一种外切型琼胶酶及其编码基因与应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种外切型琼胶酶及其编码基因与应用，一种外切型琼胶酶AgaO，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。编码所述外切型琼胶酶AgaO的基因，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。本发明所述的琼胶酶AgaO降解琼脂糖过程中寡糖主产物始终是新琼二糖，且酶的性质稳定，具备工业应用的潜质。
【专利说明】一种外切型琼胶酶及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种外切型琼胶酶及其编码基因与应用，属于基因工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 琼胶（Agar)主要产自江蓠、紫菜等食用红藻，与褐藻胶、卡拉胶并称产量最大、用 途最广的三大海洋多糖，广泛应用于食品、医药和化工行业。琼脂糖（Agarose)是琼胶的主 要成分之一，属中性多糖，其分子主链由二糖单元（3-6-内醚-L-吡喃半乳糖-a 1-3-吡喃 半乳糖）通过β 1-4糖苷键重复交替链接而成。琼胶酶（Agarase)能催化琼脂糖分子中 糖苷键的水解，产生水溶性的低聚糖和寡糖，并因所催化糖苷键的类型不同，分为α -琼胶 酶、β -琼胶酶；所对应的寡糖产物分别以3, 6-内醚-a -L-吡喃半乳糖（Α)、β -D-吡喃半 乳糖（G)为还原性末端，称之为琼寡糖（Agaro_oligosaccharides，AOs)、新琼寡糖（Neoaga ro-oligosaccharides, NAOs)〇
[0003] 近年的研究发现，琼脂糖的降解产物一低聚糖组分具有抗炎症、抗氧化、促进肠 道有益菌群生长等重要生物活性。特别值得注意的是，构成琼脂糖分子的基本单元一新琼 二糖具有抑制黑色素分泌、促进皮肤增白的效果，且未见毒副作用，表明具有更大的应用潜 力与更高的经济价值。因此，新琼二糖的快速、高效制备技术备受关注。
[0004] 与化学降解法相比，琼脂糖的酶法降解具有酶学反应的多种优点，如条件温和可 控、污染小且能耗低等绿色环保、高效的特征。因此，琼胶酶的用途较为广泛，如：降解琼脂 糖凝胶并从中回收DNA分子、消化海藻组织碎片以制备原生质体、降解琼胶以制备低聚糖 或寡糖等。琼胶酶的基因还可在微生物的基因表达载体中被用作报告基因，并用于分泌型 信号肽序列的筛选。这表明琼胶酶及琼胶酶基因的资源开发具有重要的经济价值与应用前 旦 -5^ 〇
[0005] 但是，通过酸降解、碱降解等化学方法，或者超声降解、微波降解等物理学方法，降 解琼胶或琼脂糖后，其寡糖产物的聚合度较为多样，迄今无法实现二糖的专一性生产。
[0006] 目前仅见发明专利申请CN103540579A(申请号201310464445)公开了一种β-琼 胶酶及其应用，即一种能够降解琼脂糖产生单一的新琼2糖的β -琼胶酶，其氨基酸序列为 SEQ ID Ν0:1。该发明的β-琼胶酶能够降解琼脂糖产生单一的新琼2糖，因此可以用于纯 的新琼2糖的制备。该发明所述的β -琼胶酶AgWH50C来源于淡黄色噬琼胶菌WH0801，降 解琼脂糖后的主产物是新琼二糖，可以用于纯的新琼2糖的制备。
【发明内容】
[0007] 本发明针对现有技术的不足，提供一种外切型琼胶酶及其编码基因与应用，该外 切型琼胶酶能够降解琼脂糖并专一性产生新琼二糖。
[0008] -种外切型琼胶酶AgaO,氨基酸序列如SEQ ID N0. 2所示。
[0009] 编码上述外切型琼胶酶AgaO的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0010] 一种重组表达载体，在表达载体中插入了上述外切型琼胶酶AgaO的编码基因。
[0011] 一种重组菌或转基因细胞系，在宿主细胞或细胞系中插入了上述切型琼胶酶AgaO 的编码基因。
[0012] 上述外切型琼胶酶AgaO在分解琼胶或制备新琼二糖中的应用。
[0013] 有益效果
[0014] 1、本发明所述的琼胶酶AgaO,由火色杆菌属细菌（Flammeovirga yaeyamensis) MY04的基因组编码，是火色杆菌属细菌中首次报道的外切型琼胶酶，与文献已报道的该菌 株来源的以新琼四糖和新琼六糖为最终产物的内切型琼胶酶AgaG4不同，且琼胶酶AgaO的 氨基酸序列及编码基因序列与已有专利所涉及的任何琼胶酶均显著不同；其降解琼脂糖过 程中寡糖主产物始终是新琼二糖，且酶的性质稳定，具备工业应用的潜质。
[0015] 2、本发明制备的外切型琼胶酶AgaO对琼脂糖的比活为191U/mg、对琼胶的比活为 115U/mg ;适用于新琼二糖的专一'丨生生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1、重组外切型琼胶酶rAgaO表达及纯化情况的聚丙烯酰胺凝胶电泳图 (SDS-PAGE)；
[0017] 其中：M、蛋白质分子量标准，条带自上至下大小为116kD，66. 2kD，45kD，35kD， 25kD，18. 4kD，14. 4kD ;泳道1、对照菌株破壁前菌体，上样量10 μ L，泳道2、重组菌破壁前菌 体，上样量10 μ L，泳道3、重组菌破壁后上清，上样量10 μ L，泳道4、经镍柱纯化的rAgaO,上 样量10 μ L。
[0018] 图2、温度对重组琼胶酶rAgaO的活性影响曲线；
[0019] 图3、pH值对重组琼胶酶rAgaO的活性影响曲线；
[0020] 图4、温度对重组琼胶酶rAgaO的稳定性影响曲线；
[0021] 图5、pH值对重组琼胶酶rAgaO的稳定性影响曲线；
[0022] 图6、金属离子对重组琼胶酶rAgaO活性的影响柱形图；
[0023] 图7、外切型琼胶酶rAgaO不同时间降解琼脂糖所得产物的TLC分析图；
[0024] 图8、外切型琼胶酶rAgaO不同时间降解还原性末端被荧光标记的新琼六糖的产 物的HPLC分析图；
【具体实施方式】
[0025] 以下实施例的阐述，是为了全面公开本发明如何实施的一些常用技术，而不是为 了限制本发明的应用范围。发明人已经尽最大努力确保实施例中个参数的准确性（例如 量，温度，等等），但是一些实验误差和偏差也应该予以考虑。除非另有说明，本发明中分子 量是指重均分子量，温度是摄氏度。
[0026] 生物材料来源
[0027] 火色杆菌（Flammeovirga yaeyamensis)MY04来源于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC N0. 2777,地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所，保藏日期2008年11月27日。
[0028] 实施例1、火色杆菌（Flammeovirga yaeyamensis)MY04菌株基因组DNA的提取
[0029] 将火色杆菌（Flammeovirga yaeyamensis)MY04接种至液体培养基YT04中，在 28°C、200rpm的条件下，振荡培养至600nm吸光值（0D_)为1.2 ;取培养菌液10mL，在 12,000\8&，地球引力常数）条件下离心1511^11，收集菌体沉淀；用101^的溶菌酶缓冲液 (10mM Tris-HCl，pH8. 0)悬浮菌体，在12, OOOrmp条件下离心15min，收集菌体沉淀。
[0030] 上述液体培养基YT04的每升组分如下：
[0031] 胰蛋白胨l〇g、酵母提取物5. Og、氯化钠30g，水定容至1L，pH 7. 2。
[0032] 向上述菌体沉淀中，每管加入溶菌酶缓冲液6. OmL，得到约7. OmL的菌液，分别加 入浓度为20mg/mL的溶菌酶溶液各280 μ L，使溶菌酶终浓度为800 μ g/mL ;置于冰水浴中 1. 〇h，然后转移至37°C水浴中，温浴2h，至反应体系粘稠；加入浓度为100mg/mL的十六烷基 磺酸钠溶液〇. 41mL、100mg/mL的蛋白酶K溶液30 μ L，在52°C温浴1. Oh ;加入Tris-平衡过 的酚/氯仿/异戊醇（体积比25 :24:1)溶液7.5mL，轻轻颠倒混匀；在10,000Xg、4°C条件 下离心lOmin，收集上清，并加入1. OmL的NaAc-HAc (pH5. 2, 3. 0M)缓冲液，以及8. 5mL的无 水乙醇，充分混匀；用〇. 5mL的枪头挑出丝状DNA，转移至1. 5mL的EP离心管中，以70%乙 醇（贮于-20°C )，洗涤2次，微离心后弃掉上清；在10,000父8、41：条件下离心21^11，彻底 弃掉上清；将DNA沉淀于无菌工作台中风吹干燥，然后用无菌去离子水在4°C过夜溶解DNA 样品，制得基因组DNA。
[0033] 实施例2、火色杆菌（Flammeovirga yaeyamensis)MY04菌株基因组的扫描及其序 列分析。
[0034] 将实施例1制得的基因组DNA，采用焦磷酸测序技术进行基因组的扫描 测序，由上海美吉生物公司完成。用NCBI (National Center for Biotechnology Information, http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)网站的在线软件对DNA测序结果进行分 析。所用到的 NCBI 网站的分析软件是 Open Reading Frame Finder (0RF Finder, http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)和 Basic Local Alignment Search Tool(BLAST, http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)〇
[0035] 上述生物学软件的分析结果显示，火色杆菌（Flammeovirga yaeyamensis)MY04菌 株基因组DNA上携带一个琼胶酶的编码因 agaO,基因 agaO的编码区长2118bp，其核苷酸序 列如SEQ ID NO. 1所示。基因 agaO所编码的琼胶酶AgaO共含有705个氨基酸，其氨基酸序 列如SEQIDN0·2所不。琼胶酶Aga0与BacteroidalesbacteriumCF的全基因组序列中 基因编码的由677个氨基酸组成的琼胶酶（NCBI注册号：AGY53973)有39%的同源性。用 生物学软件BioEdit7. 0. 5. 3进行分析，显示蛋白质AgaO的理论分子量约为81. 3kD。用信 号肤在线预测软件 SignalP4. lServer(http://www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/)在 线分析，该蛋白质的氨基酸序列中不含有分泌型信号肽。
[0036] 实施例3、基因 agaO在大肠杆菌T0P10菌株中的重组表达
[0037] 以实施例1制得的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。引物序列如下：
[0038] if 向引物 BAga〇-F :5' -GCCGCTCGAGTTTTTTTTAGCATTCAATCCGCC-3' (Xho I)；
[0039] 反向引物 BAga〇-R :5' -GCCGTCTAGAAAGTTATTCACATTACCCAAACGG-3' (Xba I)；
[0040] 正向引物BAga〇-F中下划线标注的是限制性内切酶Xho I位点，反向引物BAga〇-R 下划线标注的是限制性内切酶Xba I位点。所用高保真DNA聚合酶Primerstar HS购自中 国大连宝生物公司，所用PCR反应试剂按照该公司提供的产品说明进行操作。
[0041] PCR 反应条件：95°C预变性 4min ;94°C变性 40s，60°C退火 40s，72°C延伸 140s，35 个循环；72°C延伸5min ;4°C稳定15min。
[0042] 将PCR产物用限制性内切酶Xho I和Xba I进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收 酶切后的PCR产物。将购于美国Novagen公司的产品pBAD/g III A质粒DNA，用Xho I和 Xbal双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳并回收酶切后的产物片段。限制性内切酶Xho I和Xba I均购于中国大连宝生物公司，酶切所用到的酶与底物反应的体系、温度和时间，均按照该 公司提供的产品说明操作。
[0043] 将经过Xho I和Xba I双酶切的PCR产物，与同样经过双酶切的pBAD/g III A 质粒载体，在DNA连接酶的催化下进行接；连接产物转化大肠杆菌DH5 α菌株，涂布于含有 50 μ g/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani培养基固体平板上，37°C培养14h后，挑取单克隆； 将单克隆接入含有50μ g/mL氨节青霉素的液体Luria-Bertani培养基中培养，提取质粒； 将质粒用正向引物BAga〇-F和反向引物BAga〇-R进行PCR验证，结果得到大小为的2. lkb 的扩增产物，初步证明构建的重组质粒正确；接着将该重组质粒进行测序，结果表明，在 pBAD/g III A的Xho I和Xba I酶切位点之间插入SEQ ID NO. 1所示的基因 agaO,且插入 方向正确，所以进一步证明构建的重组质粒正确，将该重组质粒命名为pBAgaO。
[0044] 将重组质粒pBAgaO转化大肠杆菌菌株Top 10 (购自美国Novagen公司），然后按照 该公司提供的操作步骤，使用L-阿拉伯糖进行重组琼胶酶rAgaO的诱导表达。并用Ni-丙 烯酰胺凝胶对rAga〇-BA进行纯化，纯化条件按照凝胶的产品手册操作。用聚丙烯酰胺凝变 性胶电泳检测重组琼胶酶rAga〇-BA的纯化情况。结果如图1所示：经L-阿拉伯糖诱导表 达后的ToplO菌体中，rAga〇-BA的产量不低于120mg/L菌体培养物；纯化后的重组琼胶酶 rAgaO在电泳胶上呈单一条带，且位置与预测的分子量相吻合；经分离制得重组酶rAgaO。
[0045] 实施例4、基因 agaO在大肠杆菌BL21 (DE3)菌株中的重组表达
[0046] 按照与实施例3相同的操作流程，以实施例1制得的基因组DNA为模板，进行PCR 扩增、载体构建，和重组蛋白质的表达、纯化，制得重组酶rAgaO。与实施例3的不同之处在 于：
[0047] (l)PCR所用引物如下：
[0048] 正向引物 22Aga〇-F : 5，-GCCGCATATGTTTTTTTTAGCATTCAATCCGCC-3，；
[0049] 反向引物 22Aga〇-R : 5，-GCCGCTCGAGAAGTTATTCACATTACCCAAACGG-3，；
[0050] 正向引物22Aga〇-F中下划线标注的是限制性内切酶Nde I位点，反向引物 22Aga〇-R下划线标注的是限制性内切酶Xho I位点。
[0051] ⑵克隆基因 agaO所用的载体是购自Invitrogen公司的pET-22b (+)质粒DNA, 所构建重组质粒命名为pE22-Aga0,所表达的重组酶命名为rAgaO。
[0052] (3)表达重组蛋白rAgaO所用的宿主细胞是大肠杆菌BL21 (DE3)菌株。
[0053] (4)诱导重组蛋白表达所用的诱导剂是异丙基硫代半乳糖苷（IPTG)，诱导时IPTG 的浓度是 〇· 001-0. 100mm〇l/L。
[0054] 实施例5、重组酶rAgaO最适温度的测定
[0055] 用去离子水配制质量体积浓度为0. 1 %的琼脂糖底物，加热溶解后，置于0°C、 10°C、20°C、25°C、30°C、35°C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、70°C水浴环境中降温 lh。向每 450 μ L底物中添加实施例4制得的重组酶rAgaO的稀释液50 μ L，重组酶rAgaO浓度为 5 μ g/mL，混匀后继续反应，隔时取样。每个温度条件下3个平行样品，以沸水浴灭活的重组 酶制剂为对照组。用DNS-还原糖法测定各反应体系中新生成的还原糖浓度（0D540)，并计 算平均值，进行偏差分析。最大吸收值对应的反应温度为重组酶的最适温度，相对酶（RA) 活定义为：各吸收值与最大吸收值的百分比。结果如图2所示：rAgaO在45°C反应时达到最 大活力，表明rAgaO的最适反应温度是45°C。
[0056] 实施例6、重组酶rAgaO最适pH的测定
[0057] 分别用浓度为50mM的NaAc-HAC缓冲液、50mM的NaH2P0 4_Na2HP04缓冲液、50mM的 Tris-HCl缓冲液，与琼脂糖配制终浓度为0. 10%的琼脂糖底物，所对应的pH值分别为5、6、 6. 5,6、6. 5、7、7. 5、8,7. 5、8、9、10等三个区段，各pH值均在最适温度下调定。将底物加热溶 解后，置于最适温度中降温lh，然后向每450 μ L底物中添加实施例4制得的重组酶rAgaO 的稀释液50 μ L，混匀后继续反应，隔时取样。每个pH条件下3个平行样品，以沸水浴灭活 的重组酶制剂为对照组。用DNS-还原糖法测定各反应体系中新生成的还原糖浓度（0D 54Q)， 并计算平均值和偏差。相对酶（RA)活定义为：各组平均吸收值与最大吸收值的百分比。最 大吸收值对应的pH为重组酶的最适pH。结果如图3所示：rAgaO在pH7. 0时达到最大活 力，表明rAgaO的最适反应pH为7.0(如图3)。
[0058] 实施例7、重组酶rAgaO的温度稳定性分析
[0059] 将在不同温度（0°C?70°C )下热处理lh后的实施例4制得的重组酶rAgaO酶 液，与质量体积浓度（g/mL)为0. 1 %的琼脂糖或琼胶溶液按1 :9(体积比）的比例混合，然 后在最适温度和最适pH下测定剩余酶活，以不经过热处理的酶液酶活定义为100%相对活 力。结果如图4所示：rAgaO在低于40°C的温度下具有较好的热稳定性（如图4)。
[0060] 实施例8、重组酶rAgaO的pH稳定性分析
[0061] 将在最适温度（45°C )、不同的pH(pH5?10)环境中预孵育lh后的实施例4制得 的重组酶rAgaO酶液与质量浓度为0. 1 %的琼脂糖或者琼胶底物溶液按1 :9 (体积比）的 比例混合，然后在最适温度和最适pH下测定剩余酶活，以不经过pH处理的酶液酶活定义为 100 %相对活力。结果如图5所示，在PH5-9的范围内预处理lh, rAgaO酶活仍保持60%以 上。这表明rAgaO对pH值耐受范围较广（如图5)。
[0062] 实施例9、金属离子对重组酶rAgaO活性的影响
[0063] 将用去离子水配置的质量浓度为0. 1 %琼脂糖或琼胶底物、实施例4制得的重组 酶rAgaO酶液、以及水按2 :1 :3(体积比）的比例混合后，接着向反应体系中添加不同的金 属离子，添加的离子终浓度为ImM或10mM，然后在45°C反应40min，按前述的DNS-还原糖 法测酶的活力。对照组为不加任何金属离子时rAgaO的活性（设定为100% )。结果图6 所示，在ImM或10mM浓度下：（l)Na+、K+、Li+等三种一价金属试剂对rAgaO的活性表现为微 弱的促进作用，Ag+具有显著抑制作用；(2) Mg2+二价金属例子对酶活具有促进作用，其余二 价、三价金属离子均显示抑制活性；（3)GlyCer〇l、β -巯基乙醇等2种化学试剂有促进活 性。此外，Mg2+和Glycerol等2种试剂在ImM、10mM浓度下分别使酶活提高至124. 9%和 140. 9%，具有显著促进活性。
[0064] 实施例10、DNS-还原糖法测定重组酶rAgaO的酶活
[0065] 将质量浓度为0. 1%的琼脂糖、浓度为5μ g/mL的重组酶rAgaO酶液、150mmol/L 的NaH2P04-Na2HP04(pH7.0)缓冲液以及水按2 :1 :3 :3(体积比）的比例混合后，45°C下反应 40min。将反应产物在沸水浴中加热10min，转入冰水浴中5min，在12,000Xg、4°C条件下 离心5min，收集上清；将一定体积的上清与等体积的DNS (3, 5-对硝基二甲苯）-反应液混 匀，在沸水浴中加热lOmin，降至室温后在540nm测定吸收值。用分析纯D-半乳糖作标准 品，同样方法操作，绘制D-半乳糖的摩尔浓度与0D 54(I之间的量效关系曲线。用购于上海生 工生物工程有限公司的蛋白质定量试剂盒测定rAgaO酶液的蛋白含量。按照国际标准定义 计算酶的活力单位，即在标准条件下，每分钟内产生1 μ mol产物所需的酶量为1个IU。结 果表明：以琼脂糖为底物，重组rAgaO对的比活为190U/mg，以琼胶为底物，rAgaO的比活为 125U/mg。
[0066] 实施例11、重组酶rAgaO降解琼脂糖的产物的薄板层析（TLC)分析
[0067] 用去离子水配制质量体积浓度（g/mL)为0. 1 %的琼脂糖底物，加热溶解后，置于 45°C水浴环境中降温lh。向每450 μ L底物中添加实施例4制得的重组酶rAgaO的稀释 液50 μ L，混匀后继续反应，隔时取样。将反应产物在沸水浴中加热10min，转入冰水浴中 5min。在12,000Xg、4°C条件下离心5min，收集上清。取0. 5yL上清，上样于娃胶薄板 (Merck公司，Silca Gel60F254)上，在流动相为正丁醇：乙醇：水的体积比为2:1:1的条件 下展开45min。用含有新琼二糖、新琼四糖、新琼六糖、新琼八糖和新琼十糖的混合寡糖，作 为分子量标准物进行参照实验。将含有二苯胺的显色剂（二苯胺：苯胺：85%磷酸：丙酮= lg :lmL :10mL :100mL)喷于娃胶板的表面，风干后将娃胶板置于110°C加热10min以显色。 结果如图所示，重组酶rAgaO降解琼脂糖后的寡糖主产物是单一的，且与新琼二糖的展开 系数一致。这提示rAgaO是以新琼二糖为单一主产物的琼脂糖外切酶。
[0068] 实施例12、重组酶rAgaO酶切模式的荧光-高效液相色谱（HPLC)分析
[0069] 取约含10μ g新琼六糖的溶液，旋转蒸干。参照文献方法，加入含过量邻氨基苯甲 酰胺（2-AB)、硼腈化钠的二甲亚砜（DMS0)溶液，混匀后置60°C水浴中温育2h。旋转蒸干， 加入500 μ L去离子水溶解样品，将样品与200 μ L氯仿共振荡，离心，收集上清。继续用氯 仿反复抽提，不少于7次，得到还原性末端被荧光标记了的新琼六糖（2-ΑΒ-ΝΑ6)。同样方法 标记新琼寡糖分子量标准物。
[0070] 取上述 2-ΑΒ-ΝΑ6 样品、150mmol/L 的 NaH2P04-Na2HP04 (ρΗ7. 0)缓冲液、实施例 4 制 得的重组酶rAgaO的稀释液，按照体积比1:1:1混匀，置于45°C水浴中反应0?12h，隔时 取样。将反应体系置沸水浴中l〇min，转至冰水浴5min，在12,000Xg、4°C条件下离心至少 15min。收集上清，作为重组酶rAgaO的寡糖降解产物。以预先在沸水浴中加热10min的 rAgaO酶液，做阴性对照反应。
[0071] 用浓度为 0· 20mol/L 的 NH4HC03 溶液，平衡 Superdex P印tidel0/300GL(GE 公司） 分子凝胶色谱柱，流速0. 40mL/min，至少2柱床。将述2-AB-NA6及其不同酶解时间的样品， 以自动进样器加载20 μ L/样品，其它条件不变，330nm激发，420nm检测。用HPLC操作软件， 分析各寡糖组分的积分面积，计算相对摩尔浓度。参照分子量标准物的信号，确定各寡糖的 相对分子量。
[0072] 如图8所示，rAgaO降解2-AB-NA6后先产生荧光标记的新琼四糖，再将2-AB-NA4 降解产生荧光标记的新琼二糖（2-AB-NA2)，并最终彻底降解成与初始底物2-AB-NA6等摩 尔的2-AB-NA2。这表明外切型琼胶酶AgaO是从底物的非还原性末端降解得到新琼二糖的。
【权利要求】
1. 一种外切型琼胶酶AgaO,氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2. 编码权利要求1所述外切型琼胶酶AgaO的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
3. -种重组表达载体，在表达载体中插入了权利要求2所述外切型琼胶酶AgaO的编码 基因。
4. 一种重组菌或转基因细胞系，在宿主细胞或细胞系中插入了权利要求2所述切型琼 胶酶AgaO的编码基因。
5. 权利要求1所述外切型琼胶酶AgaO在分解琼胶或制备新琼二糖中的应用。
【文档编号】C12N9/38GK104152427SQ201410396060
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月12日 优先权日:2014年8月12日
【发明者】李福川, 韩文君, 程媛媛, 方玉春, 古静燕, 高长健, 刘生云 申请人:山东大学