一种人胆管癌血清中的肿瘤标记物及其检测方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种人胆管癌血清中的肿瘤标记物及其检测方法和应用，主要是一种人胆管癌血清exosome中的微小RNA的序列及其检测技术。所述肿瘤标记物的miRNA序列为：miR-CCA序列：3’UGAUCGACUGUGCCUCUGGAU5’。检测方法主要包括以下步骤：1.提取外周血血清，超滤离心去除大部分游离miRNA，保留exosome;2.exosome中miRNA的提取；3.通过RT-PCR方法检测血清exosome中miR-CCA的表达水平。本发明能够快速、便捷、准确的检查出血清exosome中miR-CCA的表达水平，有助于人胆管癌的诊断和鉴别诊断。
【专利说明】一种人胆管癌血清中的肿瘤标记物及其检测方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及人胆管癌的诊断方法,尤其是一种人胆管癌血清中的exosome miRNA 肿瘤标志物及其检测方法和应用。
【背景技术】
[0002] 人胆管癌是继肝癌之后的第二大肝胆系恶性肿瘤。目前，手术切除或肝移植是可 能治愈人胆管癌唯一有效的治疗手段，但由于人胆管癌发病隐匿，侵袭性强，大部分患者就 诊时已出现淋巴或远处转移，导致其手术根治率低，因此总生存预后结局非常差，其5年生 存率仅为20% - 40%。早期预防、早期发现、早期治疗是提高人胆管癌手术根治率和5年 生存率的关键。
[0003] 目前针对人胆管癌的诊断手段仍然有限，B超、CT、MRI等影像学检查技术仍然是 人胆管癌的主要诊断方法，但当患者出现临床症状，或影像学检查发现肿瘤时，患者大多已 是进展期肿瘤，手术切除率和根治率低，目前针对人胆管癌，仍然缺乏一种特异的和敏感的 血清学诊断方法。目前，血清CA 19-9是人胆管癌诊断的主要血清学肿瘤标记物，对鉴别人 胆管癌和原发性肝癌具有一定的诊断价值，对人胆管癌术后复发亦有提示作用，但对人胆 管癌的早期诊断和早期发现，仍然缺乏特异性和敏感性，其它蛋白质和肽类的血清学肿瘤 标记物目前还未发现有优于CA 19-9的。
[0004] 微小RNA(microRNA，miRNA)是一类内源性的具有调控功能的长约20?25个核苷 酸的非编码RNA，其功能是通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，导致靶mRNA降解或者阻 遏靶mRNA的翻译，是真核生物基因转录后调节mRNA翻译的重要手段。2008年，血清中的 miRNA首次被发现，其表达稳定，在肿瘤分类、分子分期和追踪转移灶等方面具有独特优势， 特别适合原发肿瘤的筛查和早期诊断。此后有多项研究均发现某些循环miRNA的表达水 平与肿瘤发生和预后存在相关性，相关的研究疾病包括肺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺 癌、结直肠癌等等。miRNA以其在血清中的稳定性，易于检测，与肿瘤发生相关性1?，具有其 特定的生物学功能等特点，成为新的肿瘤标记物广受重视。
[0005] 肿瘤细胞分泌入血清的miRNA主要有2种，一种称为游离miRNA，另一种是通过外 切体（exosome)囊泡中的miRNA，称为exosome miRNA。外切体（exosome)是指由多种细胞 分泌释放到细胞外基质的一种直径约60?IOOnm的膜性囊泡，其内可能含有MHC I类和/ 或II类分子、热休克蛋白及一些生物酶类等，具有诱导机体免疫激活的功能。
[0006] 目前对于肿瘤相关的循环miRNA的研究大多集中于血清总体miRNA表达水平的变 化，而对血楽中exosomal miRNA表达水平的相关研究报道极少，其原因与血楽中exosome 分离困难、提取量少、费用昂贵有关。Exosomal miRNA在细胞外环境中比游离miRNA更加稳 定，能抵御RNA酶、蛋白酶的降解，并且冷热酸碱环境下它的活性改变不大；另外exosomal miRNA还具有独特的介导细胞间通讯的功能，能特异性抑制靶细胞中的靶基因表达，因此与 血清总体miRNA相比，血清exosomal miRNA水平的变化更加能代表恶性肿瘤的生物学功能 的变化。发明人通过前期研究建立了一种基于超滤离心技术的exosome提取方法，极大地 简化了 exosome的提取步骤和费用，可方便地用于血楽exosomal miRNA的提取和检测。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于，克服现有缺陷，提供一种血清exosome miRNA肿瘤标记物 (miR-CCA)为人胆管癌的早期诊断，提供新的检测技术。
[0008] 为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
[0009] 一种人胆管癌血清中的肿瘤标记物，其miRNA序列为：
[0010] miR-CCA 序列：3, UGAUCGACUGUGCCUCUGGAU 5，。
[0011] 本发明的另一个目的是提供一种人胆管癌血清中肿瘤标记物的检测方法，包括以 下步骤：
[0012] a.提取外周血血清，超滤离心去除血清中大部分游离miRNA,保留exosome ;b.提 取exosome中的miRNA ;c.通过RT-PCR方法检测血清exosome中miR-CCA的表达水平。
[0013] 进一步，所述步骤 c 中采用的 RT 引物：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTG GATACGACACTAGCT，上游引物：ATCCAGAGACACAG，下游通用引物：GTGCAGGGTCCGAGGT。
[0014] 具体的，前述核苷酸序列表为：
[0015]
[0016]
【权利要求】
1. 一种人胆管癌血清中的肿瘤标记物，其特征在于，miRNA序列为：miR-CCA 序列：3' UGAUCGACUGUGCCUCUGGAU 5'
2. -种人胆管癌血清中的肿瘤标记物的检测方法，其特征在于，包括以下步骤： 提取外周血血清，超滤离心去除血清中大部分游离miRNA,保留exosome;b.提取 exosome中的miRNA ;c.通过RT-PCR方法检测血清exosome中miR-CCA的表达水平。
3. 根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤c中采用的RT引物：GTCGTAT CCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACTAGCT，上游引物：ATCCAGAGACACAG，下游通 用引物：GTGCAGGGTCCGAGGT。
4. 如权利要求1所述的肿瘤标记物在制备人胆管癌诊断试剂中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK104372001SQ201410391140
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年8月11日 优先权日:2014年8月11日
【发明者】曹利平, 丁国平, 陈炯煌 申请人:浙江大学