，无模板对照应无特异扩增，或仅引物二聚体导致的荧光信 号增强；当Ct值> 45. 0时，表明无模板对照有微弱的扩增，对试验的影响极微，可以继续分 析试验情况；
[0024] 2).运行内控，一般Ct值< 40. 0,可以继续分析，如果Ct值彡40. 0,则说明样品 DNA降解严重，不适合试验需要；
[0025] 3).运行阳性质控品，阳性质控的Ct值<45.0,熔解曲线最高峰的Tm值在相应突 变的范围内，说明试验体系正常，可以继续分析试验结果；
[0026] 4).符合上述条件，运行Tm calling程序，通过烙解曲线分析和Ct值，判读样本是 否存在突变：运行Tm calling程序，若样本熔解曲线最高峰的Tm值在相应突变的范围内， 并且Ct<45,表明扩增区段发生突变；若样本存在以下三种情况之一，则判断为阴性：a，无 扩增；b，有扩增，Ct > 45 ;c，有扩增，Ct < 45,但是运行Tm calling程序，熔解曲线最高峰 的Tm值不在相应突变的范围内；
[0027] 5).如果不符合上述第1、3项要求，建议重做本次实验；如果不符合第2项要求， 建议重新从样本中提取DNA，再次检测。
[0028] 其中，所述待测样品为人类基因组DNA，所述阳性质控品为含有KRAS、BRAF、 PIK3CA基因突变的混合质粒或者纯合质粒，所述阴性质控品为不含有KRAS、BRAF、PIK3CA 基因突变的混合质粒或者纯合质粒。
[0029] 其中，所述待测DNA样品为人类正常DNA、细胞DNA、肿瘤组织基因组DNA、外周血细 胞DNA、外周血血清或血浆DNA、体液DNA或排泄物细胞DNA。
[0030] 其中，所述肠癌热点基因为KRAS、BRAF、PIK3CA基因野生型和KRAS、BRAF、PIK3CA 基因突变型。
[0031] 其中，所述 KRAS、BRAF、PIK3CA 基因包含 G12R、G12S、G12C、G12A、G12D、G12V、G13D、 E542K、E545K、E545D、H1047L、H1047R、H1047、V600E。
[0032] 其中，所述样品的DNA浓度可以低至0. 1?lng/μ L。
[0033] 其中，所述PCR扩增反应的具体过程分为2个阶段：
[0034] (1)扩增反应，92?97°C预变性5?15分钟，聚合酶链式反应扩增阶段，92?97°C 变性10?20s，50?65°C退火10?30s，70?75°C延伸10?35s，并进行35?55个循 环；
[0035] (2)做熔解曲线，92?97°C预变性0· 2?5分钟，20?55°C退火0· 2?5分钟， 60?97°C采集荧光，每秒采集荧光10?30次。
[0036] 本发明所用引物序列和block序列如表1和表2所示。
[0037] 表1 KRAS、BRAF、PIK3CA热点基因检测引物序列
[0038]
【权利要求】
1. 一种检测肠癌热点基因突变位点的组合物，其特征在于，所述组合物包括SEQ NO :1 至SEQ NO :17的引物序列，还包括SEQ NO :18至SEQ NO :21的block序列。
2. 如权利要求1所述的检测肠癌热点基因突变位点的组合物，其特征在于，所述组合 物在用于PCR扩增时的反应体系为：1?10XPCR缓冲液、0. 1?ImM dNTPs、0. 1?luM正 向引物、〇· 1 ?1 μΜ反向引物、0· 1 ?2μΜ block、0. 05 ?2ng/y L 模版DNA、Eva Green染 料 0· 5 ?2 μ L、0. 01 ?0· 10U/ μ 1 TaqDNA 聚合酶、1 ?5mM 氯化镁。
3. 如权利要求1或2所述的检测肠癌热点基因突变位点的组合物，其特征在于，所述 block序列为PCR扩增反应中所用，是一段与野生型DNA序列完全匹配的可偏向性扩增突变 DNA序列的突变型特异性引物。
4. 如权利要求1?3所述的检测肠癌热点基因突变位点的组合物的使用方法，其特征 在于，所述使用方法的步骤为： 第一步：将待测样品、阴性质控品、阳性质控品和无模版对照进行PCR扩增反应，其中， 所述PCR扩增反应以待测DNA为模板，设计针对目的基因突变位点的特异性引物，同时加入 LNA锁核酸修饰，通过对待测DNA样品中的目的基因进行偏向性PCR扩增反应； 第二步：根据仪器检测结果中Ct值和MeltCure的判读，判断所述待测样品中目的基因 的突变情况。
5. 根据权利要求4所述的检测肠癌热点基因突变位点的组合物的使用方法，其特征在 于，通过PCR扩增反应结果中扩增曲线和熔解曲线主峰来鉴别DNA特定突变。
6. 根据权利要求4所述的检测肠癌热点基因突变位点的组合物的使用方法，其特征在 于，所述根据Ct值和MeltCure的判读来判断待测样品中目的基因的突变情况，其具体步骤 为： 1) .运行CT值的计算，无模板对照应无特异扩增，或仅引物二聚体导致的荧光信号增 强；当ct值> 45. 0时，表明无模板对照有微弱的扩增，对试验的影响极微，可以继续分析试 验情况； 2) .运行内控，一般Ct值< 40. 0,可以继续分析，如果Ct值彡40. 0,则说明样品DNA降 解严重，不适合试验需要； 3) .运行阳性质控品，阳性质控的Ct值< 45. 0,熔解曲线最高峰的Tm值在相应突变的 范围内，说明试验体系正常，可以继续分析试验结果； 4) .符合上述条件，运行Tm calling程序，通过熔解曲线分析和Ct值，判读样本是否 存在突变：运行Tm calling程序，若样本熔解曲线最高峰的Tm值在相应突变的范围内，并 且Ct < 45,表明扩增区段发生突变；若样本存在以下三种情况之一，则判断为阴性：a，无扩 增；b，有扩增，Ct > 45 ;c，有扩增，Ct < 45,但是运行Tm calling程序，熔解曲线最高峰的 Tm值不在相应突变的范围内； 5) .如果不符合上述第1、3项要求，建议重做本次实验；如果不符合第2项要求，建议 重新从样本中提取DNA，再次检测。
7. 根据权利要求4所述的检测肠癌热点基因突变位点的组合物的使用方法，其特征在 于，所述待测样品为人类基因组DNA，所述阳性质控品为含有KRAS、BRAF、PIK3CA基因突变 的混合质粒或者纯合质粒，所述阴性质控品为不含有KRAS、BRAF、PIK3CA基因突变的混合 质粒或者纯合质粒。
8. 根据权利要求4所述的检测肠癌热点基因突变位点的组合物的使用方法，其特征在 于，所述待测DNA为人类正常DNA、细胞DNA、肿瘤组织基因组DNA、外周血细胞DNA、外周血 血清或血浆DNA、体液DNA或排泄物细胞DNA。
9. 根据权利要求4所述的检测肠癌热点基因突变位点的组合物的使用方法，其特征在 于，所述肠癌热点基因为KRAS、BRAF、PIK3CA基因野生型和KRAS、BRAF、PIK3CA基因突变型。
10. 根据权利要求9所述的检测肠癌热点基因突变位点的组合物的使用方法，其特征 在于，所述 KRAS、BRAF、PIK3CA 基因包含 G12R、G12S、G12C、G12A、G12D、G12V、G13D、E542K、 E545K、E545D、H1047L、H1047R、H1047、V600E。
11. 根据权利要求4所述的检测肠癌热点基因突变位点的组合物的使用方法，其特征 在于，所述样品的DNA浓度可以低至0. 1?Ing/yL。
12. 根据权利要求4所述的检测肠癌热点基因突变位点的组合物的使用方法，其特征 在于，所述PCR扩增反应的具体过程分为2个阶段： (1) 扩增反应，92?97°C预变性5?15分钟，聚合酶链式反应扩增阶段，92?97°C变 性10?20s，50?65°C退火10?30s，70?75°C延伸10?35s，并进行35?55个循环； (2) 做熔解曲线，92?97°C预变性0· 2?5分钟，20?55°C退火0· 2?5分钟，60? 97 °C采集荧光，每秒采集荧光10?30次。
【文档编号】C12N15/11GK104099422SQ201410345693
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月18日 优先权日:2014年7月18日
【发明者】王弢, 李宗飞, 张利清, 张丽, 乐飚, 徐维琛 申请人:普世华康江苏医疗技术有限公司