一种适合微量樱桃叶片dna高效提取方法
【专利摘要】本发明公开了一种适合微量樱桃叶片DNA高效提取方法，属于分子生物学【技术领域】，该方法为：取微量经过变色硅胶充分干燥的樱桃叶片，置于2ml离心管中，用末端经过打磨的直径0.6cm的玻璃棒快速捣碎叶片呈粉末状，然后通过缓冲液洗涤、裂解、抽提、沉淀和检测等步骤，最后得到高浓度和纯度的DNA。本发明取代了传统DNA提取方法中普遍使用的液氮研磨，通过此方法在不使用液氮的情况下依然能够得到高质量的DNA，而且还可以防止材料在液氮研磨过程中的褐化。该方法操作简单，实用方便，效率高，尤其是针对微量珍贵材料的DNA提取具有重要作用。
【专利说明】一种适合微量樱桃叶片DNA高效提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学【技术领域】，具体为一种适合微量樱桃叶片DNA高效提取方 法。
【背景技术】
[0002] 获得高质量（高浓度、高纯度、高完整性）的DNA是分子生物学实验最基础也是最 关键的第一步，目前，已经开发了多种方法，也成功地从植物叶片、愈伤组织、组培苗、果实、 韧皮部等组织器官中提取出DNA。但是对于一些稀缺资源或材料，如植物残存的微量材料， 分子标记辅助育种中后代出生不久的小苗、木本植物杂交F1代苗木早期植株等研究材料 来说均无法获得大量的植物组织材料用于DNA的提取，而导致研究效率较低，研究周期长， 而且还容易造成研究材料的死亡和丢失。
[0003] 樱桃为典型的多年生木本果树作物，其杂交F1代的生长速率极慢，而且当年采收 的种子一般要到第二年才能生长成苗，这些生物学特性极大地阻碍了其在连锁遗传图谱构 建中作图群体DNA的早期获得，以及有些育种相关性状的分子生物学早期鉴定，而延缓了 研究进程。最重要的是有些小苗容易在生长过程中死亡而导致研究材料的丢失。因此如何 在植株早期获得高质量的DAN对于大多数材料的分子生物学研究具有重要意义。
【发明内容】
[0004] 为了解决樱桃在苗期叶片及其它组织材料少而无法获得高质量的基因组DNA用 于后续研究。本发明提供一种适合微量樱桃叶片DNA高效提取方法。采用本发明所述的方 法可以在樱桃幼苗期或者残存微量叶片中获得较多高质量基因组DNA，而且还省略了传统 方法中使用的液氮研磨，降低了提取成本，较少了提取过程中组织材料的氧化。该方法操作 简单、实用方便，效率高，尤其是针对微量珍贵材料的DNA提取具有重要作用。
[0005] 其技术方案为：
[0006] 一种适合微量樱桃叶片DNA高效提取方法，包括以下步骤：
[0007] 1)材料准备：采集新鲜樱桃幼叶片置于封口袋中，按照1 : 20-1 : 50的比例加 入变色硅胶，并充分混匀，直到叶片完全干燥。
[0008] 2)取充分干燥的樱桃叶片0.01-0. 03g置于2ml离心管中，用直径0.6cm前段打磨 成平滑卵头状的玻璃棒快速捣碎干燥叶片至呈粉末状。
[0009] 3)加入1ml缓冲液1和10 μ 1 β -巯基乙醇，充分混合后在在常温下5000rpm离心 3min，弃上清，收集沉淀。
[0010] 4)在沉淀中加入lml65°C预热的3 %的CTAB缓冲液和10 μ 1 β -巯基乙醇，65°C水 浴lh，期间每隔5-10min颠倒离心管以使液体混勻，然后26?下12500rpm离心lOmin ;
[0011] 5)取上清液转入新的2. 0ml的离心管中，加入等体积的氯仿，轻摇萃取，在5°C下 12500rpm 离心 lOmin ;
[0012] 6)上清液转入新的2. Oml离心管中，重复步骤5);
[0013] 7)取上清液约600 μ 1转入新的1. 5ml离心管中，加入2倍体积经-20°c预冷的无 水乙醇和1/10体积的3mol/L的醋酸钠，颠倒混勻-20放置30min，llOOOrpm离心15min，弃 上清，收集沉淀；
[0014] 8)在DNA沉淀中加入75%乙醇800 μ 1，轻摇并放置5min，倒掉乙醇，如此清洗两 次，再用无水乙醇清洗一次，置于通风处过夜吹干；
[0015] 9)DNA沉淀用50μ 1 TE溶解，然后加入1μ llOng/μ 1的RNase A，常温过夜后置 于-20°C冰箱保存备用；
[0016] 10)取2μ1溶解的DNA溶液，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，并在Eppend Orf Biophotomete型核酸蛋白质分析仪上检测260nm、280nm处的吸收值和DNA的浓度，并根据 0D 260/0D280值来判断DNA的纯度。
[0017] 步骤1)中所述的樱桃新鲜叶片为无病虫害的叶片，且以幼嫩叶片最佳，对于较少 的叶片材料可以装在通透性较好的茶包中然后置于分口袋中加相应比例的变色硅胶，干燥 材料应轻拿轻放，防止干燥叶片碎裂后无法从变色硅胶中分离出来。
[0018] 步骤2)中所述的玻璃棒应事先打磨好，其前端或两头需打磨成平滑的卵头状，以 便更好的捣碎叶片。
[0019] 步骤3)中所述的缓冲液1为lmol/L氯化钠；0. lmol/L Tris-HCl PH8. 0 ; 0· 02mol/L EDTA ΡΗ8· 0 ;0· 4mol/L 葡萄糖。
[0020] 步骤 4)中所述的 CTAB 缓冲液为 1. 5mol/lNaCl ;0· lmol/L Tris-Hcl ΡΗ8· 0 ; 0. 02mol/L EDTA PH8. 0 ；2% PVP ；3% CTAB〇
[0021] 步骤4)中加入CTAB裂解液后应及时充分摇匀，尽可能的呈悬浮液，水浴过程中隔 3-5min上下轻摇一次，保证裂解充分。
[0022] 步骤7)中沉淀所有无水乙醇最少要加2倍体积，若沉淀液颜色较深的话适量多加 醋酸钠（20-100ul)可有效去除颜色。
[0023] 步骤8)中洗涤沉淀的75%乙醇至少要800 μ 1，洗涤次数可根据情况增加，最后用 无水乙醇洗涤吹干。
[0024] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0025] 本发明旨在克服对于幼苗生长初期无法获得足够的组织材料而无法提取基因组 DNA的难题。采用本发明所述的提取方法流程能从微量叶片材料（O.Olg左右）中高效提取 基因组DNA。所得到的DNA纯度高（0D260/0D280 = L 77-L 94 ;0D260/0D230 = L 95-2. 11)、 完整性和流动性好（可迅速溶解于水或者TE，溶解后不会析出沉淀，溶液不粘稠，1. 0%琼 脂糖凝胶电泳检测片段大于20Kb)。
[0026] 1、本发明所述方法以干燥叶片为提取材料，相较于传统用新鲜或冰冻的幼嫩叶片 来说，该方法对提取材料的要求宽松，可以适合于野外或远距离材料的提取，而且避免了幼 嫩材料在液氮研磨过程中被氧化而变褐，获得的基因组DNA能够满足后续实验要求。
[0027] 2、本发明方法在叶片组织破碎方法上替代了原有的液氮研磨法，可以在只有微量 叶片材料的情况下直接在离心管中破碎材料，即简化了 DNA提取时叶片组织的破碎方法， 避免使用液氮，又可以实现在微量叶片材料的情况下高效地提取基因组DNA。相对于传统的 提取方法既可以节省叶片材料，简化试验步骤，又可以降低提取成本。
[0028] 3、采用本发明的方法可以缩短提取时间至2. 5小时，实验流程相对简化。
【专利附图】
【附图说明】
[0029] 图1是用本发明的方法提取的樱桃的总基因组DNA，经过1. 0%琼脂糖凝胶电泳检 测结果，注：琼脂糖凝胶浓度为1. 〇%，Ml为Markerl，片段从小到大依次为546bp、2027bp、 2322bp、4361bp、9416bp、23130bp，M2 为 Markerl，片段从小到大依次为 100bp、250bp、 500bp、750bp、1000bp、2000bp。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明的技术方案作进一步说明。
[0031] 一种适合微量樱桃叶片DNA高效提取方法，包括以下步骤：
[0032] 1)在野外或田间分别采集新鲜中国樱桃（河南洛阳）、野生中国樱桃（四川北 川）、欧洲甜樱桃（美早，四川汉源）、以及毛樱桃（甘肃平凉）叶片各0.5-1. 0g，幼叶片置 于封口袋中，加入10_50g变色硅胶，并充分混匀，直到叶片完全干燥。
[0033] 2)取充分干燥的樱桃叶片0.01-0. 03g置于2ml离心管中，用直径0.6cm前段打磨 成平滑卵头状的玻璃棒快速捣碎干燥叶片至呈粉末状。
[0034] 3)加入1ml缓冲液1和10 μ 1 β -巯基乙醇，充分混合后在在常温下5000rpm离心 3min，弃上清，收集沉淀。
[0035] 4)在沉淀中加入lml65°C预热的3 %的CTAB缓冲液和10 μ 1 β -巯基乙醇，65°C水 浴lh，期间每隔5-10min颠倒离心管以使液体混勻，然后26?下12500rpm离心lOmin ;
[0036] 5)取上清液转入新的2. 0ml的离心管中，加入等体积的氯仿，轻摇萃取，在5°C下 12500rpm 离心 lOmin ;
[0037] 6)上清液转入新的2. 0ml离心管中，重复步骤5);
[0038] 7)取上清液约600 μ 1转入新的1. 5ml离心管中，加入2倍体积经-20°C预冷的无 水乙醇和1/10体积的3mol/L的醋酸钠，颠倒混勻-20放置30min，llOOOrpm离心15min，弃 上清，收集沉淀；
[0039] 8)在DNA沉淀中加入75%乙醇800 μ 1，轻摇并放置5min，倒掉乙醇，如此清洗两 次，再用无水乙醇清洗一次，置于通风处过夜吹干；
[0040] 9)DNA沉淀用5〇μ 1 TE溶解，然后加入1μ liong/μ 1的RNase A，常温过夜后置 于-20°C冰箱保存备用；
[0041] 10)取2 μ 1溶解的DNA溶液，经1. 0 %琼脂糖凝胶电泳检测（图1，从左往右依次 为中国樱桃、欧洲甜樱桃、野生中国樱桃、毛樱桃各2个）。
[0042] 11)取2 μ 1溶解的DNA溶液稀释50倍后在Eppendorf Biophotomete型核酸蛋白 质分析仪上检测260nm、280nm处的吸收值和DNA的浓度，并根据0D 260/0D 280及0D 260/ 0D230值来判断DNA的纯度。
[0043] 表1供试材料的叶片质量提取的DNA检测信息
[0044]
【权利要求】
1. 一种适合微量樱桃叶片DNA高效提取方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 材料准备：采集新鲜樱桃幼叶片置于封口袋中，按照1 : 20-1 : 50的比例加入变 色硅胶，并充分混匀，直到叶片完全干燥； 2) 取充分干燥的樱桃叶片0. 01-0. 03g置于2ml离心管中，用直径0. 6cm前段打磨成平 滑卵头状的玻璃棒快速捣碎干燥叶片至呈粉末状； 3) 加入lml缓冲液1和10μ 1 β -巯基乙醇，充分混合后在在常温下5000rpm离心 3min，弃上清，收集沉淀； 4) 在沉淀中加入lml65°C预热的3%的CTAB缓冲液和10μ 1 β -巯基乙醇，65°C水浴 lh，期间每隔5-10min颠倒离心管以使液体混勻，然后26°C下12500rpm离心lOmin ; 5) 取上清液转入新的2.0ml的离心管中，加入等体积的氯仿，轻摇萃取，在5°C下 12500rpm 离心 lOmin ; 6) 上清液转入新的2. 0ml离心管中，重复步骤5); 7) 取上清液约600 μ 1转入新的1. 5ml离心管中，加入2倍体积经-20°C预冷的无水乙 醇和1/10体积的3mol/L的醋酸钠，颠倒混勻-20放置30min，llOOOrpm离心15min，弃上 清，收集沉淀； 8) 在DNA沉淀中加入75%乙醇800 μ 1，轻摇并放置5min，倒掉乙醇，如此清洗两次，再 用无水乙醇清洗一次，置于通风处过夜吹干； 9. DNA沉淀用50μ1 TE溶解，然后加入lyllOng/yl的RNase A，常温过夜后置 于-20°C冰箱保存备用； 10) 取2 μ 1溶解的DNA溶液，经1. 0 %琼脂糖凝胶电泳检测，并在Eppendorf Biophotomete型核酸蛋白质分析仪上检测260nm、280nm处的吸收值和DNA的浓度，并根据 OD 260/0D280值来判断DNA的纯度。
2. 根据权利要求1所述的一种适合微量樱桃叶片DNA高效提取方法，其特征在于，步 骤1)中所述的樱桃新鲜叶片为无病虫害的叶片，且以幼嫩叶片最佳，对于较少的叶片材料 可以装在通透性较好的茶包中然后置于分口袋中加相应比例的变色硅胶，干燥材料应轻拿 轻放，防止干燥叶片碎裂后无法从变色硅胶中分离出来。
3. 根据权利要求1所述的一种适合微量樱桃叶片DNA高效提取方法，其特征在于，步 骤2)中所述的玻璃棒应事先打磨好，其前端或两头需打磨成平滑的卵头状，以便更好的捣 碎叶片。
4. 根据权利要求1所述的一种适合微量樱桃叶片DNA高效提取方法，其特征在于，步 骤 3)中所述的缓冲液 1 为 lmol/L 氯化钠；0. lmol/L Tris-HCl PH8. 0 ;0. 02mol/L EDTA PH8. 0 ;0. 4mol/L 葡萄糖。
5. 根据权利要求1所述的一种适合微量樱桃叶片DNA高效提取方法，其特征在于，步 骤 4)中所述的 CTAB 缓冲液为 1. 5mol/lNaCl ;0· lmol/L Tris-Hcl PH8. 0 ;0· 02mol/L EDTA ΡΗ8· 0 ;2% PVP ;3% CTAB。
【文档编号】C12N15/10GK104152435SQ201410360484
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年7月24日 优先权日:2014年7月24日
【发明者】王小蓉, 陈涛, 汤浩茹, 张静, 罗娅, 黄智林, 刘胤 申请人:四川农业大学