耐受重金属的好氧反硝化菌株及其应用的制作方法
【专利摘要】一种环境保护【技术领域】的耐受重金属的好氧反硝化菌株及其应用，该菌株为短小芽孢杆菌(Bacillus?pumilus)SNR‐3，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC?NO.7126，本发明能够耐受Cd2+、Cu2+等重金属，并能在上述重金属存在的条件下进行好氧反硝化作用，有效去除水体中的硝态氮和亚硝态氮，并吸附相应的重金属。该菌株培养条件粗放，操作方便简单，处理成本低，对重金属污染的含氮废水的高效净化具有重要意义。
【专利说明】耐受重金属的好氧反硝化菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及的是一种环境保护【技术领域】的生物治理方法，具体是一种耐受重金属 的好氧反硝化菌株及其应用。
【背景技术】
[0002] 地下水作为水资源的重要组成部分，在人类社会的发展过程中起着举足轻重的作 用。近20年来，由于城市生活垃圾和工业"三废"等的不合理处置，农业生产中农药、化肥的 大量使用，全国地下水污染状况日趋加重。根据2010年中国地质局的取样测试数据显示， 我国东部主要平原地下水质量总体堪忧，地下水三氮污染普遍，呈面状污染特征，其超标率 达到7. 7?15. 4%，淮河以北10多个省份约有3000万人饮用高硝酸盐水，海河流域受污染 的地下水资源量占地下水总资源量的62%，农村约有3. 6亿人喝不上符合标准的饮用水。 重金属检出普遍呈点污染特征，多分布在城市周边及工矿企业周围的污灌区。这种多污染 物共同存在的复合污染严重威胁到了饮水安全和人民身体健康。因此修复和治理三氮、重 金属复合污染的地下水已迫在眉睫。
[0003] 现在大多数关于地下水污染的原位修复技术都是针对某一类污染物的。对于氮素 污染的治理，生物脱氮是目前最为经济有效的治理技术。好氧反硝化细菌是一类能在有氧 条件下发挥反销化作用的微生物，因而也能与硝化作用同步进行，并避免Ν0 3·-Ν对硝化反 应的抑制，加速硝化反应进程。目前处理重金属废水的方法中生物吸附法是最有前途的方 法之一。所谓生物吸附法就是利用某些生物体本身的化学结构及成分特性来吸附溶于水中 的金属离子，再通过固液两相分离来去除水溶液中金属离子的方法。近年来有关生物吸附 的报道中提及的都是非活性细胞的吸附作用，但死细胞的生物吸附难以实用化，而且对于 某些种类的金属来说，死细胞难以有效吸附，而活体菌却可以实现特异性吸附，所以，人们 开始重新关注活体微生物在重金属生物吸附中的利用。金属离子进入活细胞，一般要经过 胞外结合与运输到胞内两个阶段。前者是一个快速过程，不需要消耗能量，称为被动吸附； 后者进行得较为缓慢，依赖于能量及代谢系统的调控，称为主动吸收。虽然研究者们分别在 生物脱氮和生物吸附领域都取得了较大的研究进展，但还缺乏有关同步修复地下水氮污染 和重金属污染的生物修复技术研究。
[0004] 经过对现有技术的检索发现，中国专利文献号CN103937701A公开（公告）日 2014. 07. 23,公开了一种短小芽孢杆菌shou002及其应用，其中的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus)shou002于2013年11月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO :M2013536,该短小芽孢杆菌shou002对水产病原菌具有良好的抑制作用，并且无致病 性，安全可靠，能够有效的降解养殖水体中的有机物、氨氮和亚硝酸氮等污染物，优化养殖 环境，促进水环境生态良性循环，可以用作饲料添加剂和水体生态环境改良剂应用到水产 养殖中。但该技术并未涉及水体硝态氮的降解，且菌株本身不具有吸附重金属的能力，无法 应用于重金属污染的含氮废水。
[0005] 李涵在《好氧反硝化细菌的脱氮机理及其絮凝特性的研究》（南京理工大学，环境 工程，2013,硕士论文）中公开了两株好氧反硝化细菌，分别命名为ADB4A和ADB7。设置硝 态氮进水浓度为268. 8mg吨-1，在160r/min，30°C的环境条件下培养2天后，菌株ADB4A和 ADB7对硝态氮的降解率分别达到了 83%和63%。经过16SrDNA序列测定，认为菌株ADB4A 和ADB7分别为短小芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。为了更好地了解并利用好氧反硝化细菌，该 文献从碳源、碳氮比、温度、转速、pH等因素着手，用单因素法探讨了好氧反硝化细菌生长的 最佳环境条件以及环境对菌株的好氧反硝化作用的影响，均得到了最佳参数。但该技术在 对水体硝态氮进行反硝化处理时，会导致水体中亚硝态氮和氨氮的积累，造成二次污染。
【发明内容】
[0006] 本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种耐受重金属的好氧反硝化菌株及 其应用，该菌株能够耐受Cd 2+、Cu2+等重金属，并能在上述重金属存在的条件下进行好氧反 硝化作用，有效去除水体中的硝态氮和亚硝态氮，并吸附相应的重金属。该菌株培养条件粗 放，操作方便简单，处理成本低，对重金属污染的含氮废水的高效净化具有重要意义。
[0007] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0008] 本发明涉及一种短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus)SNR - 3,目前该菌株保藏于中 国普通微生物菌种保藏管理中心（简称CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，邮编：100101。保藏编号为CGMCC N0. 7126,保藏日期是2013年1月11日。
[0009] 所述的短小芽孢杆菌SNR - 3具有下述性质：
[0010] 1、菌落形态学特征：在蛋白胨琼脂培养基上营养细胞为0.4?0.8X1. 5? 2. 7 μ m大小的杆菌，37°C培养2?3天形成芽孢，芽孢为长圆形或圆柱状。在上述培养基中 30°C培养8h菌体可以大量生长。菌落呈白色，边缘有褶皱，不透明，不闪光。
[0011] 2、生理与生化特性：培养温度：20?37°C，最适温度为30°C;在ρΗ5· 8?7. 5范围 内生长；革兰氏染色检测呈阳性；甲基红实验检测呈阳性；硝酸盐还原检测呈阳性；Π 引哚生 产检测呈阳性；H2S生产检测呈阴性；脲酶生产检测呈阴性。
[0012] 所述的短小芽孢杆菌SNR - 3经16S rDNA序列测得，其16S rDNA大部分序列 1414bp，如SEQ ID No. 1所示，将该序列与GenBank中的基因序列进行同源性比较，发现其 与短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus)同源性达到99.9%。
[0013] 本发明涉及一种短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus)SNR-3的应用，将其用于脱除 污染水体中的硝态氮和亚硝态氮，具体为：将短小芽孢杆菌SNR -3扩大培养后，接种于含有 Cd2+和/或Cu2+的含氮废水中，菌体在生长过程中通过好氧反硝化作用脱除水体中的硝态 氮和亚硝态氮，同时利用生物吸附作用去除水体中的Cd 2+、Cu2+重金属，并且被吸附的重金 属全部位于胞内，从而达到去除重金属的目的。
[0014] 所述的扩大培养是指：将SNR -3菌株接种于含有碳源、氮源、无机盐和水的无菌发 酵培养基中，在C/N比大于或等于5,初始pH为5. 8?7. 5、培养温度为25?37°C的环境下 培养6?24小时。
[0015] 所述的无菌发酵培养基包含如下组分：碳源2?40g/L，氮源0. 1?20g/L，无机盐 0. 01?20g/L，其余为水，pH6. 0?7. 5,其中：所述的碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、木 糖、果糖、柠檬酸、甘油和糖蜜中的任意一种或几种的组合；氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、 淀粉、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素、（NH 4)2S04、ΚΝ03和NH4N03中的任意一种或几种的组 合；无机盐为硫酸盐、磷酸盐、磷酸二氢盐和盐酸盐中的一种或多种。
[0016] 所述的接种是指：按照0. 5?10%的比例投入到含氮废水中。
[0017] 所述的含氮废水中硝态氮的初始浓度为10?2000mg/L、亚硝态氮初始浓度为1? 350mg/L。
[0018] 所述的含氮废水中Cd2+的初始浓度为0. 01?10mg/L，Cu2+的初始浓度为0. 01? 30mg/L。 技术效果
[0019] 与现有技术相比，本发明的技术效果包括：
[0020] 1)本发明筛选获得的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus)能利用多种碳源和氮源 进行生长繁殖，培养条件十分粗放，操作方便简单。
[0021] 2)本发明提供的菌株能够在好氧条件下进行完全的反硝化作用，即将硝态氮直接 还原为氮气，实现彻底脱氮且不会对环境造成二次污染。
[0022] 3)本发明提供的菌株具有Cd2+、Cu2+重金属耐受性，能够通过菌体自身的生物吸附 作用去除重金属离子，并且与好氧反硝化过程可以同步进行，适用于处理含氮废水或重金 属污染的含氮废水，具有优异的环境效益和社会效益。
【专利附图】
【附图说明】
[0023] 图1为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus) SNR - 3的菌落形态照片。
[0024] 图2为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus) SNR - 3的菌落显微镜照片（1000X)。
【具体实施方式】
[0025] 下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。 实施例1
[0026] 短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus) SNR - 3的分离和纯化
[0027] 富集培养基1 :酒石酸钾钠20g/L、柠檬酸三钠10g/L、乙酸钠10g/L、KN032g/ L、Κ2ΗΡ040· 5g/L、MgS04 · 7Η200· 2g/L、微量元素溶液 0· 2 %，ρΗ7· 5。微量元素溶液： EDTA-2Na57. lmg/L、ZnS04 · 7Η203· 9mg/L、CaCl2 · 2H207mg/L、MnCl2 · 4Η205· lmg/L、 FeS04 · 7H205. Omg/L、CuS04 · 5H20L 6mg/L、CoCl2l. 6mg/L。
[0028] 富集培养基2:在富集培养基1的基础上加入lOOmg/L CuS04 · 5H20, 50mg/ L(CH3C00)2Cd · 2H20。
[0029] BTB 培养基：KN031. 0g/L，C6H5Na302 · 2H20L 0g/L，KH2P04L 0/Lg，FeS04 · 7Η200· 05g/ L，CaCl20. 2g/L, MgS04 · 7H20L 0g, 1 % 的 BTBlmL，琼脂 20. 0g/L，pH6. 8。
[0030] 反硝化培养基：酒石酸钾钠 20g/L、KN032. 5g/L、K2HP040. 5g/L、MgS04 · 7H20(X 2g/L， 琼脂 20.0g/L，pH7.5。
[0031] 从崇明岛沿海滩涂地采集活性淤泥样品，分别取不同采样点的活性淤泥lOg加入 富集培养基1中，30°c、150r/min培养3d，以10%接种量接入新的富集培养基1中，继续按 照上述方法进行培养，如此反复驯化4次，以富集好氧反硝化细菌。
[0032] 将上述富集菌液重新接入富集培养基2中，以相同的方法进行富集驯化培养，重 复4次后，吸取lmL富集培养液至9mL无菌生理盐水中，得到ΚΓ 1稀释度菌悬液，依次按10 倍稀释法稀释至1〇_8。分别吸取各稀释度悬液〇. lmL至BTB固体培养基均匀涂布，30°C倒 置培养2?3d，挑取有蓝色晕圈的单菌落，在反硝化固体培养基上连续传代培养6代，直至 获得菌落形态稳定的纯培养。 实施例2
[0033] 短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus) SNR - 3对含氮污水的脱氮效果
[0034] 种子培养基：葡萄糖5g/L，牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，NaC10. 5g/L，利用NaOH溶液 调 ρΗ6· 5。
[0035] 发酵培养基：葡萄糖20g/L，酵母膏2g/L，蛋白胨5g/L，Κ2ΗΡ0 4 · 3Η202· 5g/L， MgS04 · 7Η200· lg/L，利用 NaOH 溶液调 ρΗ7· 0。
[0036] 将短小芽孢杆菌 B. pumilus SNR - 3(CGMCC NO. 7126)在种子培养基、30°C、200r/ min的摇床条件下培养10h，将种子液按2% (v/v)的种子量接种于预装有3. 5L灭菌后的发 酵培养基的5L发酵罐中进行培养，培养条件：30°C，300r/min，通气量1. 5L/min，发酵过程 无需调节pH。发酵12h，菌体浓度达到300 X 108cfu/mL。
[0037] 将上述菌液按4% (v/v)的接种量分别接入含有硝态氮初始浓度300mg/L、亚硝态 氮初始浓度l〇〇mg/L的污水中，其中：C/N比为15。在25°C、300r/min、通气量1. 2L/min条 件下培养5d，取培养液在SOOOrpm条件下离心10min，取上清检测硝态氮和亚硝态氮含量。
[0038] 表1菌株对含氮污水的脱氮效果
【权利要求】
1. 一种短小芽孢杆菌SNR-3,其特征在于，该短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus)保藏 于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO. 7126,保藏日期是2013年1月 11日。
2. 根据权利要求1所述的短小芽孢杆菌SNR -3,其特征是，所述的短小芽孢杆菌SNR -3 经16S rDNA序列测得序列如SEQ ID No. 1所示。
3. -种根据权利要求1或2所述的短小芽孢杆菌SNR - 3的应用，其特征在于，将其用 于脱除污染水体中的硝态氮和亚硝态氮，具体为：将短小芽孢杆菌SNR -3扩大培养后，接种 于含有Cd2+和/或Cu2+的含氮废水中，菌体在生长过程中通过好氧反硝化作用脱除水体中 的硝态氮和亚硝态氮，同时利用生物吸附作用去除水体中的Cd 2+、Cu2+重金属，并且被吸附 的重金属全部位于胞内，从而达到去除重金属的目的。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征是，所述的扩大培养是指：将SNR-3菌株接种于 含有碳源、氮源、无机盐和水的无菌发酵培养基中，在C/N比大于或等于5,初始pH为5. 8? 7. 5、培养温度为25?37°C的环境下培养6?24小时。
5. 根据权利要求3所述的应用，其特征是，所述的无菌发酵培养基包含如下组分：碳源 2?40g/L，氮源0· 1?20g/L，无机盐0· 01?20g/L，其余为水，ρΗ6· 0?7. 5。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征是，所述的碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、 木糖、果糖、柠檬酸、甘油和糖蜜中的任意一种或几种的组合；氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母 膏、淀粉、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素、（NH 4)2S04、KN0dPNH4N03中的任意一种或几种的 组合；无机盐为硫酸盐、磷酸盐、磷酸二氢盐和盐酸盐中的一种或多种。
7. 根据权利要求3所述的应用，其特征是，所述的接种是指：按照0. 5?10 %的比例投 入到含氮废水中。
8. 根据权利要求3所述的应用，其特征是，所述的含氮废水中硝态氮的初始浓度为 10?2000mg/L、亚硝态氮初始浓度为1?350mg/L。
9. 根据权利要求3所述的应用，其特征是，所述的含氮废水中Cd2+的初始浓度为 0· 01 ?10mg/L，Cu2+ 的初始浓度为 0· 01 ?30mg/L。
【文档编号】C12R1/07GK104152377SQ201410373873
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年7月31日 优先权日:2014年7月31日
【发明者】周培, 张丹, 支月娥, 章健, 罗艳青, 初少华 申请人:上海交通大学