基于谷氨酰胺合成酶的工程菌及其实现方法
【专利摘要】一种基因工程【技术领域】的基于谷氨酰胺合成酶的工程菌及其实现方法，以灰略红链霉菌基因组DNA为模板，与含有酶切位点的引物进行PCR扩增得到谷氨酰胺合成酶编码基因；然后将该基因插入大肠杆菌表达载体pET‐22b(+)中得到含有谷氨酰胺合成酶编码基因的重组表达载体；再将重组表达载体导入大肠杆菌表达菌株，筛选得到谷氨酰胺合成酶的工程菌。本发明针对现有技术存在的由于谷氨酰胺合成酶在生物体内多为胞内酶且表达量较低导致的应用范围和效果严重受限等不足，应用基因工程手段实现其体外的大量表达合成。
【专利说明】基于谷氨酰胺合成酶的工程菌及其实现方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及的是一种生物基因工程【技术领域】的基因及其工程菌株，具体是一种灰 略红链霉菌的基于谷氨酰胺合成酶的工程菌及其实现方法。
【背景技术】
[0002] 氮是植物生长发育过程中最重要的营养元素之一。目前，维持或提高作物产量的 主要方法是大量施肥，然而氮肥的大量施用，不仅增加了农民的生产成本，而且会加剧水体 的富营养化及温室气体的排放。
[0003] 对作物而言，能够吸收同化N〇r、NH4+及氨态N等不同氮素形态，但是一般以 Ν0Γ为主要氮源。植物以Ν0Γ为氮源时，氮同化可以分为3个阶段：（1)氮的无机同化 (Ν0Γ - N02 - NH4+) ; (2)氨的同化，即NH4+经过谷氨酰胺合成酶（GS)合成谷氨酰胺，再由谷 氨酰胺经谷氨酸合酶（G0GAT)合成谷氨酸；（3)氨的有机同化，即由谷氨酰胺和谷氨酸合成 其它氨基酸，进而合成蛋白质和其他物质。由此可见，谷氨酰胺合成酶在氮同化通路中起着 十分关键的作用。
[0004] 生物体对氮元素的同化是十分重要的生理过程，无机氮必须同化为谷氨酰胺形式 的有机氮才能被生物体吸收利用。谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase, GS)是氮同化 途径的关键酶，它与谷氨酸合成酶共同作用，催化NH4+同化成谷氨酰胺，谷氨酰胺又在谷氨 酸合酶的催化下，将其酰胺转移到α -酮戊二酸上，从而生成两分子谷氨酸。谷氨酰胺在生 物体含氮有机物的生物合成中作为氮供体，而外界无机氮也必须通过这个途径才能进入生 物体内的氮循环。因此谷氨酰胺合成酶在生物体氮同化过程中起到十分重要的作用。
[0005] 土壤中含有十分丰富的细菌群体。细菌谷氨酰胺合成酶涵盖目前发现的三大类谷 氨酰胺合成酶GS I、GS II和GS III，且相比植物谷氨酰胺合成酶基因具有种类多、易克隆等 优势。灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens)是一种常见的土壤细菌，其谷氨酰胺 合成酶基因的克隆及功能鉴定对于鉴定氮高效基因并应用于逆境条件下土壤理化性质的 改善具有重要意义。
【发明内容】
[0006] 本发明针对现有技术存在的不足，提出一种基于谷氨酰胺合成酶的工程菌及其实 现方法，通过本发明所述的方法能够高效表达一种克隆自灰略红链霉菌谷氨酰胺合成酶， 可以克服谷氨酰胺合成酶在原始菌株内表达量较低等缺点，有助于解决肥料利用率较低等 问题，此外对于实现土壤中铵盐的快速转化进而培肥土壤，最终实现精准农业具有重大意 义。
[0007] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0008] 本发明涉及一种谷氨酰胺合成酶的工程菌，该工程菌为外源表达谷氨酰胺合成酶 的大肠杆菌。
[0009] 所述的胞内谷氨酰胺合成酶具体为灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD - 1谷氨酰胺合成酶大亚基基因 SG - GE，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，其氨基酸 序列如SEQ ID No. 2所示；核苷酸序列为1377bp，编码453个氨基酸。
[0010] 所述的谷氨酰胺合成酶编码基因通过全基因组测序和PCR扩增的方式克隆获得。
[0011] 所述的灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD - 1，现保藏于中国普通 微生物菌种保藏管理中心（CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. 5706,保藏日期为2012年1月9 日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所邮编100101。
[0012] 本发明涉及上述工程菌的实现方法，以灰略红链霉菌基因组DNA为模板，与含有 酶切位点的引物进行PCR扩增得到谷氨酰胺合成酶编码基因；然后将该基因插入大肠杆菌 表达载体PET - 22b (+)中得到含有谷氨酰胺合成酶编码基因的重组表达载体；再将重组表 达载体导入大肠杆菌表达菌株，筛选得到谷氨酰胺合成酶的工程菌。
[0013] 所述的含有酶切位点的引物包括：
[0014] GE - Msc I - F:GATGGCCATGGGGAAGCGGAAGATGGACAAGCAGC
[0015] GE _ EcoR I _ R:GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGCAGCACCGGCAGCAGGTTC
[0016] 所述的PCR扩增的条件为：98°C预变性3min ;98°C变性10s，55°C退火15s，68°C延 伸2min ;30个循环后68°C终延伸5min。
[0017] 所述的大肠杆菌表达菌株为Transetta(DE3)大肠杆菌。
[0018] 本发明涉及一种谷氨酰胺合成酶的工程菌的应用，将其应用于谷氨酰胺合成酶的 体外高效表达，并最终实现谷氨酰胺的工业发酵生产。 技术效果
[0019] 现有谷氨酰胺合成酶在灰略红链霉菌内为胞内酶且表达量很低，因此严重限制了 其使用范围和效果；与现有技术相比，本发明提供了一种全新的谷氨酰胺合成酶基因序列； 在特殊条件下（如高温以及碱性）具有更稳定的生物学活性；本发明通过构建外源表达载 体，实现了谷氨酰胺合成酶的体外过表达，并通过在表达重组蛋白C端添加聚组氨酸标签 的方法，维持蛋白活性的同时也最大程度的保证了蛋白纯度。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1为基于KEGG的灰略红链霉菌硝酸盐代谢通路预测图；
[0021] 图2为不同浓度硝酸盐培养下谷氨酰胺酶合成酶表达量变化图；
[0022] 图3为灰略红链霉菌谷氨酰胺合成酶信号肽预测图；
[0023] 图4为灰略红链霉菌谷氨酰胺合成酶氨基酸序列对比图；
[0024] 图5为灰略红链霉菌谷氨酰胺合成酶3D结构模型预测图。
【具体实施方式】
[0025] 下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。 实施例1
[0026] 本实施例包括以下步骤：
[0027] 1)灰略红链霉菌的分离及培养
[0028] 灰略红链霉菌分离自上海市浦江镇收集的腐烂秸杆，保藏编号为CGMCC No. 5706。 将该菌种接种于LB液体培养基，32 °C培养48h。
[0029] 上述LB液体培养基组分为：蛋白胨10. Og/L，酵母提取物5. Og/L，NaCllO. Og/L， pH6. 8 - 7. 2。在液体培养基中加入15. 0 - 20. 0g/L琼脂即得LB固体培养基。
[0030] 2)基因组DNA提取
[0031] 收集2. OmL菌液，12000rpm离心2min。弃上清，收集菌体沉淀，加入180 μ L溶菌酶 (20mg/mL)和20μLEDTA溶液（0·5M，pH8·0)，37°C处理45min，加入4μLRNaseA(100mg/ mL)，震荡混匀15s，室温放置5min，随后按照细菌DNA提取试剂盒（TIANGEN)操作说明完成 剩余操作，得到高纯度基因组DNA。通过0. 8%琼脂糖凝胶电泳确定基因组DNA质量，确保 无明显RNA条带，基因组条带清洗、完整、无降解、无污染。
[0032] 3)基因组测序
[0033] 确定全基因组鸟枪法（WGS)策略，采用第二代测序技术，构建不同插入片段长度 的文库，采用Illumina Miseq(2X250bp)平台进行测序。收集测序的原始数据，对带接头、 低质量的数据进行过滤，随后采用Newbler v2. 8对去除接头的测序数据进行从头拼接，构 建contig及scaffold,最后使用GapCloser程序进行缺口填补得到链霉菌基因组草图。
[0034] 4)蛋白编码基因功能预测
[0035] 采用Glimmerf. 0软件对全基因组序列进行基因预测。基因预测模型选取自我训 练基因预测模型，即提取拼装序列中最长的序列，以该序列作为基因预测模型训练的序列。 然后以该序列构建的基因预测模型，对所有序列进行基因预测，设定开放阅读框的长度为 ll〇bp，其余参数为Glimmer3. 0的默认设置。
[0036] 基于 KEGG 的硝酸盐代谢通路图：KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)，是基因组破译方面的数据库。KEGG注释的主要目的包括两个：K0(KEGG Ortholog)注释，即将分子网络的相关信息进行跨物种注释；KEGG Pathway注释，即代谢通 路注释，获得物种内分子间相互作用和反应的网络。
[0037] 蛋白编码基因的K0及Pathway注释主要采用KEGG的KAAS自动化注释系统完 成，其中基因集选择"For Prokaryote"，基因 K0的传递规则选取bi - directional best hit (BBH)。K0注释完成后，将K0映射到相应的KEGG Pathway通路上，得到灰略红链霉菌内 硝酸盐代谢通路（图1)。
[0038] 5)总RNA的提取
[0039] 将链霉菌接种于以KN03S唯一碳源的无机盐培养基，32°C、150rpm条件下培养 72h。每ia取样，离心收集菌体沉淀，并按细菌总RNA提取试剂盒要求（TIANGEN)提取高 纯度的链霉菌总RNA。
[0040] 上述无机盐培养基组分为：葡萄糖 20g/L，ΚΗ2Ρ041· 0g/L，NaClO. 5g/L，MgS040. 25g/ L，CaCl2 · 2H200. lg/L，FeS04 · 7H200. Olg/L 及 KN03(10mM, 30mM, 50mM，lOOmM)。
[0041] 6)谷氨酰胺合成酶表达水平测定
[0042] 根据谷氨酰胺合成酶基因序列，通过DNAMAN6.0软件设计特异性PCR引物，引物序 列如下：
[0043] GE - F:GCTGAGCCTGATGGAACGCA
[0044] GE - R:GCCTCCCACTCCTGCTTCT
[0045] 同样的，根据16S rRNA的特异性序列设计引物，并作为内参基因，引物序列如下：
[0046] 16S rRNA - F:CGTATTCACCGCAGCAATGC
[0047] 16S rRNA - R:GCGAGGTGGAGCGAATCTCA
[0048] 以链霉菌总RNA模板进行反转录获得cDNA文库，并按照荧光定量PCR试剂盒 (TaKaRa)要求进行相关操作。设置三个重复，待实验完成收集处理数据，分析在不同浓度 ΚΝ03作用下，谷氨酰胺合成酶的表达量（如图2)。结果表明，在以硝酸盐为唯一碳源的培 养基中，谷氨酰胺合成酶的表达量显著上调，证明该基因参与硝酸盐的代谢过程。
[0049] 上述荧光定量PCR反应条件为：95°C预变性30s ;95°C变性10s，60°C退火30s， 72°C延伸15s，共40个循环。
[0050] 7)序列检测：
[0051] 谷氨酰胺合成酶膜定位预测：采用SignalP4. 1分别对谷氨酰胺合成酶进行信号 肽模拟预测，如图3所示。结果表明谷氨酰胺合成酶不存在明显的信号肽序列，推测该酶为 胞内酶。
[0052] 谷氨酰胺合成酶氨基酸序列对比图：在NCBI数据库中进行blastp搜索，获取3条 与灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens)JSD-l谷氨酰胺酶合成酶序列最为接近的 氨基酸序列，并通过ClustalX和BOXshade程序进行序列比对，结果如图4所示。该谷氨酰 胺酶合成酶序列与已知的谷氨酰胺合成酶氨基酸序列具有较高的相似度，相似度最大可达 98%。
[0053] 硝酸盐还原酶3D模型预测：运用PHYRE2在线程序对谷氨酰胺酶合成酶的3D空间 模型进行预测。结果表明谷氨酰胺酶合成酶与PDB数据库中已有蛋白模型的最高相似度分 别可达35%，预测结果具有100%可信度。如图5所示，谷氨酰胺合成酶的C端（已注明） 裸露在蛋白表达，因此将其设定为聚组氨酸标签（His6 · Taq)的连接位点。 实施例2
[0054] 谷氨酰胺合成酶表达载体构建
[0055] 1)根据谷氨酰胺合成酶序列，设计含有酶切位点的引物，序列如下：
[0056] GE - Msc I - F:GATGGCCATGGGGAAGCGGAAGATGGACAAGCAGC
[0057] GE - EcoR I - R:GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGCAGCACCGGCAGCAGGTTC
[0058] 2)以灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens)基因组DNA为模板，用含有Msc I和EcoR I酶切位点引物进行PCR扩增获得谷氨酰胺合成酶基因序列，使用DNA A -Tailing Kit加 A后连接到T - Vector PMD?19 - T (TaKaRa)，并将连接产物转入DH5 α大肠杆菌内。 在氨苄（50 μ g/mL)抗性平板上挑选阳性克隆，摇菌提取质粒测序。若无误，Msc I和EcoR I进行双酶切（37°C )，回收谷氨酰胺合成酶大亚基DNA片段GE。用相同内切酶酶切表达载 体pET - 22b (+)并回收载体DNA片段。将GE与载体片段混合，T4 DNA Ligase (TaKaRa)过 夜连接（16°C)，将连接产物转入DH5a大肠杆菌感受态细胞内，通过抗性平板及菌落PCR 筛选含有质粒PET -22 -GE的阳性克隆。挑取阳性克隆接种于含有氨苄青霉素（50 μ g/mL) 的LB液体培养基中，180rpm、37°C培养16小时后提取质粒。
[0059] 上述PCR扩增条件为：98°C预变性3min ;98°C变性10s，68°C延伸lmin ;30个循环 后68°C终延伸5min。
[0060] 上述 PCR 反应使用的 DNA 聚合酶均为 PrimeSTAR? GXL Polymerase (TaKaRa)。
[0061] 3)谷氨酰胺合成酶过表达转基因菌株的构建：将上述谷氨酰胺合成酶表达载体 pET - 22 - GE转入Transetta (DE3)大肠杆菌，并在含有氨苄青霉素（50 μ g/mL)和氯霉素 (34 μ g/mL)的LB固体培养基上筛选，获得谷氨酰胺合成酶过表达菌株。
[0062] 上述的Transetta (DE3)具有以下特征：该菌株具有氯霉素（Canf)，且含有大肠杆 菌缺乏的6种稀有密码子（AGA，AGG，AGA，CUA，CCC，GGA)对应的tRNA，可有效提高外源基因， 尤其是真核生物及链霉菌等高GC含量生物基因在原核系统中的表达水平。
【权利要求】
1. 一种谷氨酰胺合成酶的工程菌，其特征在于，该工程菌为外源表达谷氨酰胺合成酶 的大肠杆菌； 所述的胞内谷氨酰胺合成酶具体为灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD - 1谷氨酰胺合成酶大亚基基因 SG - GE，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，其氨基酸 序列如SEQ ID No. 2所示；核苷酸序列为1377bp，编码453个氨基酸。
2. 根据权利要求1所述的工程菌，其特征是，所述的灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD - 1，现保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC)，保藏编号为 CGMCC No. 5706,保藏日期为2012年1月9日。
3. -种根据权利要求1或2中所述的工程菌的实现方法，其特征在于，以灰略红链霉 菌基因组DNA为模板，与含有酶切位点的引物进行PCR扩增得到谷氨酰胺合成酶编码基因； 然后将该基因插入大肠杆菌表达载体PET -22b (+)中得到含有谷氨酰胺合成酶编码基因的 重组表达载体；再将重组表达载体导入大肠杆菌表达菌株，筛选得到谷氨酰胺合成酶的工 程菌。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的含有酶切位点的引物包括： GE - Msc I - F:GATGGCCATGGGGAAGCGGAAGATGGACAAGCAGC GE - EcoR I - R:GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGCAGCACCGGCAGCAGGTTC。
5. 根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的PCR扩增的条件为：98°C预变性 3min ;98°C变性 10s，55°C退火 15s，68°C延伸 2min ;30 个循环后 68°C终延伸 5min。
6. 根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的大肠杆菌表达菌株为 Transetta(DE3)大肠杆菌。
7. -种含有上述任一权利要求所述的谷氨酰胺合成酶的工程菌及其应用，其特征在 于，将其用于谷氨酰胺合成酶的体外高效表达，并最终实现谷氨酰胺的工业发酵生产。
【文档编号】C12N1/21GK104140945SQ201410374683
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2014年7月31日 优先权日:2014年7月31日
【发明者】周培, 冯海玮, 孙玉静, 毛亮, 支月娥, 唐冬, 卫星, 罗艳青 申请人:上海交通大学