基于氯化物过氧化物酶的工程菌及其实现方法
【专利摘要】一种基因工程【技术领域】的基于氯化物过氧化物酶的工程菌及其实现方法，以灰略红链霉菌基因组DNA为模板，与含有酶切位点的引物进行PCR扩增得到氯化物过氧化物酶编码基因；然后将该基因插入大肠杆菌表达载体pET‐22b(+)中得到含有氯化物过氧化物酶编码基因的重组表达载体；再将重组表达载体导入大肠杆菌表达菌株，筛选得到氯化物过氧化物酶的工程菌。本发明针对现有技术存在的由于氯化物过氧化物酶在生物体内多为胞内酶且表达量较低导致的应用范围和效果严重受限等不足，应用基因工程手段实现其体外的大量表达合成并最终实现木质素的快速降解。
【专利说明】基于氯化物过氧化物酶的工程菌及其实现方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及的是一种生物基因工程【技术领域】的基因及其工程菌株，具体是一种灰 略红链霉菌的基于氯化物过氧化物酶的工程菌及其实现方法。
【背景技术】
[0002] 木质素是由四种醇单体（对香豆醇、松柏醇、5 -羟基松柏醇、芥子醇）形成的一种 复杂酚类聚合物。木质素是构成植物细胞壁的成分之一，具有联结强化细胞的作用。此外， 木质素也是一种含许多负电集团的多环高分子有机物，对土壤中的高价金属离子有较强的 亲和力。
[0003]根据单体的不同，可将木质素分为3种类型：由紫丁香基丙烷结构单体聚合而成 的紫丁香基木质素 （S -木质素），由愈创木基丙烷结构单体聚合而成的愈创木基木质素 (G -木质素）和由对-羟基苯基丙烷结构单体聚合而成的对-羟基苯基木质素 （H -木质 素）。一般而言，木质素在裸子植物主要存在类型为愈创木基木质素（G)，双子叶植物主要 含愈创木基-紫丁香基木质素 （G - S)，单子叶植物则为愈创木基-紫丁香基-对-羟基苯 基木质素 （G - S - H)。从植物学观点出发，木质素就是包围于管胞、导管及木纤维等纤维束 细胞及厚壁细胞外的物质；从化学观点来看，木质素是由高度取代的苯基丙烷单元随机聚 合而成的高分子，它与纤维素、半纤维素一起，形成植物骨架的主要成分，在数量上仅次于 纤维素。木质素填充于纤维素构架中增强植物体的机械强度，利于输导组织的水分运输和 抵抗不良外界环境的侵袭。
[0004] 木质素单体同时含有多种活性官能团，如羟基、羰基、羧基、甲基及其它侧链结构。 其中羟基在木质素中存在较多，以醇羟基和酚羟基两种形式存在，而酚羟基的多少又直接 直接影响木质素的物理和化学结构，如能反映出木质素的醚化和缩合程度，同时也能衡量 木质素的溶解性能和反应能力；在木质素的侧链上，有对羟基安息香酸、香草酸、紫丁香酸、 对羟基肉桂酸、阿魏酸等酯型结构存在，这些酯型结构存在于侧链的α位或 γ位。在侧链 α位除了酯型结构外，还有醚型连接，或作为联苯结构的碳-碳联结。同酚羟基一样，木质 素的侧链结构也直接关系它的化学特性。
[0005]由于木质素的复杂结构，高分子量及高度疏水性，与纤维素与半纤维素相比，木 质素的降解相对较难。已发现的木质素降解酶主要有3类：木质素过氧化物酶（Lignin peroxidase)、猛过氧化物酶（Manganese peroxidase)和漆酶（Laccase)，此外，还有一些 辅助酶也参与木质素的降解如氯化物过氧化物酶（Chloro - peroxidase)和芳基醇氧化酶 (Aryl alcohol oxidase)。灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens)作为一种广泛 存在于土壤的细菌，具有很强的木质素降解能力并得到了研究者越来越多的关注。研究灰 略红链霉菌降解木质素的分子机制，克隆关键木质素降解酶基因序列，对于开发新型木质 素降解酶制剂进而实现木质素的快速降解具有重要意义。
【发明内容】
[0006]本发明针对现有技术存在的不足，提出一种基于氯化物过氧化物酶的工程菌及其 实现方法，通过本发明所述的方法能够高效表达一种克隆自灰略红链霉菌氯化物过氧化物 酶，可以克服氯化物过氧化物酶在原始菌株内表达量较低等缺点，有助于解决肥料利用率 较低等问题，此外对于实现土壤中铵盐的快速转化进而培肥土壤，最终实现精准农业具有 重大意义。
[0007] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0008] 本发明涉及一种氯化物过氧化物酶的工程菌，该工程菌为外源表达氯化物过氧化 物酶的大肠杆菌。
[0009] 所述的胞内氯化物过氧化物酶具体为灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD -1氯化物过氧化物酶大亚基基因 SG -CP，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1 所示，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示；核苷酸序列为825bp，编码274个氨基酸。
[0010] 所述的氯化物过氧化物酶编码基因通过全基因组测序和PCR扩增的方式克隆获 得。
[0011] 所述的灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD - 1，现保藏于中国普通 微生物菌种保藏管理中心（CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. 5706,保藏日期为2012年1月9 日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所邮编100101。
[0012] 本发明涉及上述工程菌的实现方法，以灰略红链霉菌基因组DNA为模板，与含有 酶切位点的引物进行PCR扩增得到氯化物过氧化物酶编码基因；然后将该基因插入大肠杆 菌表达载体PET - 22b (+)中得到含有氯化物过氧化物酶编码基因的重组表达载体；再将重 组表达载体导入大肠杆菌表达菌株，筛选得到氯化物过氧化物酶的工程菌。
[0013] 所述的含有酶切位点的引物包括：
[0014] CP - Nco I - F:GCCATGGTGCCGTTCGTCACCGCCGGCGAC
[0015] CP - EcoR I - R:GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGGCTCTCGATGAAGTCGAGCA
[0016] 所述的PCR扩增的条件为：98°C预变性3min ;98°C变性10s，68°C延伸45s ;30个 循环后68°C终延伸3min。
[0017] 所述的大肠杆菌表达菌株为Transetta(DE3)大肠杆菌。
[0018] 本发明涉及一种氯化物过氧化物酶的工程菌的应用，将其应用于氯化物过氧化物 酶的体外高效表达，并最终实现木质素的快速降解。 技术效果
[0019] 现有氯化物过氧化物酶在灰略红链霉菌内为胞内酶且表达量很低，因此严重限制 了其使用范围和效果；与现有技术相比，本发明提供了一种全新的氯化物过氧化物酶基因 序列；在特殊条件下（如高温以及碱性）具有更稳定的生物学活性；本发明通过构建外源 表达载体，实现了氯化物过氧化物酶的体外过表达，并通过在表达重组蛋白C端添加聚组 氨酸标签的方法，维持蛋白活性的同时也最大程度的保证了蛋白纯度。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1为灰略红链霉菌氯化物过氧化物酶信号肽预测图；
[0021] 图2为灰略红链霉菌氯化物过氧化物酶3D结构模型预测图。
【具体实施方式】
[0022] 下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。 实施例1
[0023] 本实施例包括以下步骤：
[0024] 1)灰略红链霉菌的分离及培养
[0025] 灰略红链霉菌分离自上海市浦江镇收集的腐烂秸杆，保藏编号为CGMCC No. 5706。 将该菌种接种于LB液体培养基，32 °C培养48h。
[0026] 上述LB液体培养基组分为：蛋白胨10. Og/L，酵母提取物5. Og/L，NaCl 10. Og/L， pH6. 8 - 7. 2。在液体培养基中加入15. 0 - 20. Og/L琼脂即得LB固体培养基。
[0027] 2)基因组DNA提取
[0028] 收集2. OmL菌液，12000rpm离心2min。弃上清，收集菌体沉淀，加入180 μ L溶菌酶 (20mg/mL)和 20yL EDTA 溶液（0.5M，pH 8.0)，37°C 处理 45min，加入 4yL RNase A(100mg/ mL)，震荡混匀15s，室温放置5min，随后按照细菌DNA提取试剂盒（TIANGEN)操作说明完成 剩余操作，得到高纯度基因组DNA。通过0. 8%琼脂糖凝胶电泳确定基因组DNA质量，确保 无明显RNA条带，基因组条带清洗、完整、无降解、无污染。
[0029] 3)基因组测序：确定全基因组鸟枪法（WGS)策略，采用第二代测序技术，构建不同 插入片段长度的文库，采用Illumina Miseq(2X250bp)平台进行测序。收集测序的原始数 据，对带接头、低质量的数据进行过滤，随后采用Newbler v2. 8对去除接头的测序数据进行 从头拼接，构建contig及scaffold，最后使用GapCloser程序进行缺口填补得到链霉菌基 因组草图。
[0030] 4)蛋白编码基因功能预测：采用Glimmer 3. 0软件对全基因组序列进行基因预 测。基因预测模型选取自我训练基因预测模型，即提取拼装序列中最长的序列，以该序列作 为基因预测模型训练的序列。然后以该序列构建的基因预测模型，对所有序列进行基因预 测，设定开放阅读框的长度为ll〇bp，其余参数为Glimmer 3. 0的默认设置。
[0031] 5)氯化物过氧化物酶膜定位预测：采用SignalP 4. 1分别对氯化物过氧化物酶氨 基酸序列进行信号肽模拟预测，如图1所示。结果表明氯化物过氧化物酶不存在明显的信 号肽序列，推测该酶为胞内酶。
[0032] 6)氯化物过氧化物酶3D模型预测：运用PHYRE 2在线程序对氯化物过氧化物 酶的3D空间模型进行预测。结果表明氯化物过氧化物酶与PDB数据库中已有蛋白模型 (c4d9jl)的最高相似度分别可达33%，预测结果具有100%可信度。如图2所示，该氯化物 过氧化物酶C端（已注明）裸露在蛋白外面，判定此处为聚组氨酸（HIS 6 · Tag)的连接位 点。
[0033] 7)氯化物过氧化物酶核苷酸序列验证：根据全基因组测序结果，设计PCR引物如 下：
[0034] CP - F:ATGCCGTTCGTCACCGCCGGCG
[0035] CP - R:TCAGCTCTCGATGAAGTCGAGCAGGTC
[0036] 以灰略红链霉菌JSD -1基因组DNA为模板，进行PCR扩增并通过琼脂糖凝胶电泳 检测，结果表明片段约为800bp，将PCR产物切胶回收，使用DNA A - Tailing Kit(TaKaRa) 加 A后连接到T - Vector PMD? 19 - T (TaKaRa)，并将连接产物转入DH5 α大肠杆菌，在氨 苄（50 μ g/mL)抗性平板挑选阳性克隆，摇菌提取质粒测序。测序结果证实插入片段与基因 组测序结果完全吻合，即为本发明序列表中的SEQ ID NO. 1。
[0037] 上述PCR扩增条件为：98°C预变性3min ;98°C变性10s，55°C退火15s，68°C延伸 45s ;30个循环后68°C终延伸3min。
[0038] 上述 PCR 反应使用的 DNA 聚合酶为 PrimeSTAR? GXL Polymerase (TaKaRa)。。 实施例2
[0039] 氯化物过氧化物酶表达载体构建
[0040] 1)根据氯化物过氧化物酶序列，设计含有酶切位点的引物，序列如下：
[0041] CP - Nco I - F:GCCATGGTGCCGTTCGTCACCGCCGGCGAC
[0042] CP - EcoR I - R:GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGGCTCTCGATGAAGTCGAGCA
[0043] 2)以灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens)基因组DNA为模板，用含有 Nco I和EcoR I酶切位点引物进行PCR扩增获得氯化物过氧化物酶基因序列，使用DNA A - Tailing Kit 加 A 后连接到 T - Vector PMD? 19 - T (TaKaRa)，并将连接产物转入 DH5 α 大肠杆菌内。挑选阳性克隆，摇菌提取质粒测序。Nco I和EcoR I进行双酶切（37°C)，回 收氯化物过氧化物酶DNA片段CP。用相同内切酶酶切表达载体pET-22b (+)并回收载体 DNA片段。将CP与载体片段混合，T4DNALigase(TaKaRa)过夜连接（16°C )，将连接产物转 入DH5 α大肠杆菌感受态细胞内，通过抗性平板及菌落PCR筛选含有质粒pET - 22 - CP的 阳性克隆。挑取阳性克隆接种于含有氨苄青霉素（50 μ g/mL)的LB液体培养基中，180rpm、 37 °C培养16小时后提取质粒。
[0044] 上述PCR扩增条件为：98°C预变性3min ;98°C变性10s，68°C延伸45s ;30个循环 后68°C终延伸3min。
[0045] 3)氯化物过氧化物酶过表达转基因菌株的构建：
[0046] 将上述氯化物过氧化物酶表达载体pET - 22 - CP转入Transetta(DE3)大肠杆菌， 并在含有氨苄青霉素（50 μ g/mL)和氯霉素（34 μ g/mL)的LB固体培养基上筛选，获得氯化 物过氧化物酶过表达菌株。
[0047] 上述的Transetta(DE3)具有以下特征：该菌株具有氯霉素（Canf)，且含有大肠杆 菌缺乏的6种稀有密码子（AGA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA)对应的tRNA，可有效提高外源基 因，尤其是真核生物及链霉菌等高GC含量生物基因在原核系统中的表达水平。
【权利要求】
1. 一种氯化物过氧化物酶的工程菌，其特征在于，该工程菌为外源表达氯化物过氧化 物酶的大肠杆菌； 所述的胞内氯化物过氧化物酶具体为灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD - 1氯化物过氧化物酶大亚基基因 SG - CP,其核苷酸序列如SEQ ID No· 1所示,其氨基 酸序列如SEQ ID No. 2所示；核苷酸序列为825bp，编码274个氨基酸。
2. 根据权利要求1所述的工程菌，其特征是，所述的灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens)JSD - 1，现保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC)，保藏编号为 CGMCC No. 5706,保藏日期为2012年1月9日。
3. -种根据权利要求1或2中所述的工程菌的实现方法，其特征在于，以灰略红链霉菌 基因组DNA为模板，与含有酶切位点的引物进行PCR扩增得到氯化物过氧化物酶编码基因； 然后将该基因插入大肠杆菌表达载体PET -22b (+)中得到含有氯化物过氧化物酶编码基因 的重组表达载体；再将重组表达载体导入大肠杆菌表达菌株，筛选得到氯化物过氧化物酶 的工程菌。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的含有酶切位点的引物包括： CP - Nco I - F:GCCATGGTGCCGTTCGTCACCGCCGGCGAC CP - EcoR I - R:GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGGCTCTCGATGAAGTCGAGCA。
5. 根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的PCR扩增的条件为：98°C预变性 311^11;98°(：变性1〇3,681：延伸453;30个循环后68°(：终延伸31^11。
6. 根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的大肠杆菌表达菌株为 Transetta(DE3)大肠杆菌。
7. -种含有上述任一权利要求所述的氯化物过氧化物酶的工程菌及其应用，其特征在 于，将其用于氯化物过氧化物酶的体外高效表达，并最终实现木质素的快速降解。
【文档编号】C12R1/19GK104152391SQ201410374652
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年7月31日 优先权日:2014年7月31日
【发明者】周培, 冯海玮, 孙玉静, 支月娥, 罗艳青 申请人:上海交通大学