一种土壤或沉积物样品的微生物采集方法
【专利摘要】本发明涉及一种低生物量环境中土壤或沉积物微生物的采集与保存方法，包含以下步骤：在除菌处理过的碱性高渗透压缓冲液中加入土壤或沉积物样品，搅拌均匀后静置，收集上层液体；在上层液体中加入土壤或沉积物样品，搅拌均匀后静置，收集上层液体；重复步骤2；最后将所得上层液体密封后常温保存。本发明所述方法通过野外现场震荡搅拌方法收集微生物细胞，操作步骤简单，可在短时间收集大量微生物细胞，并在常温下保存与运输样品，适用于沙漠、戈壁、冻土区、海洋等微生物量低的环境中土壤或沉积物微生物的采集与保存。
【专利说明】一种土壤或沉积物样品的微生物采集方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物领域，具体涉及一种低微生物量的土壤或沉积物样品的微生物采集方法。
【背景技术】
[0002]目前用于分子生物学分析的微生物样品采集和保存方法主要是现场采集后迅速低温冷冻，即在野外现场取一定量土壤或沉积物样品密封后，使用冰箱、液氮或干冰等方法冷冻保存，运输过程全程需保持低温冷冻状态。该方法存在以下问题:
[0003]I)对温度要求严格。低温冷冻保存必须保证样品从采集到运输过程，均需要严格保证低温过程，而在野外施工时常常难以保证低温。
[0004]2)运输困难。使用冰箱、干冰或液氮保存的冷冻样品，从野外运到实验室的过程，实现起来比较困难。
[0005]3)低生物量样品难以操作。在沙漠、戈壁滩、冻土区、海洋等微生物含量比较低的极端环境使用时，需要采集大量样品进行冷冻保存，才能保证微生物量能满足后续实验要求，这对样品的采集和保存运输均提出了较高的要求。
[0006]鉴于低温冷冻方法存在的弊端，开发一种简洁有效的样品采集与保存方法对于低微生物量的土壤或沉积物样品的后续分子生物学分析尤为重要。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是克服现有冷冻保存的弊端，为低微生物量的野外现场土壤或沉积物样品提供一种新的微生物采集方法。
[0008]本发明提供的土壤或沉积物样品的微生物采集方法，包含以下步骤:
[0009]I)在除菌处理过的碱性高渗透压缓冲液中加入土壤或沉积物样品，搅拌均匀后静置，收集上层液体；
[0010]2)在上层液体中加入同样的土壤或沉积物样品，搅拌均匀后静置，收集上层液体；
[0011]3)重复步骤2;
[0012]4)将所得上层液体密封后常温保存。
[0013]作为优选，所述步骤I)中碱性高渗透压缓冲液为pH为8.0-10.0的高渗缓冲液。
[0014]更优选地,所述高渗缓冲液为鹿糖缓冲液。
[0015]作为优选，所述除菌处理为用孔径为0.2um的水系微孔滤膜处理。
[0016]作为优选，所述蔗糖缓冲液成分为:10-50mmol/L EDTA, 100_500m mol/L NaCl,
0.5-2Μ 蔗糖，20-100m mol/L Tris-HCl0
[0017]作为优选，步骤3)所述重复为至少重复3次。
[0018]作为优选，步骤I)与步骤2)液体体积与样品重量以ml/g计为(20-50):1。
[0019]作为优选，所述步骤4)重复至少3次。
[0020]试验结果显示，使用本发明所述方法采集样品提取的DNA浓度比常规冷冻方法提取的DNA浓度高；通过PCR扩增进一步确认本发明所用方法保存的DNA的有效性，扩增产物使用浓度为1.5% (质量分数)的琼脂糖凝胶电泳检测扩增效率，结果显示，使用本发明所述方法采集保存的DNA，用于PCR扩增时，可获得更为高效的扩增结果。以上结果说明，本发明所述方法作为常规冷冻保存方法的替代方法，适用于沙漠、戈壁、冻土区、海洋等微生物量低的环境中土壤或沉积物分子生物学样品的采集与保存。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为低微生物量的样品细胞DNA琼脂糖凝胶电泳图。M为分子量Marker，泳道1-6为本发明所述保存方法提取的DNA，泳道7-12为常规冷冻保存方法提取的DNA。
[0022]图2为低微生物量的样品细胞DNA使用16S rDNA引物349F和806R进行PCR扩增之后的琼脂糖凝胶电泳图。M为分子量Marker，泳道1_10为常规冷冻样品PCR扩增产物，泳道11-20为本发明所述方法保存样品PCR扩增产物。
【具体实施方式】
[0023]本发明公开了一种低微生物量的分子生物学样品采集与保存方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0024]为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
[0025]实施例1:
[0026]所涉及区域是青藏高原一块高海拔草甸区，该地区属于永久冻土带，地表有少量植被，微生物量低，土壤样品中含有大量石块。要在该地区开展天然气水合物等勘探，研究微生物多样性，需要布设大规模测线或测网，需要采集大量地表土壤样品。使用常规方法采样，因微生物量低，每个站点需采集大量样品，既耗时又难以运输，且高海拔野外地区难以实现样品快速冷冻。
[0027]本发明所述低微生物量的样品采集与保存方法具体实施步骤如下:
[0028]1.根据实际勘探情况，在工作区选取已布设的测线2条，样品采集间距为250m，采样深度为20cm。
[0029]2.每个采样点按照常规方法采集两份相同样品，一份用于冷冻保存，一份用于本发明所述方法保存。所有样品使用20目样品筛过筛处理。
[0030]3.配制蔗糖缓冲液，其成分为:10-50mmol/L EDTA, 100-500mmol/L NaCl, 0.5-2M蔗糖，20-100m mol/L Tris_HCl，用NaOH调节pH值；使用微孔滤膜过滤除菌；取一定体积上述过滤除菌的缓冲液倒入烧杯中，加入一定质量土壤(或沉积物)样品，剧烈震荡或搅拌，之后自然沉淀；重复收集细胞:将上步骤中的上层液体转出，再次加入一定质量土壤(或沉积物)样品，剧烈震荡或搅拌，自然沉淀。此过程根据实际情况至少重复3次；上述收集细胞时所加入缓冲液与样品(或沉积物)的比例为(20-50)ml/g，震荡或搅拌时间不少于5min，使样品中的细胞充分悬浮，沉淀过程不少于3min，使土壤(或沉积物)样品尽可能沉淀。若样品中含有较多石块、草根等杂物，需使用20目以上样品筛过筛处理，样品筛使用前用酒精灼烧灭菌。
[0031]4.冷冻样品按照常规方法_20°C冷冻，干冰运输，实验室内-20°C冰箱冷冻保存，化学试剂保存样品常温运输，实验室内室温保存。保存周期均为30天。
[0032]实施例2:本发明所述方法与常规冷冻方法对比
[0033]实验室采用相同方法取两种样品提取DNA，提取参考专利号:ZL201010536640.6所提及的方法。基本操作如下:
[0034]取一定量样品放入提取缓冲液，加入蛋白酶K和溶菌酶，37°C震荡，之后加入SDS65°C水浴，充分裂解细胞释放DNA，离心取上清得到DNA裂解液。加入聚乙二醇4°C沉淀DNA,离心收集DNA。
[0035]为保证两种提取方法所用样品量一致，操作如下:冷冻样品秤取lg。本发明使用方法采样时收集土壤样品20g，最后所有上层液体保存于10ml离心管中，提取DNA时，液体充分震荡混匀后，取5ml液体(相当于Ig 土壤样品)。
[0036]取提取的DNA使用浓度为0.8% (质量分数)的琼脂糖凝胶电泳，对比两种方法提取的DNA片段长度，以检测本发明保存方法的有效性。冷冻样品和化学试剂保存样品DNA如图1所示，图1展示的是两种保存方式保存的样品DNA琼脂糖凝胶电泳结果，其中1-6为本发明所述方法保存的DNA，泳道7-12为常规冷冻保存方法提取的DNA，泳道1、7为同一个采样点样品，以此类推。电泳上样量均为10ul。结果显示，使用本专利所述方法采集样品提取的DNA浓度比常规冷冻方法提取的DNA浓度高。具体分析原因如下:一方面本发明使用的高渗蔗糖缓冲液可以在保存过程中裂解细胞，释放DNA，另一方面碱性缓冲环境可以保护DNA，防止降解。
[0037]取本发明所述方法提取DNA溶液稀释10倍，使用引物349F(5/ -AGGCAGCAGTDRGGAAT-3')和 806R(5' -GGACTACYVGGGTATCTAAT-3')进行 PCR扩增。该对引物可用于扩增细菌16S rDNA序列，适用于微生物多样性研究。
[0038]通过PCR扩增进一步对比确认该发明所用方法保存的DNA的有效性。扩增产物使用浓度为1.5% (质量分数)的琼脂糖凝胶电泳检测扩增效率。
[0039]冷冻样品和本发明所述方法保存样品PCR扩增后凝胶电泳图如图2所示，图2显示两种保存样品方法提取的DNA进行PCR扩增后的电泳结果，电泳上样量均为5ul，其中1-10为常规冷冻保存方法提取的DNA，泳道11-20为本发明所述方法保存的DNA，泳道1、11为同一个采样点样品，以此类推。结果显示，使用本发明所述方法采集保存的DNA，用于PCR扩增时，可获得更为高效的扩增结果。分析原因为使用缓冲液震荡悬浮细胞时，将细胞与土壤(或沉积物)中的杂质如多糖、蛋白等尽可能分离，获得杂质较少的微生物细胞悬浊液，在提取DNA后进行PCR扩增时，可有效降低杂质的影响。
[0040]对比图1及图2的结果，说明本发明所采用的细胞收集和化学试剂保存方法，可用于分子生物学样品的野外采集。本发明所采用的细胞收集和常温化学试剂保存方法，能有效解决该种环境中的样品采集与保存问题。
[0041]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种土壤或沉积物样品的微生物采集方法，其特征在于，包含以下步骤: 1)在除菌处理过的碱性高渗透压缓冲液中加入土壤或沉积物样品，搅拌均匀后静置，收集上层液体； 2)在上层液体中加入同样的土壤或沉积物样品，搅拌均匀后静置，收集上层液体； 3)重复步骤2； 4)将所得上层液体密封后常温保存。
2.如权利要求1中所述的微生物采集方法，其特征在于，所述的步骤I)中碱性高渗透压缓冲液为PH为8.0-10.0的高渗缓冲液。
3.如权利要求2中所述的微生物采集方法，其特征在于，所述高渗缓冲液为蔗糖缓冲液。
4.如权利要求1中所述微生物采集方法，其特征在于，所述除菌处理为用孔径为0.2um的水系微孔滤膜处理。
5.如权利要求3中所述微生物采集方法，其特征在于，所述蔗糖缓冲液成分为:10-50mmol/L EDTA, 100_500m mol/L NaCl, 0.5-2M 蔗糖，20_100m mol/L Tris-HCl0
6.如权利要求1所述微生物采集方法，其特征在于，步骤3)所述重复为至少重复3次。
7.如权利要求1所述微生物采集方法，其特征在于，步骤I)与步骤2)液体体积与样品重量以ml/g计为(20-50):1。
【文档编号】C12Q1/24GK104232738SQ201410374991
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年7月31日 优先权日:2014年7月31日
【发明者】张勇, 邓诗财, 郝纯, 梅海 申请人:盎亿泰地质微生物技术（北京）有限公司