H7n9亚型禽流感病毒诊断环介导等温扩增试剂盒及使用方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于H7N9亚型禽流感病毒诊断的环介导等温扩增试剂盒及其使用方法。所述试剂盒，其特征在于，分别由HA基因及NA基因环介导等温扩增引物混合液、环介导等温扩增反应预混液、HA基因及NA基因体外转录RNA阳性质控品和阴性质控品构成，可进行H7N9亚型禽流感病毒的快速诊断。所述试剂盒的使用方法，其特征在于，可通过等温扩增荧光检测系统实现H7N9亚型禽流感病毒实时快速诊断。该方法特异性强，灵敏度高，为H7N9亚型禽流感病毒的防控及流行趋势调查分析提供了一种简便、快速的途径。
【专利说明】H7N9亚型禽流感病毒诊断环介导等温扩增试剂盒及使用 方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一套用于病毒快速诊断的引物组、试剂盒及使用方法，尤其涉及一套 用于诊断H7N9亚型禽流感病毒的环介导等温扩增引物组、试剂盒及其使用方法，属于禽流 感病毒检测领域。
【背景技术】
[0002] 禽流感是由A型流感病毒引起的一种禽类的急性高度致死性传染病。1878年发生 在意大利，随后，在其它欧洲国家、南美、东南亚、美国和前苏联也时有发生。由于禽流感的 变异太多，不宜有效检测控制，其疫情传播的风险性引起了国际社会的高度关注。2005年9 月29日，被联合国秘书长安南任命为联合国禽流感事务协调员的世界卫生组织（WHO)专家 大卫纳巴罗（David Nabarro)博士说："下一场流感爆发随时可能到来，而根源可能正是目 前肆虐于亚洲地区的禽流感病毒的某种变体。如果出现一场流感大爆发，500万到1. 5亿人 将会丧生"。据亚洲开发银行初步估计，如果爆发一场严重的禽流感疫情，亚太地区在短期 内就将蒙受2500亿至2900亿美元（约4235亿至4912亿新元）的经济损失。
[0003] H7N9亚型禽流感病毒是于2013年3月底全球首次发现的新亚型流感病毒，临床 症状表现主要为：高烧，咳嗽，气促，呼吸困难，缺氧，胸片显示下呼吸道浑浊，浸润，片状阴 影。感染并发症包括脓毒性休克，呼吸衰竭，急性呼吸窘迫综合症，难治性低氧血症，急性肾 功能障碍，多器官功能障碍，横纹肌溶解症，肝性脑病，细菌和真菌感染等。2013年4月经 调查，H7N9亚型禽流感病毒基因来自于东亚地区野鸟和中国上海、浙江、江苏鸡群的基因重 配。截止至2013年8月，实验室确诊H7N9型感染病例共计132人，其中43例死亡，病例分 布于北京、上海、江苏、浙江、安徽、山东、河南、台湾、福建等地。新型H7N9亚型禽流感的出 现，给全社会带来了恐慌，因此研究开发一种行之有效的H7N9亚型禽流感病毒快速诊断试 剂盒，具有极其重要的意义。
[0004] 目前，禽流感病毒的临床诊断方法主要包括病毒分离方法、血清学检测方法和分 子生物学方法三大类。其中，临床应用的分子生物学方法主要指实时荧光定量PCR核酸分 子诊断方法，也是诊断H7N9亚型禽流感病毒最常用的方法。然而，传统的PCR反应对温度 具有一定的依赖性，要求精密控温系统，检测时间长，实验成本高。环介导等温扩增（LAMP) 法是2000年由日本Notomi博士发明的一种新的核酸扩增技术，更具有简便、快速、敏感性 高和特异性强等优点。经过十几年的发展，该方法得到不断完善，尤其在结果判定方面，已 有多种肉眼可视的方法及实时荧光检测法得到广泛应用，可从源头上控制住由电泳开盖造 成的气溶胶污染，尤其适合于现场快速检测以及床旁检测。
【发明内容】
[0005] 本发明的主要目的是提供一套用于H7N9亚型禽流感病毒快速诊断的环介导等温 扩增引物组，由HA基因环介导等温扩增引物组、NA基因环介导等温扩增引物组构成，可用 于H7N9亚型禽流感病毒环介导等温扩增反应。
[0006] 所述H7N9亚型禽流感病毒环介导等温扩增引物组是通过大量比对Genbank中下 载的不同亚型H7N9甲型禽流感病毒HA及NA的核酸序列，针对特异性差异较大的片段所设 计。其中，HA基因引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，NA基因引物组包括 一对外引物和一对内引物。HA基因引物组的内引物与外引物按6 : 1-12 : 1的比例配制 成，优选比例为8 : 1，环引物与内引物的比例为1 : 2;NA基因引物组的内引物与外引物 按6 : 1-12 : 1的比例配制成，优选比例为8 : 1。
[0007] 所述的环介导等温扩增反应预混液，可以是使扩增产物发出荧光信号的一种商品 化试剂盒Isothermal Master Mix或者等效的其他试剂盒，由Bst聚合酶、dNTP、甜菜碱、 MgSOjP缓冲溶液组成，及逆转录酶如AMV reverse transcriptase或者等效的其他逆转录 酶构成。试剂盒中还同时引入一组阳性质控品和阴性质控品，其中HA基因及NA基因阳性 质控品，为经体外转录纯化得到的RNA片段，其浓度均为ZxKTcopies/μ L，阴性质控品是 不含各引物组的介质溶液。
[0008] 所述Η7Ν9亚型禽流感病毒的环介导等温扩增反应体系的总体积为25yL，其 中包括HA/NA基因环介导等温扩增引物组溶液6 μ L/4 μ L，环介导等温扩增反应预混液 14 μ Ι7?6μ L，待测试样或者阳性质控品或者阴性质控品各5μ L ;环介导等温扩增荧光检 测系统的扩增程序为：① 63°c，60min，② 98°C -80°c，0· 05°C /s，lOmin。
[0009] 所述的H7N9亚型禽流感病毒诊断试剂盒，实时荧光检测法中每个反应荧光信号 达最大值所对应的扩增时间与模板RNA初始拷贝数的对数值之间，在10 5拷贝数-1011拷贝 数范围内具有线性关系，R2 > 0. 990,可根据该标准曲线进行待测样本模板RNA拷贝数的测 定；该方法HA基因与NA基因的检出限都可达到单拷贝/反应。
[0010] 扩增结果的分析和判定方法包括：
[0011] 1)环介导等温扩增荧光检测系统测得的扩增曲线平台荧光值高于本底噪音信号 5倍且溶解曲线为单一尖锐峰的判定为阳性结果，扩增曲线平台荧光值低于本底噪音信号 5倍的判定为阴性结果，扩增曲线平台荧光值高于本底噪音信号5倍但溶解曲线不是单一 尖锐峰的判定为非特异性的交叉干扰信号。
[0012] 2)阳性质控品各反应管全部为阳性结果，阴性质控品各反应管全部为阴性结果的 视为有效试验，否则试验无效，重新进行。
[0013] 3)待测试样各反应管全部为阴性结果，则未检测到H7N9亚型禽流感病毒；待测试 样各反应管任意一管为阳性结果，则为H7N9亚型禽流感病毒感染。其中HA基因的扩增曲 线以15min时的读数为基准，NA基因的扩增曲线以30min时的读数为基准。
[0014] 一种用于H7N9亚型禽流感病毒诊断的环介导等温扩增试剂盒的使用方法，还包 括荧光信号达到最大值所对应的扩增时间与模板RNA(HA、NA基因）初始拷贝数的量化关 系分析。其方法为，分别配制浓度均为10 11拷贝数/反应、101°拷贝数/反应、1〇9拷贝数/ 反应、10 8拷贝数/反应、107拷贝数/反应、106拷贝数/反应、105拷贝数/反应的HA基因 和NA基因体外转录RNA阳性质控品水溶液系列，用环介导等温扩增荧光检测系统分别测定 RNA阳性质控品水溶液系列，以各反应荧光信号达到最大值时所对应的扩增时间为纵坐标， 以模板RNA初始拷贝数对数值为横坐标，建立关系曲线。利用该曲线，通过测定未知模板荧 光信号达到最大值所对应的扩增时间，即可测得待测模板RNA的初始拷贝数。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1甲醛变性MOPS凝胶电泳鉴定HA及ΝΑ基因体外转录RNA阳性质控品纯度及 完整性
[0016] 图2实时荧光检测法ΗΑ基因引物特异性实验结果。
[0017] (a)实时荧光扩增曲线，（b)实时荧光溶解曲线
[0018] 图3实时荧光检测法NA基因引物特异性实验结果。
[0019] (a)实时荧光扩增曲线，（b)实时荧光溶解曲线
[0020] 图4荧光信号达最大值所对应的扩增时间与模板RNA(HA基因）初始拷贝数对数 值间的关系曲线。
[0021] (a)实时荧光扩增曲线（HA基因），（b)函数关系曲线（HA基因）
[0022] 图5荧光信号达最大值所对应的扩增时间与模板RNA(NA基因）初始拷贝数对数 值间的关系曲线。
[0023] (a)实时荧光扩增曲线（NA基因），（b)函数关系曲线（NA基因）
[0024] 具体实施方法
[0025] 下面结合附图，对本发明的具体实施方法做进一步详细描述，本发明的优点和特 点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何 限制，本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术 方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0026] 实施例
[0027] 1.试验材料与方法
[0028] 1. 1试验材料
[0029] H7N9亚型禽流感病毒HA及NA基因人工合成片段，是参考Genbank上已发表的序 列（HA基因序列号为KC853766. 1，NA基因序列号为KC853765. 1)人工合成，片段连接到pCR Π载体上，并转化至感受态细胞DH5 α，以30%甘油的菌液的形式储存。
[0030] 1.2引物设计
[0031] 运用DNAMAN软件对Η7Ν9亚型禽流感病毒ΗΑ及ΝΑ基因进行比对，选择ΗΑ 及ΝΑ基因差异性较大的片段作为祀序列，运用在线软件PrimerExplorer V4(http :// primerexplorer. jp/e/)设计HA及ΝΑ基因的环介导等温扩增引物组。HA基因环介导等温 扩增引物组，由一对外引物（SEQ No. 1、SEQ No. 2)、一对内引物（SEQ No. 3、SEQ No. 4)和一 对环引物（SEQ No. 5、SEQ No. 6)组成，其引物序列为：
[0032]
【权利要求】
1. 一套用于H7N9亚型禽流感病毒诊断的环介导等温扩增引物组，由血凝素（HA)基因 环介导等温扩增引物组、神经氨酸酶（NA)基因环介导等温扩增引物组构成，其特征在于， 可用于2013年春夏季节爆发的H7N9亚型禽流感病毒诊断时的环介导等温扩增反应； 所述H7N9亚型禽流感病毒HA基因环介导等温扩增引物组，其特征在于，由一对外引物 (SEQ No. 1、SEQ No. 2)、一对内引物（SEQ No. 3、SEQ No. 4)和一对环引物（SEQ No. 5、SEQ No. 6)组成，其引物序列为：
〇
2. 如权利要求1所述的H7N9亚型禽流感病毒HA基因环介导等温扩增引物组、H7N9亚 型禽流感病毒NA基因环介导等温扩增引物组，其特征在于，用于H7N9亚型禽流感病毒检测 的方法包括： 1) 实时荧光检测法，其特征在于，使用环介导等温扩增荧光检测系统实现同步等温扩 增并实时检测反应管中的荧光信号，获得等温扩增曲线和溶解曲线，进而判定检测结果； 2) 实时浊度检测法，反应时实时监测反应管中浊度信号，获得等温扩增曲线，进而判定 检测结果； 3) 紫外照射荧光检测法，扩增反应后将反应管中反应液在紫外光下照射，呈红色荧光 的检测为阳性结果，不呈红色的检测为阴性结果； 4) 直接荧光目测法，其特征在于，在扩增反应前向反应管中加入钙黄绿素作为荧光指 示剂，可通过肉眼直接判定结果，反应管中反应液呈绿色的为阳性结果，不呈绿色的为阴性 结果； 5) 凝胶电泳检测法，其特征在于，反应后反应液电泳时有特征梯形条带者为阳性结果， 无特征梯形条带者为阴性结果； 6) 微全分析法或者微流控芯片法或者芯片实验室法，其特征在于，样品裂解、核酸提取 纯化、等温扩增和检测均集成在微全分析系统上自动完成，结果判定方法包括前述的实时 荧光检测法、实时浊度检测法、紫外照射荧光检测法、直接荧光目测法、凝胶电泳检测法，该 微全分析系统由微膜片泵（阀）驱动，通过程序控制微膜片泵（阀）的开启与闭合实现微 流体样品的驱动控制。
3. -种如权利要求1所述的H7N9亚型禽流感病毒环介导等温扩增引物组，用于H7N9 亚型禽流感病毒诊断的试剂盒，主要由HA基因环介导等温扩增引物组溶液、ΝΑ基因环介导 等温扩增引物组溶液、环介导等温扩增反应预混液、ΗΑ基因及ΝΑ基因体外转录RNA阳性质 控品和阴性质控品构成，其特征在于，采用实时荧光检测方法，可以进行Η7Ν9亚型禽流感 病毒的快速诊断； 所述Η7Ν9亚型禽流感病毒ΗΑ基因环介导等温扩增引物组溶液，其特征在于，是由 一对内引物、一对外引物和一对环引物按一定的比例配置而成，其中内引物与外引物按 6 : 1-12 : 1的比例配制成，优选比例为8 : 1，环引物与内引物的比例为1 : 2;所述ΝΑ 基因环介导等温扩增引物组溶液，其特征在于，是由其中的内引物与外引物按6 : 1-12 : 1 的比例配制成，优选比例为8 : 1 ;所述环介导等温扩增反应预混液，其特征在于，由Bst聚 合酶、dNTP、甜菜碱、MgS04和缓冲溶液，及逆转录酶如AMV reverse transcriptase或者等 效的其他逆转录酶构成，包括可使扩增产物发出荧光信号的一种商品化试剂盒Isothermal Master Mix或者等效的其他试剂盒；所述HA基因及ΝΑ基因阳性质控品，其特征在于，是由 涵盖上述引物扩增的ΗΑ基因及ΝΑ基因区域人工合成片段构建的质粒，经体外转录纯化得 到的RNA片段，其浓度均为ZxKTcopies/μ L ;所述阴性质控品，其特征在于，为不含各引物 组的介质溶液。
4. 如权利要求3所述的Η7Ν9亚型禽流感病毒诊断试剂盒，其特征在于，在ΗΑ及ΝΑ基 因环介导等温扩增反应管内分别加入相应环介导等温扩增引物组溶液6μ L或者4 μ L，环 介导等温扩增反应预混液14 μ L或者16 μ L，待测试样或者阳性质控品或者阴性质控品各 加入5 μ L ;所述实时荧光检测方法，其特征在于，使用环介导等温扩增荧光检测系统实现 同步等温扩增并实时检测反应管中的荧光信号，获得等温扩增曲线和溶解曲线，荧光检测 系统的扩增程序为：① 63°c，60min，② 98°C -80°c，0· 05°C /s，lOmin。
5. 如权利要求3所述的H7N9亚型禽流感病毒诊断试剂盒，其特征在于，实时荧光检测 法中每个反应荧光信号达最大值所对应的扩增时间与模板RNA初始拷贝数的对数值之间， 在1〇 5拷贝数-1011拷贝数范围内具有线性关系，R2 > 〇. 990,可根据该标准曲线进行待测 样本模板RNA拷贝数的测定；该方法HA基因与NA基因的检出限都为单拷贝/反应。
6. 如权利要求3所述的H7N9亚型禽流感病毒诊断试剂盒的使用方法，其特征在于，扩 增结果的分析和判定方法包括： 1) 环介导等温扩增荧光检测系统测得的扩增曲线出现平台时，其荧光值高于本底噪音 信号5倍且溶解曲线为单一尖锐峰的判定为阳性结果，其荧光值高于本底噪音信号5倍但 溶解曲线不是单一尖锐峰的判定为非特异性的交叉干扰信号；其荧光值低于或等于本底噪 音信号5倍的判定为阴性结果； 2) 阳性质控品各反应管全部为阳性结果且阴性质控品各反应管全部为阴性结果的视 为有效试验，否则试验无效，重新进行； 3) 当待测试样HA及NA基因环介导等温扩增反应管全部为阴性结果时，则未检测到 H7N9亚型禽流感病毒；待测试样某一反应管为阳性结果，则为H7N9亚型禽流感病毒感染； 其特征在于，HA基因的扩增曲线以15min时的读数为基准，NA基因的扩增曲线以30min时 的读数为基准。
【文档编号】C12Q1/70GK104099430SQ201410375338
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年8月1日 优先权日:2014年8月1日
【发明者】邹明强, 薛强, 殷宏 申请人:中国检验检疫科学研究院