一种重组trail蛋白及其制备方法和用途
【专利摘要】本发明公开了一种核酸片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明公开了前述核酸片段编码的重组蛋白及其制备方法和用途。本发明还公开PEG修饰重组蛋白的结合物及其制备方法和用途。本发明重组蛋白的抗肿瘤效果明显，与蛋白酶体抑制剂联合使用更可以发挥协同增效租用，经PEG修饰后，在保留抗肿瘤药效果的同时，稳定性提高，半衰期延长，应用前景良好。
【专利说明】-种重组TRAIL蛋白及其制备方法和用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种重组TRAIL蛋白及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNFrelatedapoptosis-inducing ligand，TRAIL)，又称凋亡素2配体，是近几年发现的可诱导肿瘤细胞凋亡的TNF家族成员， 其通过与不同受体的结合，发挥对肿瘤细胞的选择性杀伤作用。TRAIL的膜受体共有四类， 包括DR4、DR5、DcRl和DcR2,其中，DR4和DR5是死亡受体（deathrec印tor)，高表达于肿 瘤细胞，其分子内含有死亡结构域，当TRAIL与其结合后，会通过其死亡结构域传递信号而 诱导细胞凋亡；DcRl和DcR2为诱骗受体（decoyreceptor)，高表达于正常细胞，其同样具 有结合TRAIL的能力，但分子内不含死亡结构域，TRAIL与其结合后不能够向胞内传递死亡 信号而诱导细胞凋亡。因此，TRAIL具有对肿瘤的选择性杀伤作用，是一种优良的抗肿瘤药 物。
[0003] 目前，已有关于重组TRAIL的研究，但是它们存在不稳定、半衰期短的问题。
【发明内容】
[0004] 为了解决上述问题，本发明提供了一种新的的重组恒河猴TRAIL蛋白（mmTRAIL) 及其PEG修饰结合物。
[0005] 本发明核酸片段，其核苷酸序列如SEQIDN0 :1所示。
[0006] 本发明重组载体，它包含核苷酸序列如SEQIDN0 :1所示的核酸片段。优选地，所 述的重组载体是重组PQE30质粒。
[0007] 本发明重组菌，它包含前述重组载体。优选地，所述的重组菌为重组大肠杆菌。
[0008] 本发明蛋白质，它由核苷酸序列如SEQIDN0 :1所示核酸片段编码。
[0009] 其中，其氨基酸序列如SEQIDN0 :2所示。
[0010] 本发明种制备前述蛋白质的方法，其特征在于：包含如下步骤：
[0011] i、取前述的重组菌，接种到培养基上培养至菌液〇D_ = 0. 1?1 ;
[0012] ii、加入诱导剂，诱导培养6?20h，离心，收集菌体，裂解，收集上清，分离纯化，即 可。
[0013] 步骤i中，所述培养基为LB培养基；培养的温度为37°C;接种后，培养至菌液0D_ =0? 5〇
[0014] 步骤ii中，所述诱导剂为0. 05?0. 15mMIPTG以及100?300iiM的ZnS04 ;所述诱 导培养的温度为28°C。优选地，步骤ii中，所述诱导剂为0.ImMIPTG以及200iiM的ZnS04。
[0015]步骤ii中，所述分离纯化采用凝胶层析，其中，洗涤液是含有300mMNaCl、和40mM 咪唑的溶液，洗脱液是含有300mMNaCl和300mM咪唑的溶液。
[0016] 本发明提供了前述的蛋白质在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
[0017] 其中，所述治疗肿瘤的药物是治疗结肠癌、脑星形胶质母细胞瘤、肝癌或肺癌的药 物。
[0018] 本发明还提供了前述的蛋白质与蛋白酶体抑制剂在制备治疗肿瘤的联合用药物 中的用途。
[0019] 其中，所述蛋白酶体抑制剂是Bortezomib。
[0020] 蛋白酶体（proteasomes)是在真核生物和古菌中普遍存在的，在一些原核生物中 也存在的一种巨型蛋白质复合物，主要作用是降解细胞不需要的或受到损伤的蛋白质，而 蛋白酶体抑制剂即与蛋白酶体结合使其失去活性的物质。
[0021] Bortezomib是一种蛋白酶体抑制剂。
[0022] 所述蛋白质与蛋白酶体抑制剂的摩尔比为：蛋白质0. 1?100份，蛋白酶体抑制剂 5?50份。优选地，所述蛋白质与蛋白酶体抑制剂的摩尔比为：蛋白质0. 5?100份，蛋白 酶体抑制剂25?50份。
[0023] 本发明联合用药物，它包含不同规格的单位制剂，用于同时、分别或者依次给前述 的蛋白质与蛋白酶体抑制剂，以及药学上可接受的载体。
[0024] 其中，所述蛋白酶体抑制剂是Bortezomib。
[0025] 其中，所述蛋白质与蛋白酶体抑制剂的摩尔比为：蛋白质0. 1?100份，蛋白酶体 抑制剂5?50份。优选地，所述蛋白质与蛋白酶体抑制剂的摩尔比为：蛋白质0.5?100 份，蛋白酶体抑制剂25?50份。
[0026] 一种蛋白聚乙二醇结合物，它由聚乙二醇对前述蛋白进行单点修饰得到，其中，每 个蛋白分子上共价结合一个聚乙二醇分子，聚乙二醇分子的分子量为5000?20000Da。
[0027] 所述聚乙二醇为mPEG-丁醛。
[0028] 所述聚乙二醇分子的分子量为10000?20000Da。
[0029] -种制备前述蛋白聚乙二醇结合物的方法，其特征在于：包括如下步骤：
[0030] 1)取前述蛋白，制成浓度为1?10mg/ml的蛋白溶液，透析于包含50mMNaAc_HAc、 30% (v/v)甘油和40iiM硫酸锌的醋酸盐缓冲液中，所述缓冲液的pH为5.0,透析过夜后加 入2M硼氢化钠溶液至终浓度为20mM;
[0031] 2)加入聚乙二醇，所述聚乙二醇的量为蛋白摩尔量的1?10倍，反应6?18h，反 应温度为2?10°C;
[0032] 3)分离纯化，即可。
[0033] 步骤（1)中，所述蛋白溶液的浓度为5. 5mg/ml。
[0034] 步骤⑵中，所述聚乙二醇为mPEG-丁醛；所述蛋白与聚乙二醇摩尔比为1:5 ;所 述反应的时间为12h，反应温度为4°C。
[0035] 步骤（3)中，采用阳离子交换柱分离纯化。
[0036] 本发明还提供了前述蛋白聚乙二醇结合物在制备治疗肿瘤的药物中的用途。其 中，所述治疗肿瘤的药物是治疗结肠癌、脑星形胶质母细胞瘤、肝癌或肺癌的药物。
[0037] 本发明重组蛋白抗肿瘤效果明显，其与蛋白酶体抑制剂联合使用可以发挥协同增 效的作用，治疗肿瘤的效果优良，同时，其经PEG修饰得到单点修饰的PEG结合物，抗肿瘤活 性高，稳定性强，体内半衰期长，既能方便使用，降低使用成本，也提高了使用安全性，具有 极好的市场前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0038] 图ImmTRAIL基因扩增。（M:DNA分子量标准1:mmTRAILPCR产物）
[0039] 图2pQE30-mmTRAIL质粒的双酶切鉴定。（M:DNA分子量标准；1 :质粒酶切产物）
[0040] 图3mmTRAIL在大肠杆菌M15中的诱导表达及纯化。
[0041] (M:蛋白分子量标准；1 :诱导前细菌总蛋白；2 :诱导后细菌总蛋白；3 :破菌上清 蛋白；4 :破菌沉淀蛋白；5 :纯化后蛋白；6:Westernblot。
[0042] 图4mmTRAIL蛋白凝胶过滤层析
[0043] 图5mmTRAIL对肿瘤细胞和正常细胞的杀伤作用比较
[0044] 图6mmTRAIL与Bortizomib对肿瘤细胞杀伤的协同作用
[0045] 图7AnnexinV/PI检测细胞细胞凋亡（图中数字为阳性细胞百分率）
[0046] 图8Caspase抑制剂对mmTRAIL和hTRAIL杀伤活性的抑制
[0047] 图9mmTRAIL瘤内注射抗肿瘤效果
[0048] 图10静脉注射和腹腔注射mmTRAIL的抗肿瘤效果比较
[0049] 图11不同剂量mmTRAIL抗肿瘤效果比较
[0050] 图12SDS-PAGE⑷和HPLC⑶分析不同PEG修饰mmTRAIL的分子量
[0051] 图13PEG修饰对mmTRAIL活性和稳定性的影响
[0052] 图14PEG修饰对mmTRAIL药代动力学的影响
[0053] 图15不同PEG修饰mmTRAIL抗肿瘤效果比较
[0054] 图16mmTRAIL-10K抗肿瘤作用的剂量依赖性
【具体实施方式】
[0055] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内 容所实现的技术均属于本发明的范围。
[0056] 实施例ImmTRAIL蛋白编码基因的克隆
[0057] 1)恒河猴RNA的提取
[0058] 抽取健康恒河猴静脉血，加入装有适量密度梯度分离液的离心管中，室温400g离 心30min。将外周血单个核细胞收集于新离心管中，再加入0. 83%NH4C1，室温静置5min，去 除残留的红细胞。细胞用磷酸盐缓冲液（50mM，pH7. 4)洗涤两次，悬浮于含有100U/ml青霉 素，100mg/ml链霉素，10%胎牛血清的1640培养基，使其细胞密度为106个/毫升。向细胞 中加入5iig/ml的ConA刺激培养2天。收集细胞，向107个细胞中加入1?2ml的RNAiso Plus裂解液。待细胞充分裂解后，12,000g4°C离心5min，弃沉淀。上清中加入RNAisoPlus 液1/5体积的氯仿，剧烈振荡15秒。待溶液充分乳化后，室温静置5分钟，12, 000g4°C离 心15分钟。上清中再加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min，12,000g4°C离心 l〇min，收集沉淀并用lml75%乙醇洗涤。12, 000g4°C离心5min收集沉淀，室温干燥2?5 分钟，再加入适量RNase-free水溶解，S卩获得总RNA。
[0059] 2)RT-PCR扩增
[0060] 以总RNA为模板，用Promega公司提供的PrimeScriptIllstStrandcDNA SynthesisKit合成cDNA。用VectorNTISuite6 软件根据Genbank提供的mmTRAIL基因 序列（XM_001084768)设计引物。为方便将基因克隆入表达载体pQE30,引物中添加相应酶 切位点。
[0061] 上游引物序列为：
[0062]
【权利要求】
1. 一种核酸片段，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
2. -种重组载体，其特征在于：它包含权利要求1所述的核酸片段。
3. 根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述的重组载体是重组pQE30质粒。
4. 一种重组菌，其特征在于：它包含权利要求2或者3所述的重组载体。
5. 根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述的重组菌为重组大肠杆菌。
6. -种蛋白质，其特征在于：它由权利要求1所述的核酸片段编码。
7. 根据权利要求6所述的蛋白质，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
8. -种制备权利要求6或者7所述蛋白质的方法，其特征在于：包含如下步骤： i、 取权利要求4或者5所述的重组菌，接种到培养基上培养至菌液0D_ = 0. 1?1 ; ii、 加入诱导剂，诱导培养6?20h，离心，收集菌体，裂解，收集上清，分离纯化，即可。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤i中，所述培养基为LB培养基；培养 的温度为37°C ;接种后，培养至菌液0D_ = 0. 5。
10. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤ii中，所述诱导剂为0. 05?0. 15mM IPTG以及100?300 ii M的ZnS04 ;所述诱导培养的温度为28°C。
11. 根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述诱导剂为〇. ImMIPTG以及200 y M 的 ZnS04。
12. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤ii中，所述分离纯化采用凝胶层析， 其中，洗涤液是含有300mM NaCl、和40mM咪唑的溶液，洗脱液是含有300mM NaCl和300mM 咪唑的溶液。
13. 权利要求6或者7所述蛋白质在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
14. 根据权利要求13所述的用途，其特征在于：所述治疗肿瘤的药物是治疗结肠癌、脑 星形胶质母细胞瘤、肝癌或肺癌的药物。
15. 权利要求6或者7所述的蛋白质与蛋白酶体抑制剂在制备治疗肿瘤的联合用药物 中的用途。
16. 根据权利要求15所述的用途，其特征在于：所述蛋白酶体抑制剂是Bortezomib。
17. 根据权利要求15所述的用途，其特征在于：所述蛋白质与蛋白酶体抑制剂的摩尔 比为：蛋白质0. 1?100份，蛋白酶体抑制剂5?50份。
18. 根据权利要求17所述的用途，其特征在于：所述蛋白质与蛋白酶体抑制剂的摩尔 比为：蛋白质0. 5?100份，蛋白酶体抑制剂25?50份。
19. 一种联合用药物，其特征在于：它包含不同规格的单位制剂，用于同时、分别或者 依次给权利要求6或者7所述的蛋白质与蛋白酶体抑制剂，以及药学上可接受的载体。
20. 根据权利要求19所述的联合用药物，其特征在于：所述蛋白酶体抑制剂是 Bortezomib。
21. 根据权利要求19所述的联合用药物，其特征在于：所述蛋白质与蛋白酶体抑制剂 的摩尔比为：蛋白质0. 1?100份，蛋白酶体抑制剂5?50份。
22. 根据权利要求21所述的联合用药物，其特征在于：所述蛋白质与蛋白酶体抑制剂 的摩尔比为：蛋白质0.5?100份，蛋白酶体抑制剂25?50份。
23. -种蛋白聚乙二醇结合物，其特征在于：它由聚乙二醇对权利要求6或7所述蛋白 进行单点修饰得到，其中，每个蛋白分子上共价结合一个聚乙二醇分子，聚乙二醇分子的分 子量为5000?20000Da。
24. 根据权利要求23所述结合物，其特征在于：所述聚乙二醇为mPEG- 丁醛。
25. 根据权利要求23所述结合物，其特征在于：所述聚乙二醇分子的分子量为 10000 ?20000Da。
26. -种制备权利要求23?25任意一项所述蛋白聚乙二醇结合物的方法，其特征在 于：包括如下步骤： 1) 取权利要求6或7所述蛋白，制成浓度为1?10mg/ml的蛋白溶液，透析于包含50mM NaAc-HAc和40 ii M硫酸锌的醋酸盐缓冲液中，所述缓冲液的pH为5. 0,透析过夜后加入2M 硼氢化钠溶液至终浓度为20mM ; 2) 加入聚乙二醇,所述聚乙二醇的量为蛋白摩尔量的1?10倍，反应6?18h,反应温 度为2?10°C ; 3) 分离纯化，即可。
27. 根据权利要求26所述的方法，其特征在于：步骤（1)中，所述蛋白溶液的浓度为 5. 5mg/ml 〇
28. 根据权利要求26所述的方法，其特征在于：步骤（2)中，所述聚乙二醇为mPEG-丁 醛；所述蛋白与聚乙二醇摩尔比为1:5;所述反应的时间为12h，反应温度为4°C。
29. 根据权利要求26所述的方法，其特征在于：步骤（3)中，采用阳离子交换柱分离纯 化。
30. 权利要求23?25任意一项所述蛋白聚乙二醇结合物在制备治疗肿瘤的药物中的 用途。
31. 根据权利要求30所述的用途，其特征在于：所述治疗肿瘤的药物是治疗结肠癌、脑 星形胶质母细胞瘤、肝癌或肺癌的药物。
【文档编号】C12N1/21GK104342444SQ201410350752
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2014年7月23日 优先权日:2013年7月23日
【发明者】卢晓风, 杨浩, 贾殿隆, 万琳, 程惊秋 申请人:四川大学华西医院