基于纤维素代谢通路关键酶的工程菌及其实现方法
【专利摘要】一种基于纤维素代谢通路关键酶的工程菌及其实现方法，以灰略红链霉菌基因组DNA经过全基因合成构建得到载体为模板，分别与对应含有酶切位点的引物进行PCR扩增并对应分别得到编码外切‐β‐1,4‐葡聚糖酶的核苷酸序列、编码内切‐β‐1,4‐葡聚糖酶的核苷酸序列和编码β‐1,4‐葡萄糖苷酶的核苷酸序列；然后将扩增得到的序列依次连接到共表达载体，最终得到重组共表达载体和重组表达载体；之后将重组共表达载体先后转化到大肠杆菌表达菌株内，获得转基因共表达菌株。本发明应用基因工程手段实现外切‐β‐1,4‐葡聚糖酶、内切‐β‐1,4‐葡聚糖酶和β‐1,4‐葡萄糖苷酶体外的大量表达合成，最终实现纤维素的原位快速降解。
【专利说明】基于纤维素代谢通路关键酶的工程菌及其实现方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及的是一种生物基因工程【技术领域】的基因及其工程菌株，具体是一种灰略红链霉菌的基于外切-β - 1,4 -葡聚糖酶、内切-β -1,4-葡聚糖酶和β - 1，4 -葡萄糖苷酶的工程菌及其实现方法。
【背景技术】
[0002]木质纤维素是植物界中最为丰富的天然高分子化合物，是植物通过光合作用产生的主要干物质，主要包括纤维素、半纤维素和木质素。据估计，每年全世界绿色植物光合作用产生的木质纤维素总干重为1730亿t，所含总能量高达2 X 118KJ,相当于每年全世界消耗能量的10倍。木质纤维素的生物降解和解聚作用是一个高度复杂的过程，涉及众多酶系的参与。
[0003]木质纤维素中的纤维素是由葡萄糖组成的大分子多糖，不溶于水及一般有机溶剂，性质稳定。纤维素降解需要纤维素酶的参与，而纤维素酶并不是一种简单的酶，是由若干种相互关联的酶组成的一个复杂的酶系，主要由3类组成:内切-β -1,4-葡聚糖酶(Endo - β -1,4- glucanase),称为 Cx 酶；外切葡聚糖酶(EXo - β -1,4- glucanase),称为Cl酶；β -葡萄糖苷酶(β - glucosidase)，称为BG酶或CB酶。目前普遍接受的观点是3种酶协同作用于纤维素的降解过程，即首先由Cx酶在纤维素聚合物的内部起作用，在纤维素的非结晶部位进行切割，产生新的末端，然后再由外切葡聚糖酶以纤维二糖为单位，从末端进行水解，最后由CB酶将纤维二糖彻底水解为葡萄糖。因此，对于实现纤维素的快速彻底水解上述三种酶是缺一不可的。
[0004]已证实，自然中的细菌、真菌乃至放线菌均具有上述三种纤维素酶的合成能力。与真核生物相比，原核生物具有生长速度较快，且基因无内含子，具有易克隆、易表达等优势。链霉菌作为土壤中常见的一类细菌(放线菌)，对多数高分子化合物具有较强的分解能力并在碳循环中起至关重要的作用。其中灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens) JSD -1经证实具有很强的纤维素分解能力。
【发明内容】
[0005]本发明针对现有技术中外切-β - 1，4 -葡聚糖酶、内切-β - 1，4 -葡聚糖酶和β - 1，4 -葡萄糖苷酶在灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)内多为诱导表达且表达水平很低的缺陷，提出一种基于纤维素代谢通路关键酶的工程菌及其实现方法，通过全基因组测序分析，从该链霉菌基因组分离到与纤维素降解有关的基因序列，其中包括编码外切-β - 1,4 -葡聚糖酶、内切-β -1,4-葡聚糖酶和β - 1,4 -葡萄糖苷酶的基因序列。本发明通过对灰略红链霉菌内相关基因(GC含量70%以上)进行序列优化后进行全基因合成，并将目的基因序列插入到共表达载体中，最终实现纤维素降解关键酶的体外共表达。本发明对灰色链霉菌内纤维素降解通路的研究乃至实现纤维素的快速降解均具有重要意义。
[0006]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0007]本发明涉及一种纤维素代谢通路关键酶的工程菌，该工程菌为通过全基因合成获得的外切-β -1,4-葡聚糖酶、内切-β -1,4-葡聚糖酶和β -1,4-葡萄糖苷酶基因的重组过表达菌株。
[0008]所述的纤维素代谢通路关键酶是指灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)JSD -1外切-β - 1,4 -葡聚糖酶、内切-β - 1，4 -葡聚糖酶和β - 1,4 -葡萄糖苷酶。
[0009]所述的外切-β - 1,4 -葡聚糖酶的核苷酸序列EXjn SEQ ID N0.1所示，内切-β - 1，4 -葡聚糖酶的核苷酸序列ENjB SEQ ID N0.2所示，β - 1，4 -葡萄糖苷酶基因的核苷酸序列BGjB SEQ ID N0.3所示；其中:外切-β - 1，4 -葡聚糖酶的基因序列为1641bp，编码546个氨基酸；内切-β - 1，4 -葡聚糖酶的基因序列为1029bp，编码342个氨基酸；β - 1,4 -葡萄糖苷酶基因的基因序列为1359bp，编码453个氨基酸。
[0010]所述的全基因合成是指:通过对灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)外切-β - 1,4 -葡聚糖酶、内切-β -1,4-葡聚糖酶和β - 1,4 -葡萄糖苷酶基因序列进行优化，设定表达宿主为 Ε.coli K12,回避 Nde 1、Nco 1、BamH 1、Xho 1、Msc I 和 EcoR I 酶切位点、同时避免序列中出现不依赖rho因子的转录终止子及核糖体结合位点。
[0011]所述的灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens) JSD -1,现保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC N0.5706，保藏日期为2012年I月9日，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所邮编100101。
[0012]本发明涉及上述工程菌的实现方法，以灰略红链霉菌基因组DNA经过全基因合成构建得到的PUC57 - EX、pUC57 - EN和pUC57 - BG载体为模板，分别与对应含有酶切位点的引物进行PCR扩增并对应分别得到编码外切-β -1，4 -葡聚糖酶的核苷酸序列ΕΧ、编码内切-β -1,4-葡聚糖酶的核苷酸序列EN和编码β -1,4-葡萄糖苷酶的核苷酸序列BG ;然后将扩增得到的序列EX和EN依次连接到共表达载体pACY⑶uet -1、将扩增得到的序列BG连接到重组表达载体pET - 22b (+)，最终得到重组共表达载体pETDuet -EX-EN和重组表达载体pET - 22 - BG ;之后将重组共表达载体pETDuet -EX-EN与重组表达载体pET - 22 - BG先后转化到大肠杆菌表达菌株内，获得转基因共表达菌株。
[0013]所述的含有酶切位点的引物包括:
[0014]EX - Nco 1- F:TACCATGGCTGCTGTTCCGTGCACCGTTGACTACA
[0015]EX - BamH I _ R:CGGGATCCTTAATGATGATGATGATGATGAGAAACCGGCGGGTAAGCG
[0016]EN - Nde 1- F:TACATATGGACACCACCCTGTGCGAAGAATTCGGT
[0017]EN - Xho 1- R:CCCTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGAGCGGTACGGCAAGCGGTA
[0018]BG - Msc 1- F:GATGGCCATGGTGACCATCGACTACGCTGCTCTGC
[0019]BG - Xho 1- R:CCCTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGAGCAGCTTCACGAACACGT
[0020]所述的PCR扩增的条件为:98°C预变性3min ;98°C变性10s，60°C退火15s，72°C延伸15s ；30个循环后72°C终延伸3min。
[0021]所述的大肠杆菌表达菌株为Transetta(DE3)大肠杆菌。
[0022]本发明涉及一种纤维素代谢通路的工程菌的应用，将其用于木聚糖酶和木糖苷酶的体外高效表达，并最终实现纤维素的原位快速降解。
技术效果
[0023]现有木聚糖酶和木糖苷酶在灰略红链霉菌内为胞内酶且表达量很低，因此严重限制了其使用范围和效果；与现有技术相比，本发明提供了一种全新的木聚糖酶和木糖苷酶基因序列；在特殊条件下(如高温以及碱性)具有更稳定的生物学活性；本发明通过构建外源表达载体，实现了木聚糖酶和木糖苷酶的体外共表达，并通过在重组蛋白C端添加聚组氨酸标签的方法，保证了纯化蛋白的质量；使用新型大肠杆菌表达宿主，最大程度提高蛋白活性与可溶性。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1为基于JCat预测外切-β - 1,4 -葡聚糖酶基因序列优化前后密码子利用率对比图；
[0025]图2为基于JCat预测内切-β - 1，4 -葡聚糖酶基因序列优化前后密码子利用率对比图；
[0026]图3为基于JCat预测β -1，4 _葡萄糖苷酶基因序列优化前后密码子利用率对比图。
【具体实施方式】
[0027]下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
[0028]本实施例中灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)分离自上海市浦江镇收集的腐烂
秸杆，保藏编号为CGMCC N0.5706。将该菌种接种于LB液体培养基，32°C培养48 h。
[0029]上述LB液体培养基组分为:蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L, NaCll0.0g/L,pH6.8 - 7.2。在液体培养基中加入15.0 - 20.0g/L琼脂即得LB固体培养基。
[0030]I)灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)基因组 DNA 提取:收集 2.0mL 菌液，12000rpm离心2min。弃上清，收集菌体沉淀，加入180 μ L溶菌酶(20mg/mL)和20 μ LEDTA溶液(0.5皿，卩!18.0)，371:处理4511^11，加入4 4 1^ RNase A(100mg/mL)，震荡混匀 15s，室温放置5min，随后按照细菌DNA提取试剂盒(TIANGEN)操作说明完成剩余操作，得到高纯度基因组DNA。通过0.8%琼脂糖凝胶电泳确定基因组DNA质量，确保无明显RNA条带，基因组条带清洗、完整、无降解、无污染。
[0031]2)灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)基因组测序:确定全基因组鸟枪法(WGS)策略，采用第二代测序技术，构建不同插入片段长度的文库，采用IlluminaMiseq(2X250bp)平台进行测序。收集测序的原始数据，对带接头、低质量的数据进行过滤，随后采用Newbler v2.8对去除接头的测序数据进行从头拼接,构建contig及scaffold,最后使用GapCloser程序进行缺口填补得到链霉菌基因组草图。
[0032]3)蛋白编码基因功能预测:采用Glimmer 3.0软件对全基因组序列进行基因预测。基因预测模型选取自我训练基因预测模型，即提取拼装序列中最长的序列，以该序列作为基因预测模型训练的序列。然后以该序列构建的基因预测模型，对所有序列进行基因预测，设定开放阅读框的长度为llObp，其余参数为Glimmerf.0的默认设置。
[0033]4)纤维素代谢通路编码基因序列的优化及人工合成:通过JCat在线程序对灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)外切-β -1,4-葡聚糖酶、内切-β - 1，4 -葡聚糖酶和β - 1,4 -葡萄糖苷酶基因序列进行优化，设定表达宿主为Ε.coli Κ12，回避Nde
1、Nco 1、BamH 1、Xho 1、Msc I和EcoR I酶切位点、同时避免序列中出现不依赖rho因子的转录终止子及核糖体结合位点，基因序列优化前后密码子使用频率对比图如图1和图2所示。全基因合成优化后的基因序列并分别构建到PUC57载体，得到pUC57 -EX、pUC57 -EN和pUC57 -BG质粒。经过序列优化，基因密码子使用率大幅度提高，更适合在大肠杆菌宿主细胞内进行表达。
实施例2
[0034]共表达载体的构建
[0035]I)根据优化后核苷酸序列，设计含有酶切位点的PCR引物序列如下:
[0036]EX - Nco 1- F:TACCATGGCTGCTGTTCCGTGCACCGTTGACTACA
[0037]EX - BamH I _ R:CGGGATCCTTAATGATGATGATGATGATGAGAAACCGGCGGGTAAGCG
[0038]EN - Nde 1- F:TACATATGGACACCACCCTGTGCGAAGAATTCGGT
[0039]EN - Xho 1- R:CCCTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGAGCGGTACGGCAAGCGGTA
[0040]BG - Msc 1- F:GATGGCCATGGTGACCATCGACTACGCTGCTCTGC
[0041] BG - Xho 1- R:CCCTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGAGCAGCTTCACGAACACGT
[0042]2)以pUC57 - EX为模板，以含有Nco I和BamH I酶切位点的引物进行PCR扩增扩增获得外切-β - 1，4 -葡聚糖酶基因序列，使用DNA A - Tailing Kit加A后连接到T - Vector PMD?19 - T (TaKaRa)，并将连接产物转入DH5 α大肠杆菌内。挑选阳性克隆，摇菌提取质粒测序。若无误，Nco I和BamH I进行双酶切(37°C )，回收外切-β - 1，4 -葡聚糖酶DNA片段ΕΧ。用相同内切酶酶切共表达载体pETDuet -1并回收载体DNA片段。将EX与载体片段混合，T4DNA Ligase(TaKaRa)过夜连接(16°C )，将连接产物转入DH5 α大肠杆菌感受态细胞内，通过抗性平板及菌落PCR筛选含有质粒pETDuet - EX阳性克隆。挑取阳性克隆接种于含有氨苄青霉素(50 μ g/mL)的LB液体培养基中，180rpm、37°C培养16小时后提取质粒。
[0043]以含有Nde I和Xho I酶切位点引物进行PCR扩增获得内切-β - 1，4 -葡聚糖酶基因序列，加A后连接到PMD? 19-1'，将连接产物转入0册(1大肠杆菌内。挑选阳性克隆摇菌并回收质粒测序验证。若无误,用Nde I和Xho I双酶切该质粒，回收内切-β -1,4 -葡聚糖酶DNA片段ΕΝ。相同内切酶处理重组表达载体pETDuet - EX并回收载体DNA片段。将EN与pETDuet - EX载体片段混合，T4DNA Ligase过夜连接，将连接产物转入DH5 α大肠杆菌感受态细胞内，通过抗性平板和菌落PCR筛选含有重组共表达载体pETDuet - EX - EN的阳性克隆。挑取阳性克隆，摇菌并提取其质粒。
[0044]以含有Msc I和Xho I酶切位点引物进行PCR扩增获得β - 1，4 -葡萄糖苷酶基因序列，加A后连接到PMD? 19-Τ，将连接产物转入DH5a大肠杆菌内。挑选阳性克隆摇菌并回收质粒测序验证。若无误，用Msc I和Xho I双酶切该质粒，回收β - 1,4 -葡萄糖苷酶DNA片段BG。相同内切酶处理重组表达载体pET - 22b (+)并回收载体DNA片段。将BG与pET-22b(+)载体片段混合，T4 DNA Ligase过夜连接，将连接产物转入DH5 α大肠杆菌感受态细胞内，通过抗性平板和菌落PCR筛选含有重组表达载体pET - 22 - BG的阳性克隆。挑取阳性克隆，摇菌并提取其质粒。
[0045]上述PCR扩增条件为:98°C预变性3min ;98°C变性10s，55°C退火15s，72°C延伸15s ；30个循环后72°C终延伸3min。
[0046]上述PCR 反应使用的 DNA 聚合酶为 PrimeSTAR? Max DNA Polymerase (TaKaRa)。
[0047]3)重组共表达菌株的构建:
[0048]将上述含有外切-β -1,4-葡聚糖酶和内切-β - 1,4 -葡聚糖酶编码基因的共表达载体pETDuet -EX-EN与含有β -1,4-葡萄糖苷酶编码基因的表达载体pET - 22 - BG先后转入TransB (DE3)大肠杆菌，并在含有氨节青霉素(50 μ g/mL)、氯霉素(25yg/mL)、卡那霉素(25 μ g/mL)和四环素(20 μ g/mL)的LB固体培养基上抗性筛选，获得可同时表达外切-β - 1，4 -葡聚糖酶、内切-β - 1，4 -葡聚糖酶和β - 1,4 -葡萄糖苷酶的重组菌株。
[0049]上述的TransB (DE3)具有以下特征:具有卡那霉素(KanR)和四环素(TetR)抗性，此外，该菌株还包含突变的硫氧还蛋白还原酶(trxB)和谷胱甘肽还原酶(gor)基因，表达主要还原途径的两个关键酶，有利于形成正确折叠的含有二硫键的蛋白，增强蛋白的可溶性。
【权利要求】
1.一种纤维素代谢通路关键酶的工程菌，其特征在于，该工程菌为通过全基因合成获得的外切-β - 1,4 -葡聚糖酶、内切-β -1,4-葡聚糖酶和β - 1,4 -葡萄糖苷酶基因的重组过表达菌株； 所述的纤维素代谢通路关键酶是指灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)JSD-1外切-β - 1，4-葡聚糖酶、内切-β -1，4-葡聚糖酶和β -1，4-葡萄糖苷酶，其中:外切-β - 1,4 -葡聚糖酶的核苷酸序列EXjB SEQ ID N0.1所示，内切-β - 1，4 -葡聚糖酶的核苷酸序列EN^ SEQ ID N0.2所示，β - 1，4 -葡萄糖苷酶的核苷酸序列BGjnSEQ ID N0.3 所示。
2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征是，所述的灰略红链霉菌(Streptomycesgriseorubens) JSD -1,现保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC),保藏编号为CGMCC N0.5706，保藏日期为2012年I月9日。
3.根据权利要求1所述的工程菌，其特征是，所述的全基因合成是指:通过对灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)外切-β -1,4-葡聚糖酶、内切-β -1,4-葡聚糖酶和β - 1，4 -葡萄糖苷酶基因序列进行优化，设定表达宿主为E.coli Κ12，回避Nde 1、Nco I> BamH 1、Xho 1、Msc I和EcoR I酶切位点、同时避免序列中出现不依赖rho因子的转录终止子及核糖体结合位点。
4.一种根据权利要求1~3中任一所述的工程菌的实现方法，其特征在于，以灰略红链霉菌基因组DNA经过全基因合成构建得到的pUC57 - EX、pUC57 - EN和pUC57 - BG载体为模板，分别与对应含 有酶切位点的引物进行PCR扩增并对应分别得到编码外切-β - 1，4 -葡聚糖酶的核苷酸序列ΕΧ、编码内切-β - 1，4-葡聚糖酶的核苷酸序列EN和编码β - 1,4 -葡萄糖苷酶的核苷酸序列BG ;然后将扩增得到的序列EX和EN依次连接到共表达载体pACY⑶uet - 1、将扩增得到的序列BG连接到重组表达载体pET - 22b (+)，最终得到重组共表达载体pETDuet -EX-EN和重组表达载体pET - 22 - BG ;之后将重组共表达载体pETDuet -EX-EN与重组表达载体pET - 22 - BG先后转化到大肠杆菌表达菌株内，获得转基因共表达菌株。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征是，所述的含有酶切位点的引物包括:
EX - Nco 1- F:TACCATGGCTGCTGTTCCGTGCACCGTTGACTACA
EX - BamH I _ R:CGGGATCCTTAATGATGATGATGATGATGAGAAACCGGCGGGTAAGCG
EN -Nde 1- F:TACATATGGACACCACCCTGTGCGAAGAATTCGGT
EN - Xho 1- R:CCCTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGAGCGGTACGGCAAGCGGTA
BG -Msc 1- F:GATGGCCATGGTGACCATCGACTACGCTGCTCTGC
BG - Xho 1- R:CCCTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGAGCAGCTTCACGAACACGT?
6.根据权利要求4所述的方法，其特征是，所述的PCR扩增的条件为:98°C预变性3min ;98°C变性 10s，55。。退火 15s，72。。延伸 15s ；30 个循环后 72°C终延伸 3min。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征是，所述的大肠杆菌表达菌株为Transetta(DE3)大肠杆菌。
8.一种根据上述任一权利要求所述的纤维素代谢通路关键酶的工程菌的应用，其特征在于，将其用于外切-β - 1，4 -葡聚糖酶、内切-β - 1，4 -葡聚糖酶和β - 1,4 -葡萄糖苷酶的体外高效表达，并最终实现纤维素的原位快速降解。
【文档编号】C12R1/19GK104178444SQ201410374224
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年7月31日 优先权日:2014年7月31日
【发明者】周培, 冯海玮, 孙玉静, 支月娥, 罗艳青 申请人:上海交通大学