一种辅助鉴定大豆抗花叶病毒病基因的方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种辅助鉴定大豆抗花叶病毒病基因的方法及其应用，属于大豆遗传【技术领域】。本发明所提供的方法是从待测大豆中分离提取DNA，通过分子标记SSR64和SG1的引物进行PCR扩增，再利用电泳检测SSR64引物扩增产物中有无标记基因位点条带和/或利用基因分型分析系统分析SG1的引物扩增产物的基因型，确定待测大豆种质资源是否具有抗花叶病毒病基因。利用本发明所提供的方法可实现对大豆花叶病毒病N1毒株的抗性材料的高效选择，加快大豆抗SMV新品系的选育，建立新型大豆杂交亲本选配体系，同时还可以减少人力和物力的浪费，提高育种效率和准确性。
【专利说明】一种辅助鉴定大豆抗花叶病毒病基因的方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种辅助鉴定大豆抗花叶病毒病基因的方法及其应用，属于大豆遗传
【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 大豆（Glycine max)原产于中国，是重要的经济作物。大豆花叶病毒（soybean mosaic virus，SMV)病是危害大豆生产的主要病害之一，严重影响大豆产量和品质。培育 抗病品种是目前控制SMV流行最有效方法。SMV N1株系是东北大豆产区的优势病毒株系之 一，利用分子标记技术定位与N1株系抗性相关基因和紧密连锁的分子标记有益于分子辅 助选择抗性大豆品种的育种实践。
[0003] 国内外学者已经报道过这方面的研究。国外方面，Yu等（1994)鉴定出抗SMV的 单显性基因 Rsvl，定位在大豆分子连锁群F上，得到1个SSR标记HSP176和2个RFLP标 记pA186及pK644a，均与Rsv位点紧密连锁，其遗传距离分别为0. 5cM、l. 5cM和2. lcM。 Imsande(1998)将Rsvl定位于大豆分子连锁群F的抗病基因簇上。Hates等（2000)利用 AFLP 标记筛选出 Rll(518bp)、R12(171bp)、R13(261bp)和 R14(312bp)4 个标记与 Rsvl 连 锁，遗传距离都在3. 5cM以内。Jeong等（2002)在Columbia中发现与Rsvl相独立的单显性 抗SMV基因 Rsv3,将其定位在连锁群B2上。Hayes等（2000)将Rsv4定位在连锁群Dlb+W 上，获得连锁标记Satt542 (4. 7cM)和Satt558 (7. 8cM)。国内方面，郑翠明（2000)用BSA 法筛选出1个与抗性基因有关的RAH)标记0PN980/1070与N3抗性基因连锁，与抗病基因 的遗传距离为2. lcM。刘丽君等（2002)利用黑农39X合丰25的F2群体，筛选出共显性 RAH)标记0PN1400/1300,与黑农39抗病基因的遗传距离为8. 2cM。王永军等（2004)利用 RIL群体鉴定5个SMV株系（Sa、Sc8、Sc9、Nl和N3)，发现5个抗病基因定位在连锁群Dlb+W 上。理论上，与抗病基因的遗传距离小于5cM的分子标记才具有分子辅助选择的应用价值， 以往的研究结果所得到的标记-基因遗传距离较远，应用范围较小。因此，缩小抗病位点的 遗传距离，寻找与抗病位点紧密连锁的分子标记对于提高分子辅助选择的效力具有十分重 要的意义。
【发明内容】
[0004] 为解决上述问题，本发明提供了一种辅助鉴定大豆抗花叶病毒病基因的方法及其 应用，所采取的的技术方案如下：
[0005] 本发明的一个目的在于提供一种辅助鉴定大豆抗花叶病毒病基因的方法，其特征 在于，从待测大豆中分离提取DNA，通过分子标记SSR64和SG1的引物进行PCR扩增，再利用 电泳检测SSR64引物扩增产物中有无标记基因位点条带和/或利用基因分型分析系统分析 SG1的引物扩增产物的基因型，确定待测大豆种质资源是否具有抗花叶病毒病基因。
[0006] 所述方法的步骤如下：
[0007] 1)提取待测大豆样本的DNA ;
[0008] 2)以步骤1)所提取的DNA为模板，通过分子标记SSR64的引物和分子标记SG1的 引物进行PCR扩增；
[0009] 3)利用电泳检测步骤2)所得SSR64的引物的扩增产物和/或利用基因分型分 析系统分析SG1引物扩增产物的基因型，确定待测大豆种质资源是否具有标记基因位点条 带。
[0010] 所述分子标记SSR64的引物如SEQ ID NO. 1-N0. 2所示；所述分子标记SG1的引物 如 EQ ID NO. 3-N0. 4 所示。
[0011] 所述PCR扩增，反应程序为94°C预变性6min，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延 伸30s，35次循环，72°C终延伸5min。
[0012] 所述标记基因位点，编号RsmvNl-2,位于大豆的F连锁群，具体位于抗大豆花叶病 毒病基因共分尚的分子标记SSR64和SG1之间，并与分子标记SSR64和SG1紧密连锁。
[0013] 所述标记基因位点条带，SRR64引物扩增的产物大小为152bp，SG1引物扩增的产 物大小为80bp。
[0014] 所述基因分型分析系统分析，是将SG1引物PCR扩增产物离心后，扫描样品的荧光 信号，扫描起始温度为70°C，结束温度96°C，扫描结束后温度降至67°C，判断扫描所得溶解 曲线是否发生变异。
[0015] 所述方法的具体步骤如下：
[0016] 1)提取待测大?样品叶片中的DNA ;
[0017] 2)以步骤1)所提取的DNA为模板，再分别通过SEQ ID NO. 1-Ν0. 2所示分子标记 SSR64的引物和SEQ ID NO. 3-N0. 4所示分子标记SG1的引物进行PCR扩增，反应程序为 94°C预变性6min，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，35次循环，72°C终延伸5min ;
[0018] 3)利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测步骤2)所得的分子标记SSR64引物的扩增 产物，检测是否含有大小为152bp的条带；
[0019] 4)利用基因分型分析系统分析步骤2)所得的分子标记SG1引物的扩增产物的基 因型，将所得的扩增产物于4000rpm下离心5min，再对样品的荧光信号进行扫描，扫描初始 温度为70°C，结束温度为96°C，扫描结束后降温至67°C，判断扫描所得熔解曲线是否存在 变异。
[0020] 所述方法用于大豆抗花叶病毒病基因的鉴定、筛选和大豆的遗传育种。
[0021] 本发明有益效果如下：
[0022] 本发明通过利用两对引物，以待测单株的基因组DNA为模板对两个标记位点进行 PCR扩增，可实现对大豆花叶病毒病N1毒株的抗性材料的高效选择，加快大豆抗SMV新品系 的选育，建立新型大豆杂交亲本选配体系。
[0023] 本发明可以避免繁琐的表型接种鉴定以及环境对鉴定效果的影响，在子叶期即可 提取基因组DNA和PCR扩增达到单株选择的目的，淘汰感病植株，对后代群体（低世代到高 世代）选择效率均可达到100%，减少人力和物力的浪费，提高育种效率和准确性。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1SMV N1株系的基因位点RsmvNl-1和紧密连锁的分子标记。
[0025] 图2群体部分后代在SSR64位点的PCR扩增结果；
[0026] (10-26 :为被测样品的家系编号）。
[0027] 图3群体部分后代在SG1的PCR扩增产物的熔解曲线；
[0028](图中深色曲线为携带东农93-046等位基因的后代株系，箭头处从上到下曲线所 代表样品的家系编号为1〇、11、12、13和17 ;浅色曲线代表携带conrad等位基因的后代株 系，箭头处从上到下曲线所代表样品的家系编号为14、15、16、18和19)。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0030] 在以下的实施方案中，除非特别说明，否则所有操作均为常规方法。
[0031] 实施例1抗大豆花叶病毒病（SMV)Nl株系的基因位点RsmvNl-2的获得
[0032] 1.重组自交系和F2分离世代群体的构建及SMV N1株系的鉴定
[0033] 用中国大豆栽培品种东农93-046(早）和合丰25( ? )进行杂交，得到杂种F1 ; 由杂种F1代自花授粉获得子代，通过子代单粒传法（SSD)获得130个F2 :6代重组自交系； 利用上述亲本杂交，获得杂种F1并继续自交获得F2分离世代个体共2000粒种子。
[0034] 于2007年、2008年、2009年分别在独立的防蚜网室内对130个株系及亲本进行Ν1 小种的接种鉴定，三次重复。于2013年在独立的防蚜网室内对2000个F2代单株及亲本进 行Ν1小种的接种鉴定，接种方法：采集毒源病叶放入研钵中，加入0. 01mol/L的磷酸缓冲液 (pH = 7. 0) (10ml/g病叶）和600目的金刚砂少许，将病叶研磨成匀浆状。用毛笔蘸取接种 液在对生真叶充分展开时沿叶脉摩擦接种，接种后立即用自来水冲洗叶片表面残渣。分别 于接种后20天和30天调查发病情况。
[0035] 2.遗传图谱构建及抗病基因定位
[0036] 选取在父母本间具有扩增多态性的SSR和SNP引物以130个家系的DNA为模板进 行PCR扩增和基因分型分析，根据SSR标记基因型在群体中的分离及SNP在群体间的基因 分型情况，将母本类型的个体记为"A"，父本类型的个体记为"B"，杂合的和缺失不清的记 为
[0037] 所涉及的实验方法如下：
[0038] DNA提取方法采用改进的SDS法，取0. lg叶片液氮内充分研磨，粉末转入2ml离 心管中，加入 600μ 1 提取缓冲液（0· 1M Tris-HCl pH = 8. 0,0· 05M EDTA pH = 8. 0,0· 5M 恥(：1，1%巯基乙醇）和12(^110%505溶液，651：水浴301^11，加入80(^1酚-氯仿（￥:￥ =1:1)，混勻，轻轻颠倒15-20次，12000r/min离心lOmin，取上清移至新2ml离心管中，力口 等体积氯仿-异戊醇（V:V = 24:1)，混勻，轻轻颠倒15-20次，12000r/min离心10min，取上 清移至新2ml离心管中，加入等体积预冷异丙醇，轻轻颠倒混匀，至出现白色絮状沉淀，静 置10分钟，12000r/min离心lmin，弃上清，沉淀中加700μ 1 70%乙醇吹洗0嫩，重复吹洗 2次后，风干沉淀，加去离子水溶解，备用。
[0039] 用本发明涉及的SNP标记和SSR标记对待测品种（系）DNA模板的PCR扩增方 法：其中SSR标记的PCR反应体系为20μ 1，包括2μ 1基因组DNA(100ng/y 1)，1.5μ 1 MgC12(25mM)，0. 25 μ? dNTP mixtures(10mM)，2yll0XPCR buffer, 3μ1 引物 (2μΜ)，0·25μ1 Taq polymerase(10units/yl)以及 11μ1 去离子水；SNP 标记的 PCR 体系为 10 μ 1，包括 1 μ 1 基因组 DNA(100ng/ μ 1)，1 μ 1 LCGreen plus (Idaho 公司）， 0·75μ1 MgC12(25mM)，0.2yl dNTPmixtures(10mM)，lyll0XPCR buffer，2yl 引物 (2μΜ)，0·2μ1 Taq polymerase(10units/yl)以及 2·85μ1 去离子水。PCR 反应程序 为94°C预变性6min，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，35次循环，72°C终延伸 5min。SSR标记的PCR产物用6 %的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。SNP标记的PCR产物采 用Lightscanner HRM高分辨率熔解曲线突变检测/基因分型分析系统进行分析（Idaho公 司）。具体过程为：
[0040] 1)待PCR扩增反应结束后，用Lightscanner进行基因型分型，先吸取10 μ L的样 品至用于检测的96孔板中，上面覆盖15 μ L的矿物油，以防止样品的挥发，之后将两个96 孔板配平，放入低速离心机中离心，速度：4000rpm，时间：5min。
[0041] 2)对样品的荧光信号进行扫描，设置扫描的起始温度为70°C，结束温度为96°C， 保持温度为67°C。
[0042] 3)判断扫描所得熔解曲线是否发生变异，其中熔解曲线发生变异（即具有溶解曲 线峰的样品携带抗病等位），无熔解曲线发生变异为感病等位。
[0043] 利用Mapmaker/EXP3. 0作图软件，构建分子标记连锁图谱。应用Group命令进行 连锁分析和分组（L0D = 5. 0)，连锁标记少于8个的用Compare命令进行优化排序，多于8 个的用Ripple命令排序，错误检测水平设为1 %，利用Kosambi函数将重组率转化为遗传 图距（cM)。根据已由Song(2004)等定位的SSR标记作为锚定标记以确定相应的连锁。将 L0D彡2. 0作为QTL存在的闕值，用WinQTLcartograph V2. 0进行QTL定位。
[0044] 结果如图1所示：抗大豆花叶病毒病（SMV)Nl株系的基因位点RsmvNl-1 (图1)， 定位于大豆的F连锁群，RsmvNl-1位于SNP9和SSR23之间，分别能够解释的表型变异为 48. 64%。
[0045] 在SNP9和SSR23范围之间及上下游各0. 5Mbp基因组范围内选取在父母本间具有 扩增多态性的SSR引物，提取F2分离世代对N1株系感病的单株DNA，以其为模板进行PCR 扩增和基因分型分析，根据SSR标记基因型在群体中的分离情况，将母本类型的个体记为 "A"，父本类型的个体记为"B"，杂合的和缺失不清的记为应用涉及的实验方法同上。
[0046] 上述标记分型获得的基因型数据按如下公式计算重组率：
[0047] ^ ) b基因型数y+H基因型数y 章 i且率（％) = -X 1〇〇 a基因型数y +b基w型数u +h基w型数y
[0048] 式中B基因型为抗病供体东农93-046的基因型，A基因型为抗病亲本合丰25的 基因型，Η为二者之间杂合基因型数目。根据上述公式获得两个与抗病位点重组率为0的 分子标记，分别为SNP标记SG1和SSR标记SSR64,该分子标记为与抗病基因共分尚的分子 标记，以该分子标记重新定义SMV Ν1株系抗病位点命名为RsmvNl-2 (表1)。
[0049] 表1感SMV N1株系的F2代单株在RsmvNl-Ι位点附近的分子标记分型及重组率 分布
[0050]
【权利要求】
1. 一种辅助鉴定大豆抗花叶病毒病基因的方法，其特征在于，从待测大豆中分离提取 DNA，通过分子标记SSR64和SG1的引物进行PCR扩增，再利用电泳检测SSR64引物扩增产 物中有无标记基因位点条带和/或利用基因分型分析系统分析SG1的引物扩增产物的基因 型，确定待测大豆种质资源是否具有抗花叶病毒病基因。
2. 权利要求1所述方法，其特征在于，步骤如下： 1) 提取待测大?样本的DNA ; 2) 以步骤1)所提取的DNA为模板，通过分子标记SSR64的引物和分子标记SG1的引物 进行PCR扩增； 3) 利用电泳检测步骤2)所得SSR64的引物的扩增产物和/或利用基因分型分析系统 分析SG1引物扩增产物的基因型，确定待测大豆种质资源是否具有标记基因位点条带。
3. 权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述分子标记SSR64的引物如SEQ ID NO. 1-N0. 2所示；所述分子标记SG1的引物如EQ ID NO. 3-N0. 4所示。
4. 权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述PCR扩增，反应程序为94°C预变性6min， 94°C变性30s, 55°C退火30s, 72°C延伸30s，35次循环，72°C终延伸5min。
5. 权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述标记基因位点，编号RsmvNl-2,位于大 豆的F连锁群。
6. 权利要求5所述方法，其特征在于，所述标记基因位点，具体位于抗大豆花叶病毒病 基因共分离的分子标记SSR64和SG1之间，并与分子标记SSR64和SG1紧密连锁。
7. 权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述标记基因位点条带，SSR64引物扩增的 产物大小为152bp，SG1引物扩增的产物大小为80bp。
8. 权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述基因分型分析系统分析，是将SG1引物 PCR扩增产物离心后，扫描样品的荧光信号，扫描起始温度为70°C，结束温度96°C，扫描结 束后温度降至67°C，判断扫描所得溶解曲线是否发生变异。
9. 权利要求1或2所述方法，其特征在于，具体步骤如下： 1) 提取待测大?样品叶片中的DNA ; 2) 以步骤1)所提取的DNA为模板，再分别通过SEQ ID NO. 1-Ν0. 2所示分子标记SSR64 的引物和SEQ ID NO. 3-N0. 4所示分子标记SG1的引物进行PCR扩增，反应程序为94°C预变 性 6min，94°C变性 30s, 55°C退火 30s, 72°C延伸 30s，35 次循环，72°C终延伸 5min ; 3) 利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测步骤2)所得的分子标记SSR64引物的扩增产物， 检测是否含有大小为152bp的条带； 4) 利用Lightscanner基因分型分析系统分析步骤2)所得的分子标记SG1引物的扩增 产物的基因型，将所得的扩增产物于4000rpm下离心5min，再对样品的荧光信号进行扫描， 扫描初始温度为70°C，结束温度为96°C，扫描结束后降温至67°C，判断扫描所得熔解曲线 是否存在变异。
10. 权利要求1-9所述方法，用于大豆抗花叶病毒病基因的鉴定、筛选和大豆的遗传育 种。
【文档编号】C12Q1/68GK104141011SQ201410373427
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2014年7月31日 优先权日:2014年7月31日
【发明者】韩英鹏, 赵雪, 李海燕, 李文滨 申请人:东北农业大学