利用碳纳米管稳定酶的制作方法

利用碳纳米管稳定酶的制作方法
【专利摘要】本发明提供了酶活性、嗜热稳定性以及嗜冷稳定性增强的酶组合物。另外，本发明提供了制备和使用的方法和试剂盒。
【专利说明】利用碳纳米管稳定酶
[0001] 本申请要求于2013年8月9日提交的印度专利申请第941/K0L/2013号的优先权， 其全部内容通过引用并入本文。

【技术领域】
[0002] 本发明涉及酶活性增强的酶组合物以及制备和使用所述酶组合物的方法。

【背景技术】
[0003] 为了帮助读者理解本发明，提供了下述描述。不应将所提供的信息或引用的参考 文献都视为本发明的现有技术。
[0004] 近年来，酶的生物催化用途急剧增长，因为它们在生态上是适当的，具有高特异 性，表现出化学-部位-互变选择性，并且具有广泛多样的反应。而且，就养分、pH、温度以 及通风而言，很容易地在生物反应器中控制获得酶和优化酶生产的条件。
[0005] 在过去的十年中，能够经受严厉条件的酶的工业应用，已经极大地增加。这主要是 由于从嗜极端微生物发现了新酶的缘故。
[0006] 发明概述
[0007] 本发明通常涉及将酶截留于脂质功能化石墨烯、脂质功能化富勒烯或脂质功能化 碳纳米管中，以增强酶的活性。在一些实施方案中，将纳米颗粒与酶截留于脂质功能化石墨 烯、脂质功能化富勒烯或脂质功能化碳纳米管中。
[0008] -方面，本发明提供了具有一种或多种脂质功能化石墨烯、脂质功能化富勒烯或 脂质功能化碳纳米管和至少一种被脂质功能化石墨烯、脂质功能化富勒烯或脂质功能化碳 纳米管截留但不与之连接的酶的酶组合物，其中，与对照酶相比，组合物中的截留酶的活性 增强。
[0009] -方面，本发明提供了截留酶的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使脂质 功能化石墨烯、脂质功能化富勒烯或脂质功能化碳纳米管和至少一种酶在混合物中、在适 合将酶截留于脂质功能化石墨烯、脂质功能化富勒烯或脂质功能化碳纳米管中的条件下接 触，并对混合物进行声波处理。
[0010] 一方面，本发明提供了处理底物的方法，所述方法包括使第一底物与酶组合物接 触，所述酶组合物包括脂质功能化石墨烯、脂质功能化富勒烯或脂质功能化碳纳米管和至 少一种截留酶，其中所述酶被脂质功能化石墨烯、脂质功能化富勒烯或脂质功能化碳纳米 管截留，但不与其连接，且其中，与对照酶相比，所述酶组合物中的截留酶的活性增强。
[0011] 一方面，本发明提供了试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒包括具有脂质功能 化石墨烯、脂质功能化富勒烯或脂质功能化碳纳米管的第一容器盒具有至少一种酶的第二 容器。
[0012] 一方面，本发明提供了具有酶组合物的试剂盒，其中所述酶组合物包括脂质功能 化石墨烯、脂质功能化富勒烯或脂质功能化碳纳米管和至少一种被脂质功能化石墨烯、月旨 质功能化富勒烯或脂质功能化碳纳米管截留但不与其连接的酶，其中与对照酶相比，所述 组合物中的截留酶的活性增强。

【专利附图】

【附图说明】
[0013] 图1A和1B是分别说明在4°C和80°C下以下酶活性的图：作为无NP或SWCNT的纯 酶的果胶酶（对照），未截留的果胶酶和SWCNT(nanorope)，截留的果胶酶和SWCNT(SWCNT)， 果胶酶和NP、无SWCNT(NP)，未截留的果胶酶和NP以及SWCNT(NP+NR)，以及截留的果胶酶 和NP以及SWCNT(NP+SWCNT)。
[0014] 图2A和2B是分别在4°C和80°C下比较以下酶活性的图：作为无NP或SWCNT的 纯酶的漆酶（对照），未截留的漆酶和SWCNT(nanorope)，截留的漆酶和SWCNT(SWCNT)，漆 酶和NP、无SWCNT(NP)，未截留的漆酶和NP以及SWCNT(NP+NR)，以及截留的漆酶和NP以及 SWCNT(NP+SWCNT) 〇
[0015] 图3A和3B是分别在4°C和80°C下比较以下酶活性的图：作为无NP或SWCNT的纯 酶的蛋白酶（对照），未截留的蛋白酶和SWCNT(nanorope)，截留的蛋白酶和SWCNT(SWCNT)， 蛋白酶和NP、无SWCNT(NP)，未截留的蛋白酶和NP以及SWCNT(NP+NR)，以及截留的蛋白酶和 NP以及SWCNT(NP+SWCNT)。
[0016] 图4A和4B是分别在4°C和80°C下比较以下酶活性的图：作为无NP或SWCNT 的纯酶的纤维素酶（对照），未截留的纤维素酶和SWCNT(nanorope)，截留的纤维素酶和 SWCNT(SWCNT)，纤维素酶和NP、无SWCNT(NP)，未截留的纤维素酶和NP以及SWCNT(NP+NR)， 以及截留的纤维素酶和NP以及SWCNT(NP+SWCNT)。
[0017] 图5A和5B是分别在4°C和80°C下比较以下酶活性的图：作为无NP或SWCNT 的纯酶的木聚糖酶（对照），未截留的木聚糖酶和SWCNT(nanorope)，截留的木聚糖酶和 SWCNT(SWCNT)，木聚糖酶和NP无SWCNT(NP)，未截留的木聚糖酶和NP以及SWCNT(NP+NR)， 以及截留的木聚糖酶和NP以及SWCNT(NP+SWCNT)。
[0018] 图6A和6B是分别在4°C和80°C下比较SWCNT截留或未截留的果胶酶酶活性的图。
[0019] 图7A和7B是分别在4°C和80°C下比较多轮使用后SWCNT截留或未截留的漆酶酶 活性的图。
[0020] 图8A和8B是分别在4°C和80°C下比较多轮使用后SWCNT截留或未截留的蛋白酶 酶活性的图。
[0021] 图9A和9B是分别在4°C和80°C下比较多轮使用后SWCNT截留或未截留的纤维素 酶酶酶活性的图。
[0022] 图10A和10B是分别在4°C和80°C下比较多轮使用后SWCNT截留或未截留的木聚 糖酶酶活性的图。
[0023] 图11A和11B分别在4°C和80°C下比较SWCNT中截留或未截留的果胶酶酶活性的 时间动力学的图。
[0024] 图12A和12B是分别在4°C和80°C下比较SWCNT中截留或未截留的漆酶酶活性的 时间动力学的图。
[0025] 图13A和13B是分别在4°C和80°C下比较SWCNT中截留或未截留的蛋白酶酶活性 的时间动力学的图。
[0026] 图14A和14B是分别在4°C和80°C下比较SWCNT中截留或未截留的纤维素酶酶活 性的时间动力学的图。
[0027] 图15A和15B是分别在4°C和80°C下比较SWCNT中截留或未截留的木聚糖酶酶活 性的时间动力学的图。
[0028] 图16 (A-E)是比较酶冻融周期后SWCNT截留或未截留酶的酶活性的图。酶表示如 下：(A)果胶酶；(B)漆酶；(C)蛋白酶；(D)纤维素酶；以及（E)木聚糖酶。
[0029] 图17是SWCNT截留酶的示意图。
[0030] 发明详述
[0031] 在下面的详细描述中，参考附图，附图形成了描述的一部分。在附图中，相似的符 号通常标示相似的组分，除非上下文另有说明。详细描述、附图以及权利要求书中的示例性 实施方案，并非表示限制性的。在不背离本发明主题实质和范围的情况下，可以利用其他实 施方案，并且可以进行其他改变。
[0032] 本文公开了与稳定的嗜冷或嗜温酶的制造和使用相关的组合物和方法。在一些 实施方案中，本文公开的酶组合物和方法包括（1)至少一种嗜冷酶、嗜温酶或其组合；以及 (2)多种脂质功能化石墨烯、脂质功能化富勒烯或脂质功能化碳纳米管，其中嗜冷酶或嗜 温酶被脂质功能化石墨烯、脂质功能化富勒烯或脂质功能化碳纳米管截留，但不与脂质功 能化石墨烯、脂质功能化富勒烯或脂质功能化碳纳米管连接。在一些实施方案中，至少一个 纳米颗粒与酶被截留于脂质功能化石墨烯、脂质功能化富勒烯或脂质功能化碳纳米管中， 酶与纳米颗粒接触但不与其连接。
[0033] 本说明书和后附权利要求中所用的单数形式"一个/种（a) "、"一个/种（an) "和 "所述的/该（the)"包括指代物的复数形式，除非上下文另一明确说明。例如提到"细胞（a cell) "包括两个或多个细胞的组合物等。
[0034] 本领域普通技术人员应当理解本文所用的"约"，并且取决于其所用的上下文，其 会在一定程度上发生改变。如果使用了本领域普通技术人员不清楚的术语，考虑到其所用 的上下文，"约"应表示该特定术语加或减10%。
[0035] 在嗜冷酶或嗜温酶语境中，本文所用的"底物"指酶所作用的分子或一组分子。酶 催化涉及底物的化学反应。底物结合嗜冷酶或嗜温酶的活性位点，并形成酶-底物复合物。 底物转化成一种或多种产物，随后所述产物可以从活性位点释放。
[0036] 在酶的语境下，本文所用的术语"活性增强"或"活性提高"，指与合适的对照酶相 t匕，每单位时间内转化为产物的底物的数量提高或增加。在一些实施方案中，与相同标准条 件下的对照酶相比，对于特定类型的酶而言，可以在"最佳"或"标准条件"（例如标准pH、 标准温度、标准底物等）下，表现出酶活性的增强。另外或可选地，在一些实施方案中，与相 同条件下的对照酶相比或与标准条件下的对照酶下相比，对于特定类型的酶而言，可以在 非标准条件（例如在较高或较低的温度下、在较高或较低的pH下、非最佳底物等n)下，表 现出活性增强。作为实例但并非限制，本文公开了与至少一个纳米颗粒接触但不与其连接 的嗜冷酶，其中酶和纳米颗粒两者被脂质功能化石墨烯、脂质功能化富勒烯或脂质功能化 碳纳米管截留但不与其连接，其中与对照嗜冷酶（例如不与至少一个纳米颗粒接触且不被 碳纳米管截留的相同类型的嗜冷酶，其中在与和纳米颗粒接触且被碳纳米管截留的嗜冷 酶相同的温度、缓冲液、pH、底物等条件下，评估对照酶的活性），嗜冷酶的活性增强。
[0037] 在嗜冷酶或嗜温酶的语境中，本文所用的"半寿期提高"或"半寿期增加"指，与对 照酶相比，嗜冷酶或嗜温酶可以保留其50%活性的时间量的提高或增加。
[0038] 在酶的语境中本文所用的"嗜冷稳定性增强"或"嗜冷稳定性提高"指，与合适的 对照酶相比，在"正常"或"标准"温度或温度范围外的低温或低温范围下，给定酶的结构和 /或功能完整性和/或酶活性的增强或提高。作为实例而非限制，在本文公开的组合物和 方法的一些实施方案中，与至少一个纳米颗粒接触但不与其连接的嗜冷酶，其中酶和纳米 颗粒两者都被脂质功能化石墨烯、脂质功能化富勒烯或脂质功能化碳纳米管截留但不与其 连接，与对照嗜冷酶（例如不与至少一个纳米颗粒接触且不被脂质功能化石墨烯、脂质功 能化富勒烯或脂质功能化碳纳米管截留的嗜冷酶）相比，在约2°C-15°C，或在约2°C、3°C、 41：、51：、61：、71：、81：、91：、101：、111：、121：或131：、141：或151：下，表现出更高的稳定性 和/或活性。
[0039] 在酶的语境下，本文所用的"热稳定性增强"或"热稳定性提高"或"耐温性增强" 指与合适的对照酶相比，在"正常"或"标准"温度或温度范围外的高温或高温范围下，给定 酶的结构和/或功能完整性和/或酶活性的增强或提高。作为实例而非限制，在本文公开的 组合物和方法一些实施方案中，与至少一个纳米颗粒接触的嗜冷酶，其中酶和纳米颗粒两 者被脂质功能化石墨烯、脂质功能化富勒烯或脂质功能化碳纳米管截留，但不与其连接，与 对照嗜冷酶（例如不与至少一个纳米颗粒接触且不被脂质功能化石墨烯、脂质功能化富勒 烯或脂质功能化碳纳米管截留的嗜冷酶）相比，在约35°C至80°C或在约35°C、37°C、40°C、 42°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C或约80°下，表现出更高的稳定性和/或活 性。
[0040] 本文所用的术语"处理酶"、"截留酶"、"处理酶组合物"和"酶组合物"指本发明的 组合物，包括被脂质功能化石墨烯、脂质功能化富勒烯或脂质功能化碳纳米管截留但不与 其连接的酶。在一些实施方案中，术语处理酶、截留酶以及酶组合物指本发明的组合物，包 括与至少一个纳米颗粒接触但不与其连接的酶，其中酶和纳米颗粒两者都被脂质功能化石 墨烯、脂质功能化富勒烯或脂质功能化碳纳米管截留，但不与其连接。
[0041] 本文所用的"对照嗜冷酶"、"对照嗜温酶"或"对照酶"具有本领域技术人员所知 的含义，并且其必定依赖于例如待评估的酶活性或条件方面。通常将对照或对照酶比作测 试酶（例如已经以某些方式修饰或处理的酶）。对照和测试酶通常是相同类型的酶，并且来 源于相同的来源。对照酶不会经历"修饰"或"处理"（例如不会与纳米颗粒接触，或不会位 于包含纳米颗粒的组合物中，或不会位于被脂质功能化石墨烯、脂质功能化富勒烯或脂质 功能化碳纳米管截留的组合物中），但会评价其在与"修饰"酶或"处理"酶相同的条件下的 酶活性、pH耐受性、耐温性、半寿期等。因此，可以确定"修饰"或"处理"的效果。在一些实 施方案中，"修饰"或"处理"用脂质功能化石墨烯、脂质功能化富勒烯或脂质功能化碳纳米 管截留酶，其中酶不与脂质功能化石墨烯、脂质功能化富勒烯或脂质功能化碳纳米管连接。 在一些实施方案中，截留酶与至少一个纳米颗粒接触，但不与其连接。
[0042]本文所用的短语"但不与......连接"指分子之间的相互作用，所述相互作用不 会导致一个连接伴侣与另一连接伴侣固定的固定，和/或不会产生一个连接伴侣与另一连 接伴侣的永久性附着，和/或不会使一个连接伴侣与另一连接伴侣结合。作为实例而非限 制，"被脂质功能化碳纳米管截留但不与脂质功能化碳纳米管连接的酶"指缺少或缺乏分子 间键，所述分子间键导致酶固定于脂质功能化碳纳米管上，使酶永久性附着于脂质功能化 碳纳米管，或使酶与脂质功能化碳纳米管结合。另外，参考"酶与纳米颗粒接触但不与纳米 颗粒连接"，'不与......连接"表示缺少或缺乏分子间键，所述分子间键导致纳米颗粒固 定于酶上或使纳米颗粒永久性附着于酶。
[0043] 本文所用术语"纳米颗粒"指最大尺寸位于纳米范围内的任何颗粒，和/或其中 颗粒的平均大小在纳米范围内。例如，在一些实施方案中，纳米颗粒的最大尺寸，或包含于 组合物中的多个纳米颗粒的平均尺寸，小于l〇〇〇nm，例如约999nm、约900nm、约800nm、约 700nm、约 600nm、约 500nm、约 400nm、约 350nm、约 300nm、约 200nm、约 100nm，或为这些数值 中任意两个之间的范围。另外或可选地，在一些实施方案中，纳米颗粒的最大尺寸或多个纳 米颗粒的平均大小为例如约100nm、约90nm、约80nm、约70nm、约60nm、约50nm、约25nm、约 20nm、约10nm、约5nm、约3nm、约2nm、约lnm或更小，或为这些数值中任意两个之间的范围。
[0044] 本文所用的术语"蛋白酶（protease) "（也称为肽酶或蛋白酶（proteinase))指 执行蛋白水解即通过水解将氨基酸在多肽链中连接在一起形成蛋白的肽键开始蛋白分解 代谢的酶。
[0045] 本文所用的"嗜冷酶"指在约0°C至约30°C具有最佳功能或活性的酶。在一些实 施方案中，嗜冷酶在约10°c的温度下具有最佳功能或活性。
[0046] 本文所用的"嗜温酶"指在约20°C制约45°C具有最佳功能或活性的酶。
[0047]I?酶组合物
[0048] 本文公开了包含被脂质功能化石墨烯、脂质功能化富勒烯或脂质功能化碳纳米管 截留但不与其连接的组合物和方法。在一些实施方案中，本发明的酶包含至少一种嗜冷酶、 嗜温酶或其组合。在一些实施方案中，至少一个纳米颗粒与酶被截留于脂质功能化石墨烯、 脂质功能化富勒烯或脂质功能化碳纳米管中，但不与其连接。在一些实施方案中，与合适的 对照酶相比，组合物中的酶可以表现出活性增强、耐温性增强、半寿期提高中的一种或多种 特性。
[0049]A.嗜冷酶
[0050] 本发明不受嗜冷酶的类型或酶的来源的限制。在一些实施方案中，嗜冷酶可以分 离自天然来源（例如分离自嗜冷原核或真核生物，如细菌或霉菌），或可以重组制备。在一 些实施方案中，嗜冷酶可以是"野生型"，或可以是突变体，或与野生型酶相比可以包括一个 或多个氨基酸取代、添加或缺失。
[0051] 可以用于本文公开的组合物和方法中的嗜冷酶的非限制性实例包括果胶酶、漆 酶、木聚糖酶、纤维素酶以及其组合。
[0052] B.嗜温或嗜热酶
[0053] 本文公开的蛋白酶可以是嗜温或嗜热的，或可以分离自天然来源（例如分离自原 核或真核生物，如细菌、酵母、霉菌等），或可以重组制备。在一些实施方案中，蛋白酶可以 是"野生型"，或可以是突变体，或与野生型酶相比，可以包括一个或多个氨基酸取代、添加 或缺失。
[0054] C.碳纳米管和其他碳结构
[0055] 本发明的基于纳米管和碳结构的截留方法，相对于常规的酶固定方法具有许多优 势。作为实例而非限制，以胶体样状态悬浮本发明的酶，并且有效活性表面积高。另外，本 文公开的基于纳米管的截留方法允许常规固定技术并不能提供的通用（交叉酶）复用性。 在酶使用后，易于收获酶，对于所选的生物加工活性而言，这使得本文公开的方法和组合物 经济。
[0056] 在一些实施方案中，荧光素酶组合物包括至少一种被脂质功能化石墨烯或脂质功 能化富勒烯截留但不与其连接的荧光素酶。石墨烯和富勒烯是碳同素异形体。同素异形体 是一些化学元素以两种或多种形式存在的特性。石墨烯可以堆积，其包含以规则的六边形 模式排列的碳原子。富勒烯是完全有碳原子构成的、中空球形或管状的任何分子。富勒烯 的实例包括但不限于巴基球（buckyball)(球形富勒烯）和碳纳米管（圆柱形富勒烯）。
[0057] 在本发明的一些实施方案中，荧光素酶被脂质功能化碳纳米管截留但不与其连 接。碳纳米管的实例包括但不限于单壁碳纳米管（SWCNT)、双壁碳纳米管或多壁碳纳米管。 在一些实施方案中，碳纳米管是用脂质功能化的固态。
[0058] 用于功能化石墨烯、富勒烯以及碳纳米管的脂质包括但不限于磷脂、鞘脂、鞘磷脂 以及类固醇。通常，在本发明所用的脂质上存在两个脂肪酸部分：长链部分和短链部分。
[0059] 在一些实施方案中，短链脂质的链长为2个碳（"C"）至10个碳（"C")。在一些 实施方案中，短链的长度为2C至8C。在一些实施方案中，短链的长度为2C、3C、4C、5C、6C、 7C、8C、9C或10。在一些实施方案中，长链脂质的长度为14-22C。在一些实施方案中，长链 的长度为 14C、15C、16C、17C、18C、19C、20C、21C或 22C。
[0060] 在一些实施方案中，至少一个长链脂质（例如22C)允许碳纳米管截留较大的酶。 例如，至少一个链更长的脂质导致更大的纳米笼（nano-cage)。相反，例如，链长较短的脂质 (例如14C)导致更紧的纳米笼，其可以截留较小的复合体，但是不能截留大复合体。
[0061] 在一些实施方案中，脂质与碳纳米管的比例（wt/wt)为约6 : 1或约5 : 1或月 4 : 1或约3 : 1或约2 : 1。
[0062] 在一些实施方案中，脂质功能化碳纳米管在管的一末端具有极性头部。在另一实 施方案中，脂质功能化碳纳米管在管的两个末端具有极性头部。
[0063]功能化纳米管的方法是本领域公知的。参见例如Bhattacharyya et al.， Nanotechnology，23(2012) ;385304 (8pp)。
[0064] D?纳米颗粒
[0065] 在本文描述的几个示例性实施方案中提供的纳米颗粒指最大尺寸在纳米范围内 的任何颗粒，和/或在组合物含有多个纳米颗粒的情况下，本文所述的尺寸可以指多个纳 米颗粒个体尺寸的平均值。例如，在一些实施方案中，纳米颗粒的最大尺寸小于lOOOnm，例 如约 999nm、约 900nm、约 800nm、约 700nm、约 600nm、约 500nm、约 400nm、约 350nm、约 300nm、 约200nm、约100nm，或为这些数值中任意两个之间的范围。另外或可选地，在一些实施方案 中，纳米颗粒的最大尺寸为例如约l〇〇nm，例如约90nm、约80nm、约70nm、约60nm、约50nm、 约25nm、约20nm、约10nm、约5nm、约3nm、约2nm、约lnm或更小，或为这些数值中任意两个 之间的范围。
[0066] 如上文所指出的，尺寸可以指例如颗粒的最大尺寸。另外或可选地，尺寸可以指颗 粒的最小尺寸。颗粒可以具有任何形状。例如，一些实施方案的纳米颗粒可以指至少基本上 是球形的颗粒。另外或可选地，纳米颗粒可以为椭圆形、管状或不规则形状。取决于形状， 本文所述的尺寸可以指直径、半径、宽度、长度、高度、对角线等中的任一种。同样，在组合物 含有多个纳米颗粒的情况中，本文所述的尺寸可以指多个纳米颗粒个体尺寸的平均值。例 如，在一些实施方案中，多个纳米颗粒个体尺寸的平均值为约lOOOnm、约999nm、约900nm、 约 800nm、约 700nm、约 600nm、约 500nm、约 400nm、约 300nm、约 200nm、约lOOnm，或为这些数 值中任意两个之间的范围。另外或可选地，在一些实施方案中，多个纳米颗粒个体尺寸的平 均值为例如约l〇〇nm、约 90nm、约 80nm、约 70nm、约 60nm、约 50nm、约 25nm、约 20nm、约 10nm、 约5nm、约3nm、约2nm、约lnm，或为这些数值中任意两个之间的范围 [0067] 在一些实施方案中，纳米颗粒的形状至少基本上是球形，并且其直径为约2nm至 约 500nm、约 10nm至约 500nm、约 25nm至约 500nm、约 50nm至约 400nm、约 100nm至约 400nm、 约 80nm至约 100nm。
[0068] 在一些实施方案中，截留酶组合物含有纳米颗粒。纳米颗粒与酶接触，但是纳米颗 粒不与酶连接。纳米颗粒的实例包括但不限于氧化亚铜、羟磷灰石（HAp)、氯化镁、氯化锰、 氯化钙、锌、镁、锰或其组合。
[0069] II?酶组合物的特征
[0070] 本文公开的方法对嗜冷酶或嗜温酶的截留导致酶活性增强。在一些实施方案中， 酶（例如嗜冷酶或嗜温酶）的截留导致下述中的一种或多种：酶活性增强、pH耐受性增强、 耐温性增强、半寿期提高，和/或经受多轮冻融循环并维持给定水平的活性的能力。在一些 实施方案中，至少一个纳米颗粒与酶一起也被截留于脂质功能化碳纳米管中，但是纳米颗 粒不与酶或脂质功能化碳纳米管连接。
[0071] 1.嗜热或嗜冷稳定性增强
[0072] 在一些实施方案中，利用嗜热稳定性或嗜冷稳定性测定酶活性增强。嗜冷酶适于 在约0°C至约30°C的低温下具有高活性。另外，嗜冷酶通常比嗜温副本（counterpart)具 有更高的特异性。然而，嗜冷酶在较高的温度下变性并丧失其酶活性。与对照嗜冷酶相比， 在较高的温度下，本发明的截留嗜冷酶的嗜热稳定性提高且酶活性更高。
[0073] 嗜温酶在高温（例如高于约60°C)下也变性，这会导致嗜温酶活性降低。与对照 嗜温酶相比，在较高的温度下，本发明的截留嗜温酶的嗜热稳定性提高且酶活性更高。
[0074] 在一些实施方案中，截留嗜冷酶或嗜温酶的热稳定性增强或提高指在约35°C至约 80°C、约45°C至约70°C或约55°C至约60°C的温度范围下的酶活性。在一些实施方案中， 在截留嗜冷或嗜温酶热稳定性语境下，参照温度为约35°C、37°C、40°C、42°C、45°C、50°C、 55°C、60°C、65°C、70°C、75°C或80°C，或为这些数值中任意两个之间的范围。
[0075] 本发明还增强了嗜冷酶和嗜温酶的嗜冷稳定性。尽管嗜冷酶在较低的温度例如低 于l〇°C具有酶促活性，然而，与对照嗜冷酶相比，用纳米颗粒将嗜冷酶截留于脂质功能化碳 纳米管中，增强了嗜冷酶的酶活性。
[0076] 通常，嗜温酶的最佳酶活性温度为约25°C至约45°C。如上文所指出的，许多嗜温 酶在高温（例如高于约60°C)下变性，这导致嗜温酶活性降低。当温度变得太低，例如低于 约25°C，嗜温酶也丧失酶活性。与对照嗜温酶相比，用纳米颗粒将嗜温酶截留于脂质功能 化碳纳米管中增强了嗜温酶的嗜冷稳定性。
[0077] 在一些实施方案中，嗜冷或嗜温酶嗜冷稳定性的增强指在约4°C至约30°C或约 8°C至约20°C、约12°C至约16°C温度下的酶活性。在一些实施方案中，在截留嗜冷酶或嗜温 酶嗜冷稳定性语境中，参照温度为约4°C、8°C、12°C、16°C、20°C、24°C、28°C或30°C，或为这 些数值中任意两个之间的范围。
[0078] 2?增强的酶活性和半寿期
[0079] 另外或可选地，在一些实施方案中，通过以下方式测定嗜冷或嗜温酶的活性增强 或提高：最大反应速度（Vmax)的增加、转换数即每单位时间内每一酶位点将底物转换为产 物的数量的增加，和/或底物亲和性增加，例如米歇利斯常数（Km)的降低，活化能（Ea)的 降低，或其组合。
[0080] 在一些实施方案中，与对照嗜冷或嗜温酶相比，截留嗜冷酶或嗜温酶的半寿期更 长和/或衰变常数更低。在一些实施方案中，更长的半寿期和/或较低的衰变常数提高截 留酶的生产力，因为在漫长的反应过程中，酶将活性保持更长的持续时间。
[0081] 在一些实施方案中，与对照酶酶活性的长度相比，本发明的截留嗜冷酶或嗜温酶 将酶活性保持更长的时期。在一些实施方案中，截留酶组合物将酶活性保持约1. 5小时至 约7小时，或约2小时至约6.5小时，或约3小时至约6小时，或约3. 5小时至约5. 5小时， 或约4小时至约5小时。在一些实施方案中，截留酶酶活性的持续时间为约1. 5小时、2小 时、3小时、4小时、5小时、6小时，或7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时，或为 这些数值中任意两个之间的范围。在一些实施方案中，截留酶酶活性的持续时间为约12小 时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天，或为这些数值中任意两个之间的范围
[0082] 在一些实施方案中，在约4°C至约30°C或约8°C至约20°C、约12°C至约16°C的温 度下，观察到，与对照酶相比，截留酶酶活性持续时间的延长。在一些实施方案中，在延长的 嗜冷稳定性语境中的温度为约4°C、8°C、12°C、16°C、20°C、24°C、28°C或30°C，或为这些数 值中任意两个之间的范围。
[0083] 在一些实施方案中，在约35°C至约80°C、约45°C至约70°C或约55°C至约60°C的 温度下，观察到与对照酶相比，截留酶酶活性持续时间的延长。在一些实施方案中，在延 长的热稳定性的语境中的温度为约35°C、37°C、40°C、42°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、 70°C、75°C或80°C，或为这些数值中任意两个之间的范围。
[0084] 3.冻融循环后酶的稳定化
[0085] 在一些实施方案中，与对照酶相比，在三个或更多个冻融循环后，截留酶酶活性增 强。在一些实施方案中，截留酶维持酶活性高达4个冻融循环或5个冻融循环或6个冻融 循环或7个冻融循环或8个冻融循环或9个冻融循环。在一些实施方案中，截留酶维持酶 活性约9个冻融循环至约30个冻融循环，或约12个冻融循环至约27个冻融循环，或约15 个冻融循环至约24个冻融循环，或约18个冻融循环至约21个冻融循环。
[0086]III?截留酶和纳米颗粒的方法
[0087] 在一些实施方案中，增强型酶组合物的形成包括，将脂质功能化碳纳米管、富勒烯 和/或石墨烯例如脂质功能化SWCNT与至少一种嗜冷酶、嗜温酶或其组合相组合，并声波处 理该组合（combination)。脂质功能化碳纳米管（或石墨烯或富勒烯）在声波处理后会自 我组装成"纳米笼"。在一些实施方案中，纳米笼的形成截留酶。在一些实施方案中，至少一 个纳米颗粒也与酶一起被截留于纳米笼中。在一些实施方案中，纳米颗粒与酶被截留于纳 米笼中，但是不与酶或纳米笼连接。
[0088] 在一些实施方案中，脂质功能化石墨烯、脂质功能化富勒烯或脂质功能化碳纳米 管与酶的比例（wt/wt)为6 : 1，或约5 : 1，或约4 : 1，或约3 : 1，或约2 : 1。
[0089] 作为实例而非限制，在一些实施方案中，脂质功能化SWCNT(0. 5mg/ml)、果胶裂解 酶（0.18mg/ml)、漆酶（0.25mg/ml)、纤维素酶（O.llmg/ml)、木聚糖酶（0.2mg/ml)以及 蛋白酶（〇? 22mg/ml)的量分别为 5x10 3mg、18x10 3mg、25xl0 3mg、11x10 3mg、20xl03mg和 22xl0_3mg。在一些实施方案中，SWCNT的量为0. 1-l.Omg/ml。在一些实施方案中，果胶裂解 酶为0. 1-0. 25mg/ml。在一些实施方案中，漆酶为约0. 15-0. 50mg/ml。在一些实施方案中， 纤维素酶为.005-0. 4mg/ml。在一些实施方案中，木聚糖酶为0.lmg/ml至0. 5mg/ml。在一 些实施方案中，蛋白酶为〇.lmg/ml至0. 5mg/ml。
[0090]IV.使用酶组合物的方法-概述
[0091] 在一些实施方案中，使至少一种截留酶与至少一种底物接触。在一些实施方案中， 接触在约4°C至约30°C或约8°C至约26°C或约12°C至约22°C或约16°C至约18°C的温度下 进行。在一些实施方案中，接触在约4°C、8°C、12°C、16°C、20°C、24°C、28°C或30°C的温度 下，或为这些数值中任意两个之间的范围进行。在一些实施方案中，接触在约〇°C至约4°C 的温度下进行。
[0092] 在一些实施方案中，接触在约35°C至约80°C，或约45°C至约70°C，或约55°C至约 60°C的温度下进行。在一些实施方案中，接触在约35°C、37°C、40°C、42°C、45°C、50°C、55°C、 60°C、65°C、70°C、75°C或80°C的温度，或为这些数值中任意两个之间的范围进行。
[0093] 在一些实施方案中，接触进行约1. 5小时至约7小时，或约2小时至约6. 5小时， 或约3小时至约6小时，或约3. 5小时至约5. 5小时，或约4小时至约5小时。在一些实施 方案中，接触的持续时间为约1. 5小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时或7小时，或为 这些数值中任意两个之间的范围。在一些实施方案中，截留酶酶活性的持续时间为约12 小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天，或为这些数值中任意两个之间的范围。
[0094] 在一些实施方案中，与对照酶相比，当用于多重反应时，截留酶维持高酶活性。使 用截留酶的多重反应的实例如下：1)使至少一种截留酶与多于一种底物接触第一反应过 程的持续时间；2)在第一反应过程完成后，收集截留酶；以及3)随后将收集的截留酶用于 第二反应过程。在第二反应过程中，截留酶维持高水平的酶活性，这可以通过百分比相对活 性来测定。在一些实施方案中，将截留酶用于一个反应，或两个反应，或三个反应，或四个反 应，或五个反应，或六个反应中。在一些实施方案中，连续运行反应。
[0095] 在一些实施方案中，当再用于第二反应中时，截留酶保留其约85%至约99%的酶 活性。在一些实施方案中，当再用于第三反应中时，截留酶保留其约80%至约99%，或约 80%至约95%酶活性。在一些实施方案中，当再用于第四反应中时，截留酶保留其约60% 至约99%，或约60%至约85%的酶活性。在一些实施方案中，当再用于第五反应中时，截留 酶保留其约60%至约99%，或约60%至约75%酶活性。
[0096]V.试剂盒
[0097] 在一些实施方案中，将截留酶组合物提供于试剂盒中。在一些实施方案中，试剂盒 包括具有至少一种截留酶组合物的容器，其中截留酶组合物包括至少一种截留于脂质功能 化石墨烯、脂质功能化富勒烯、脂质功能化碳纳米管或其组合但不与其连接的酶。在一些实 施方案中，截留酶组合物包括纳米颗粒。在一些实施方案中，纳米颗粒与酶接触，但不与酶 连接。在一些实施方案中，纳米颗粒与纳米笼接触，但不与纳米笼连接。在一些实施方案中， 试剂盒还包括应用酶组合物处理广泛多种有机和无机底物的说明书。
[0098] 在可选的实施方案中，试剂盒包括具有多种脂质功能化石墨烯、脂质功能化富勒 烯、脂质功能化碳纳米管或其组合的第一容器和具有至少一种酶的第二容器。在一些实施 方案中，试剂盒包括至少一个纳米颗粒的第三容器。在一些实施方案中，试剂盒还包括制 备截留酶组合物的说明书。
[0099] 在一些实施方案中，酶是嗜冷酶、嗜温酶或其组合中的一种或多种。嗜冷酶包括但 不限于果胶酶、漆酶、纤维素酶以及木聚糖酶。嗜温酶包括但不限于蛋白酶。
[0100] 在一些实施方案中，碳纳米管包括但不限于单壁碳纳米管、双壁碳纳米管或多壁 碳纳米管。在一些实施方案中，碳纳米管为用脂质功能化的固态。
[0101]纳米颗粒包括但不限于氧化亚铜、羟磷灰石（HAp)、氯化镁、氯化锰、氯化钙或其组 合。
[0102] IV.本文公开的酶组合物的示例性用途
[0103] A.微生物热稳定酶的示例性用途-概述
[0104] 在升高的温度下运行生物技术过程具有许多优势。在一些过程中，温度的增加能 够对有机化合物的生物有效度和溶解度有显著影响。例如，温度的升高可以伴随有机化合 物伴随粘度的降低和扩散系数的增加。因此，本公开的热稳定酶组合物可以用于这类过程。 作为实例而非限制，化学煮漂（chemicalscouring)是一个本发明的热稳定酶具有价值的 过程。下文讨论了热稳定酶的许多其他示例性用途。
[0105] 用于化学煮漂过程中的强烈的、危险化学品，如苏打灰、草酸、苛性钠，造成环境污 染，并弱化经历煮漂过程的产品的纤维强度（例如羊毛）。
[0106] 就工业规模而言，化学煮漂是常见的。所述过程通过从许多天然纤维中除去非纤 维质物质而改善了织物的吸水性和白度。
[0107] 不管为生物煮漂过程使用酶例如漆酶的利益如何，目前使用的酶都具有缺少煮漂 效率的弊端。缺少煮漂效率可能由酶的热不稳定性和低活性造成。由于热诱导的酶构象的 变化，热不稳定性导致酶活性随时间降低。较高的温度加速活性降低。低活性限制了煮漂 发生的速率。利用本发明的组合物能够提高煮漂效率，因为如本文所述，所述酶的热稳定 性和酶活性提高。
[0108] B.微生物冷稳定酶的示例性用途-概述
[0109] 嗜冷酶在低温和中等温度下的高活性提供了潜在的经济效益，例如通过在不需要 昂贵的反应器加热的大规模过程中节省大量能量。嗜冷酶也可以用于家庭过程。例如，在 低温下洗涤衣服能保护纺织品的颜色（并降低能量消耗）。在食品工业，它们的特性允许热 敏感产品转化或精炼，例如，冷活性果胶酶在低温下能有助于降低粘度并澄清果汁。这些酶 的热易变性也确保在复合混合物中它们快速、有效且选择性地失活。
[0110] 已经提出，当内源微生物区系的降解能力受到低温削弱时，在温带国家，在冬季用 嗜冷微生物生物修复污染的突然和废水。
[0111]除了可以在要求快速和温和失活处理的多步骤过程中应用的冷适应酶的结构易 变性外，由于其在低温和中等温度下增强的选择性和高催化活性，冷适应酶也是有利的。此 夕卜，冷适应酶固有的构象可塑性，特别适合许多精细化学品和药用中间体生产过程中所用 的低水条件下的有机合成应用。
[0112]C.本发明酶组合物的一般用途
[0113] 低温、中等温度和以及高温下本发明的处理的酶组合物的高活性，提供了潜在的 经济效益，例如通过在不需要昂贵的反应器加热的大规模过程中节省大量能量。处理的酶 组合物也可以用于家庭过程。例如，在低温下洗涤衣服可以保护纺织品的颜色（并降低能 量消耗）。在食品工业，它们的特性允许转化或精炼热敏感产品，例如冷活性果胶酶在低温 下能有助于降低粘度并澄清果汁。
[0114] 当内源微生物区系的降解能力受到低温削弱时，在温带国家，在冬季，也可以用本 发明的处理的酶组合物生物修复污染的土壤和废水。
[0115] 除了可以在要求快速和温和失活处理的多步骤过程中应用的冷适应酶的结构易 变性外，由于其在低温和中等温度下增强的选择性和高催化活性，本发明的处理的酶组合 物也是有利的。此外，冷适应酶固有的构象可塑性，特别适合许多精细化学品和药用中间体 生产过程中所用的低水条件下的有机合成应用。
[0116] 本发明的酶组合物能够用于多种目的。例如，酶组合物为在工业处理温度下木质 纤维素物质的分解提供了强健的催化可选方案。在一些实施方案中，本发明的酶组合物可 以用于纤维和棉花的生物漂白。在纺织工业和造纸工业，酶组合物可以用于环境友好的方 法中。在一些实施方案中，酶组合物可以用于处理含有酚类、芳基胺、联氨物质以及纺织品 染料试剂的工业废水中。在一些实施方案中，酶组合物可以用于工业废液的脱毒。在一些 实施方案中，酶组合物可以用于天然韧皮纤维（例如大麻和亚麻）和棉花纤维的怄麻或生 物煮漂。在一些实施方案中，酶组合物可以用作生物修复的有效工具。
[0117] 例如，在一些实施方案中，通过使底物接触组合物和/或用组合物孵育底物，酶组 合物可以用于处理所述底物，其中所述底物包括酚羟基。在一些实施方案中，底物包含偶氮 基。在一些实施方案中，底物包含syrilgaldazine、刚果红、棉蓝、溴酚蓝、孔雀绿。在一些 实施方案中，底物包含邻二苯酚和对二苯酚、氨基酚、多酚、聚胺、木质素和/或芳基二胺。 在一些实施方案中，底物包含纺织品、羊毛、生物复合材料、废水、纸、木浆、土壤、动物饲料、 食品、饮料、除草剂、杀虫剂、染料、颜料或其组合。在一些实施方案中，底物包含木浆，所述 木浆包含木质素。
[0118] 在一些实施方案中，底物包含染料或颜料，其中酶与染料或颜料反应，并减少底物 的颜色或使底物脱色。在一些实施方案中，底物包括包含染料的纺织品，其中酶与染料或颜 料反应，并减少纺织品的颜色或使纺织品脱色。在一些实施方案中，底物包括包含酚类化合 物的饮料，其中酶与酚类化合物反应，并从饮料中减少或除去褐色或烟雾。在一些实施方案 中，饮料选自果汁、啤酒或葡萄酒。
[0119] 在一些实施方案中，本文公开的包含漆酶的酶组合物通过将酚类底物的酚羟基 催化为苯氧自由基，同时将分子氧（〇 2)还原为水，可以作用于底物。酶氧化技术在各种工 业领域中具有潜力，包括纸浆造纸工业、纺织品工业以及食品工业。
[0120] 在一些实施方案中，本文公开的包含果胶酶的酶组合物具有广泛多种用途。作为 实例而非限制，这类酶组合物可以用于食品加工和用于催化导致食品质量改善的化学反 应。本文公开的包含果胶酶的酶组合物在纸浆造纸工业、纺织品工业、果汁工业等中具有若 干用途。
[0121] 在一些实施方案中，本文公开的包含纤维素酶的酶组合物可用于各种工业，包括 纸浆造纸、纺织品、洗衣店、生物燃料生产、食品和饲料工业、酿造以及农业。由于酶系统的 复杂性和巨大工业潜力，纤维素酶已经成为学术研究团体和工业研究团体进行研究的潜在 候选对象。
[0122] 在一些实施方案中，本文公开的包含木聚糖酶的酶组合物可以用于生物技术；示 例性用途包括木浆的生物漂白，处理动物饲料以增加可消化性，处理食品以增加净化以及 将木质纤维素物质转化为原料和燃料。
[0123] 在一些实施方案中，本文公开的包含蛋白酶的酶组合物是有用的水解组合物，并 可用于去污剂、食品、药物、皮革、诊断、废物管理以及银回收。在一些实施方案中，蛋白酶是 细菌蛋白酶。
[0124] 下文提供了本发明酶组合物的示例性非限制性实例。
[0125] D.去污剂和清洁产品
[0126] 在一些实施方案中，本文公开的酶组合物可以用作去污剂。在一些实施方案中，去 污剂在低温下有效水解泥土和污点，由此降低能量消耗，这使得相关费用和环境影响降低。 另外，在温水-热水洗涤循环中发生的衣服改变，例如织物降解、收缩和渗色会减少。鉴于 特别是在欧洲和日本降低洗涤温度的趋势，本发明的酶组合物能在低温至中等温度条件下 在去污剂中有效发挥作用。
[0127] 例如，在一些实施方案中，酶组合物包含纤维素酶，且酶组合物用于产生基于纤 维素酶的去污剂。包含本发明的嗜冷纤维素酶酶组合物的基于纤维素酶的去污剂，具有优 异的清洁作用而不损害纤维，提高色彩亮度和污垢去除，除去棉花纤维中粗糙的突起，并提 供油墨颗粒的反再沉淀。
[0128] 在一些实施方案中，本发明的蛋白酶组合物可用于去污剂中，这是由于它们能帮 助除去蛋白质污点并实现常规去污技术不能获得的独特的效果。例如，在一些实施方案中， 包含本公开的蛋白酶组合物的去污剂具有改善的性/价比、提高的活性以及改善的与其他 去污剂成分的相容性。
[0129] E.纸产品和造纸
[0130] 在一些实施方案中，将本发明的酶组合物用于造纸。纸浆厂和造纸厂正使用酶来 解决它们制造过程中的问题。造纸本质上是连续的过滤过程，其中，纤维、纤维片段（细料） 以及无机填充颗粒如粘土的稀释悬浮液。在这些多糖中，突出的是果胶或聚半乳糖醛酸。聚 半乳糖醛酸复合阳离子多聚体的能力（阳离子需求量）强烈取决于它们的聚合程度，半乳 糖醛酸的单体、二聚体和三聚体不引起可测量的阳离子需求量，但是六聚体和长链具有高 阳离子需求量。本公开的果胶酶组合物例如可以用于解聚半乳糖醛酸的多聚体，并随后降 低果胶溶液的阳离子需求量和过氧化氢漂白的滤液。
[0131] 在一些实施方案中，本发明的酶组合物用于生产日本纸（Japanesepaper)。例如 由芽孢杆菌（Bacillussp.)和胡萝卜软腐欧文氏菌（Erwiniacarotovora)所产生的本发 明的碱性果胶酶组合物，由于其强浸渍活性，可用于Mitsumata韧皮的怄麻。这些怄麻的韧 皮用来制备日本纸。在一些实施方案中，来自利用本公开的组合物进行细菌怄麻的纸浆的 强度，与通过常规苏打粉蒸煮方法获得的强度一样高。由这种木浆制备的纸张非常一致并 且摸起来柔软。
[0132] 纸的工业制备包括木浆木质素的分离和降解。环境忧虑集中于替换污染的基于氯 的传统去木质化/漂白程序。因此，本公开的素嗜冷解木质素（降解木质素）酶（漆酶） 组合物可用于（预）处理木质纤维素原材料，如制浆中的木屑；这称为生物制浆。利用本 发明的酶组合物的生物制浆适用于机械纸浆和化学纸浆；优点包括在整个机械制浆过程中 降低精炼能量或增加研磨生产能力，并增强纸强度特性、减轻树脂问题、提高产量以及减少 机械和化学制浆以及造纸中的环境影响。在一些实施方案中，本发明的酶组合物可以用于 纸的工业制备。例如，本文公开的嗜冷漆酶组合物可以用于在制造复合材料的过程中活化 纤维板木质素，从而使得纤维板具有良好的机械特性，而无需毒性合成粘合剂。在一些实施 方案中，本发明的漆酶组合物可以用于将各种酚酸嫁接于牛皮纸浆纤维上。另外，本公开的 嗜冷木聚糖酶酶组合物可以用于除去牛皮纸浆中的残留木质素。来自牛皮纸浆制造法的残 留木质素在物理和化学上受到半纤维素的限制。木质素可以与半纤维素连接，并且已经从 牛皮纸浆中分离出木质素碳水化合物复合物。半纤维素是木聚糖酶的底物。
[0133] 在一些实施方案中，本发明的酶组合物可应用于生产纸浆和纸。例如，本文公开的 纤维素酶组合物可用作以下中的共添加剂（co-additive):纸浆漂白；生物机械制浆；改善 排水；酶法脱墨；减少能量需要；减少氯需要；改善纤维亮度、强度特性以及纸浆游离度和 清洁度；改善造纸厂的排水；生产生物可降解纸板、纸巾以及卫生纸。
[0134] 在一些实施方案中，本发明的酶组合物可用于减少造纸工业环境污染。例如，在传 统纸浆漂白过程中产生的氯化的酚类化合物以及多氯化的联苯，有毒且对生物降解由高抗 性，并构成环境污染主要来源之一。本公开的木聚糖酶组合物可以用于无氯木浆漂白过程。
[0135] F?废水和废水处理
[0136] 造纸厂和纸浆厂、基于糖蜜的酒厂、制革厂、染料生产单位和纺织品是一些生产并 排放深颜色废液的大型工业。除了产生审美学上不可接受的土壤和水体的强烈着色外，这 些工业废液中的每一种废液都产生一些特定问题。它们阻碍光通过水生系统的深层，导致 光合作用停止，导致厌氧条件，这反过来导致水生生命死亡，从而造成恶臭的有毒水。
[0137] 近年来，工业废液造成的污染问题已经增加。通常，染色过程的产量较低，且废 液中丧失的染料的百分比可以高达50%。例如，纺织品染料废液是复合物，含有广泛多种 染料、从纤维提取的天然杂质，以及其他产品，如分散剂、均化剂、酸、碱、盐，并且经常含有 重金属。通常，废液着色深，同时生物需氧量（B0D)、悬浮固体（SS)、毒性以及化学需氧量 (C0D)高，它的导电性高，并且本质上是碱性的。染料的降解产物经常是致癌的。为了满足 严格的环境规制，必须在将废水排放到环境之前对其进行处理。目前，处理染料废水的大多 数现有方法都是无效的且不经济。因此，开发基于上文所述的包含漆酶的组合物的方法似 乎是有吸引力的解决方案，这是由于它们降解多种化学结构的染料的潜力，包括目前工业 上使用的合成染料。本发明的酶组合物，例如包含漆酶的组合物，能通过自由基偶联催化氯 酚的聚合，使含有氯酚的废水脱毒。通过沉淀，可以从废水中除去偶联产物。氯酚也可以与 废水中存在的其他酚交叉偶联并沉淀，这可以提高它们的除去效率。
[0138] 在一些实施方案中，本发明的酶组合物用于处理果胶废水。来自柑桔加工业的废 水含有仅在活性污泥处理过程中被微生物分解的果胶物质。因此，本发明的含有果胶酶的 酶组合物可以用于处理果胶废水。
[0139] G.食品、饮料、词料工业、药品以及化妆品
[0140] 在一些实施方案中，本文公开的酶组合物对于食品加工特别有吸引力，这是由于 它们在使得味道和营养价值损坏和改变最下化的温度下的高催化活性。一旦获得希望的产 品，它们固有的低结构稳定性也促进失活。
[0141] 本发明的酶组合物在低温和环境温度下表现出高催化活性，并且还可以用于制药 工业。光学纯药物和医药中间体的需求增加，已经导致有机合成过程中生物催化剂使用的 快速扩张。
[0142] 在化妆品工业中，本发明的嗜冷酶组合物能提高涉及挥发性底物的生物转化收 率，例如经受高温下蒸发的风味和香料化合物。
[0143] 作为实例而非限制，在一些实施方案中，本发明的酶组合物可以用于提高或修饰 食品、动物饲料或饮料的色表的过程中。本发明的酶组合物可用于除去不希望的酚类物质， 酚类物质是清澈的果汁、啤酒和葡萄酒中褐变、烟雾形成以及发生浑浊的原因。在一些实施 方案中，酶组合物用于食品工业的不同方面，例如生物修复、饮料加工、抗坏血酸测定、甜菜 果胶凝胶化、烘烤以及，用作生物传感器。
[0144] 在一些实施方案中，本发明的酶组合物用于咖啡和茶叶发酵。例如，果胶酶在咖啡 和茶叶发酵中发挥重要作用。利用分解果胶的微生物使咖啡发酵，以从咖啡豆中除去粘液 包被。为了除去咖啡豆的果肉层，经常添加果胶酶，果肉层的四分之三由果胶物质构成。
[0145] 真菌果胶酶也用于生产茶。尽管必须小心调整酶量以避免损害茶叶，但是酶处理 加速茶叶发酵。果胶酶的添加通过破坏茶叶果胶还改善速溶茶粉的泡沫形成性。
[0146] 在一些实施方案中，本发明的酶组合物可以用于发酵。例如，纤维素酶可以用于改 善麦芽制造和打浆；改善葡萄的压榨和取色；改善葡萄酒的香味；改善啤酒的初发酵和质 量；改善葡萄酒的粘度和可滤性；提高葡萄酒生产过程中必须的净化；提高过滤速度恶化 葡萄酒的稳定性。
[0147] 在一些实施方案中，本发明的酶组合物可以应用于食品生产。例如，纤维素酶在以 下方面发挥作用：从水果和蔬菜渣中是否抗氧化剂；提高淀粉和蛋白质提取的产量；改善 水果和蔬菜的浸泡、压榨以及取色；果汁净化；改善焙烤食品的质地和质量；改善果泥的粘 度；改善水果和蔬菜的质地、风味、香味以及挥发性；控制柑橘类水果的苦味。
[0148] H?生物燃料
[0149] 在一些实施方案中，本发明的酶组合物用于制备生物燃料，例如由织物产生的碳 水化合物发酵制备的乙醇。用本发明的酶组合物制备的生物燃料代表了能提供大量其他效 益的可再生能源，包括能源安全提高、温室气体排放减少、农村社区的经济利益以及减轻 农业-工业残留处理相关的问题。目前，通过发酵基于淀粉作为的糖，生产所有染料乙醇， 工业酶公司正研发从廉价木质纤维素生物质便宜地生产乙醇的方法，包括农业废物、林业 废物、能源作物以及市政固体废物。作为实例而非限制，本发明的包含冷适应糖基水解酶如 纤维素酶、木聚糖酶以及糖苷酶的组合物能实现划算的木质纤维素生物质转化，因此促进 开发经济上可行的再生燃料源，以满足世界增长的能源需求。
[0150] I?酶纳米生物技术
[0151] 在一些实施方案中，本发明的酶组合物用于在低温和温和条件下合成纳米结构的 材料。这为传统合成技术提供了廉价的、环境友好的可选方案。
[0152] J.使用漆酶的示例性应用
[0153] 漆酶能作用于大范围的底物。其能氧化酚类木质素和非酚类木质素相关化合物以 及高顽抗性环境污染物，这使得它们对于若干生物技术过程的应用非常有用。这类应用包 括使主要来自造纸工业和纸浆工业、纺织品工业以及石油化学工业的工业废液脱毒，用作 医疗诊断工具，以及用作清理土壤中的除草剂、杀虫剂和某些爆炸物的生物修复剂。漆酶还 用作某些水纯化系统的清洁剂，用作生产抗癌药物的催化剂，以及甚至用作化妆品的组分。 此外，它们除去生物异源物质并产生聚合产物的能力使得它们成为用于生物修复目的的有 用工具。
[0154] 1.木质纤维素物质降解中的漆酶
[0155] 本发明的包含漆酶的酶组合物可用于降解木质纤维素物质。酶组合物可以用于例 如启动一系列氧化还原反应，氧化还原反应降解木质素（或木质素来源的污染物）。酶组合 物可以用于氧化芳香化合物，直到芳香环结构被切割为止，随后用其他酶进行另外降解。木 质纤维素物质的分解具有很多工业应用。
[0156] 木质纤维素物质的酶水解消化沼气（甲烷）或发酵乙醇的第一步。就容积价和市 场价值而言，乙醇是重要的可再生生物燃料。乙醇的需求具有较大市场，因为乙醇通常用 作化学原料或用作辛烷增强剂或汽油添加剂。因此，本发明的酶组合物可用于由木质纤维 素物质生产乙醇。
[0157] 沼气是用作汽车燃料或用于产热和发电的另一能源。用本发明的酶组合物预处理 木质纤维素物质会降解木质纤维素物质并有助于产生乙醇和沼气。
[0158] 木质纤维素分解废物的生物转化可能明显有助于有机化学品的生产。
[0159] 在一些实施方案中，本发明的酶组合物可用于生产香草醛。香草醛是木质素分解 的示例性生物产品。香草醛的最大用途是通常作为甜食的调味剂。其用于食品香料工业， 作为许多不同调料，特别是奶油特征调料（creamyprofile)的非常重要的基调（keynote)。 冰淇淋和巧克力工业共同占据作为调味剂的香草醛的75%的市场，较小量的香草醛用于糖 果和烘焙物。香草醛也用于香料工业、香水中，以屏蔽药品、牲畜饲料以及清洁产品中令人 不愉快的气味或味道。在药物和其他精细化学品的生产中，已经使用香草醛作为化学中间 体。
[0160] 2.在有机合成中的漆酶
[0161] 在一些实施方案中，本发明的包含漆酶的酶组合物可以用于有机合成中的若干应 用中，例如氧化官能团，偶联酚和类固醇。
[0162] 在一些实施方案中，本发明的包含漆酶的酶组合物可以用于将酚有氧转化为苯邻 二酚。苯邻二酚是杀虫剂、调料和香料的前体。约50%的合成苯邻二酚被杀虫剂生产消耗， 剩余的用作精细化学品如香水和药物的前体。
[0163] 苯邻二酚是有机合成中常用的基础材料（buildingblock)。几种工业上重要的 调料和香料的制备从苯邻二酚开始。愈创木酚通过甲基化苯邻二酚制备，然后转化为香草 醛。苯邻二酚的相关一乙基醚即乙基愈疮木酚（guethol)被转化为乙基香草醛，其是巧克 力糖果的组分。3-反式-异茨基环已醇（Isocamphylcyclohexanol)，广泛用作檀香油的替 代品，经由愈创木酚和莰酮由苯邻二酚制备。胡椒醛，具有花香气味，其由苯邻二酚的亚甲 基二醚制备，随后用乙二醛浓缩并脱羧。
[0164] 本发明的酶组合物可用于氧化酚类化合物（例如酚、多酚、间位取代的酚）、联氨 乙基各种利用分子氧的其他组分。在一些实施方案中，本发明的酶组合物用于通过氧化酚 和苯邻二酚合成醌。醌的大规模工业应用是用于生产过氧化氢。将2-烷基蒽醌氢化成相 应的对苯二酚（醌茜），其随后将H2转移给氧。
[0165] 醌的衍生物是生物相关分子的常见成分（例如维生素K1是叶绿醌）。天然或合成 醌类表现出生物或药理学活性，并且其中的一些表现出抗肿瘤活性并具有生物特性，包括 草药中的一些请求权。这些应用包括泻剂（sennosdes)、抗微生物剂（大黄酸-和红根草邻 醌）、抗肿瘤（大黄素和jugone)、抑制PGE2的生物合成（紫草醌（arnebinone)和紫草呋 喃醌（arnebifuranone))以及抗抗心血管疾病（丹参醌）。
[0166] 许多天然和人工着色物质（染料和颜料）是醌衍生物。作为染料，它们的重要性 仅仅次于偶氮染料，特别强调的蓝色。茜草色素（2, 3-二羟基-9,10-蒽醌），提取自茜草属 植物，是由煤焦油合成的第一种天然染料。
[0167] 3.漆酶在纺织品工业中的示例性应用
[0168] 本发明的漆酶酶组合物，在较高的温度下活性增强，可用于羊毛染色、粗纱煮漂 (rove scouring)、羊毛的耐缩处理以及染料合成。
[0169] 在纺织品加工中，本发明的漆酶酶组合物可用于在漂白过程中提高织物白度，使 染色的纺织品材料和着色的废液脱色和纤维煮漂，羊毛染色和羊毛抗毡化。本发明的漆酶 组合物可以用于给之前填充了对苯二酚的羊毛织物着色。本发明的漆酶组合物可以用于羊 毛染色。染料浴（dyebath)可以用染料前体（2, 5-苯二胺-磺酸）、染料改性剂（苯邻二 酚和间苯二酚）以及漆酶制备，而无需任何助染剂。
[0170] 本发明的漆酶酶组合物可用于降低羊毛织物的毡缩性。提高漆酶的浓度有助于降 低织物收缩。
[0171] 本发明的漆酶酶组合物可以用于粗纱处理以改善纱线的整齐性。使用漆酶进行粗 纱煮漂的优点在于，在温和反应条件下进行该过程，从而导致该过程在生态上是友好的。本 发明的漆酶酶组合物可用于通过3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙（MBTH)与酚的氧化偶联形成 偶氮染料。在两相水-有机介质（hydro-organicmedium)中，漆酶氧化阿魏酸，这导致稳 定的黄色产物的产生。
[0172] a.牛仔染整
[0173] 在纺织品染整工业中，靛蓝的酶降解在石磨水洗过程和染料废液处理中都有潜 力。在牛仔服装的制造过程中，在染色和最后石磨水洗之间包括数个步骤，其中从织物种除 去过量靛蓝，并将其与废水一起排放。用次氯酸钠处理，随后中和和漂洗步骤，部分漂白织 物，所有这些步骤都引起大量环境污染。本发明的酶组合物，例如具有漆酶的酶组合物，可 用于牛仔染整。
[0174] b.棉生物漂白
[0175] 棉漂白的目的是，使天然颜料脱色并赋予纤维纯白表观。黄酮类主要负责棉的颜 色。最常见的工业漂白剂是过氧化氢。然而，漂白剂与纤维的自由基反应能使聚合程度降 低，因而导致严重损害。此外，从纤维中除去过氧化氢需要大量水，这能对染色造成问题。因 此，用酶漂白系统替代过氧化氢不仅会由于较少的纤维损害而导致更好的产品质量，而且 也会大量节省除去过氧化氢所需的洗涤水。
[0176] 在一些实施方案中，本发明的酶组合物用于提高对棉纤维的漂白效果。例如，使用 低浓度的漆酶增强对棉纤维的漂白效果，这已有报道。同样，本发明的包含漆酶的酶组合物 由于黄酮类的氧化而能提高棉的白度。例如，研究已经证明，来自粗毛栓菌（T.hirsuta)的 新分离菌株的漆酶负责棉白度提高，这主要是可能是由于黄酮类的氧化所致。此外，足以提 高纤维白度的酶预处理的短时间，使得这种生物过程适合连续运作。
[0177] K.使用纤维素酶的应用
[0178] 1.农业中的纤维素酶
[0179] 在一些实施方案中，本发明的酶组合物可应用于农业。植物致病菌和疾病控制；植 物和真菌原生质体的生成；种子萌发增强和根系改善；植物生长和开花增强；土壤质量提 高；对无机肥料的依赖性降低。
[0180] 2.生物转化中的纤维素酶
[0181] 在一些实施方案中，本发明的酶组合物可以应用于生物转化。例如，将纤维素材料 转化为乙醇、其他溶剂、有机酸和单细胞蛋白以及脂质；广生商能动物词料；提商动物词料 的营养质量；改善反刍动物性能；提高饲料消耗和吸收；高质量饲料的保存。
[0182] 3.纺织品工业中的纤维素酶
[0183] 在一些实施方案中，本发明的酶组合物可应用于纺织品工业。例如，牛仔的生物石 磨；纺织品纤维的生物抛光；提高织物质量；提高纤维的吸收性；软化衣服；提高纤维织物 的稳定性；从织物种除去过量染料；恢复颜色亮度。
[0184] 4.使用纤维素酶的其他应用
[0185] 在一些实施方案中，本发明的酶组合物，其中酶是纤维素酶，可用于下述之一： 提高类胡萝卜素提取；改善类胡萝卜素的氧化和颜色稳定性；提高橄榄油提取；改善橄 榄酱的揉捏法；改善橄榄油的质量；降低生物废物风险；产生杂交分子；产生设计纤维体 (designercellulosomes)〇
[0186] L.使用木聚糖酶的示例性应用
[0187] 在本发明的一些实施方案中，使用包含木聚糖酶的酶组合物。示例性用途包括但 不限于木浆的生物漂白、处理动物饲料以提高可消化性、加工食品以提高净化以及将木质 纤维素物质转化为原料和染料。
[0188] 1?生物漂白（Bioleaching)
[0189] 在一些实施方案中，本发明的酶组合物可应用于生物漂白。在未完全除去木质素 的情况下，按常规方法将化学纸浆漂白至较高的亮度，并未成功。按照惯例，漂白使用氯。因 此，本发明的包括木聚糖酶的组合物用于生物漂白。
[0190] 2.使用木聚糖酶的其他示例性应用
[0191] 可应用本发明技术的包含木聚糖酶的其他领域包括但不限于用作家禽的食品添 加剂，用于小麦粉中用来改善面团处理和烘焙产品的质量，提取咖啡、植物油以及淀粉，提 高农业青贮饲料和谷物饲料的营养性质，以及与果胶酶和纤维素酶组合物组合物用于澄清 果汁和使植物纤维源如亚麻、大麻、黄麻以及苎麻脱胶。
[0192] M.使用果胶酶的示例性应用
[0193] 在一些实施方案中，本发明的果胶酶酶组合物用于水果和纺织品工业。本发明的 果胶酶酶组合物将植物组织的复杂多糖分解为较简单的分子如半乳糖醛酸。在一些实施方 案中，本发明的酸性果胶酶酶组合物可用于降低果汁的浑浊和苦味。在一些实施方案中，本 发明的酸性果胶酶酶组合物可用于纺织品工业，用来使纤维作物怄麻和脱胶，产生质量良 好的纸，使咖啡和茶叶发酵，用油提取和处理果胶废水。
[0194]果胶裂解酶是碱性酶。在一些实施方案中，本发明的果胶裂解酶酶组合物用于使 纤维作物脱胶和怄麻并预处理果汁工业的果胶废水。通常，这些酶主要来自细菌来源。在 工业部门，将主要来自芽孢杆菌（Bacillussp.)的本公开的碱性果胶酶组合物应用于下述 目的：
[0195] 1.纤维作物的怄麻和脱胶
[0196] 在一些实施方案中，本发明的酶组合物用于纤维作物的怄麻和脱胶。例如，水解果 胶的酶涉及黄麻、亚麻、大麻、芒麻、洋麻（Hibiscussativa)以及椰子壳的椰皮纤维的怄麻 和脱胶。怄麻是发酵过程，其中某些细菌（例如梭菌（Clostridium)、芽孢杆菌（Bacillus)) 和某些真菌（例如曲霉（Aspergillus)、青霉（Penicillium))分解树皮的果胶，并释放纤 维。
[0197] 苎麻纤维是卓越的天然纺织品，但是去壳的苎麻纤维含有20±35%苎麻树胶，其 主要由果胶和半纤维素构成；因此，为了满足纺织品的需要，必须使纤维脱胶。
[0198] 2.油提取
[0199] 在一些实施方案中，本发明的酶组合物用于油提取。来自油菜籽（卡诺拉 (canola))、椰子胚芽、葵花子、棕榈、果仁以及橄榄的油，传统上通过用有机溶剂提取而产 生。最常用的溶剂是己烷，其是潜在的致癌物质。细胞壁降解酶，包括果胶酶，可以用于通 过液化含油作物的结构细胞壁组分，在含水过程中提取植物油。 实施例
[0200] 通过下述实施例，进一步说明本发明，无论如何，不应当将下述实施例解释为限 制。
[0201] 实施例1.将酶截留于碳纳米管中在低淵和高淵下提高酶动力学
[0202] 将分离的细菌酶截留于脂质功能化SWCNT中。于4°C、30°C以及80°C下测试截留 酶的动力学，并将其与未截留的酶的动力学进行比较。
[0203] 方法和材料
[0204]SWCNT、Cu20以及羟磷灰石（HAp)纳米颗粒购自SIGMA-ALDRICH(登陆号分别为： 678945,702153)〇
[0205] 十壤细菌分泌的工业酶的分离
[0206] 水解果胶的细菌、分泌漆酶的细菌、水解纤维素的细菌以及分泌木聚糖酶的细菌 分离自喜马拉雅山的森林土壤，其高于海平面3800米。水解蛋白的细菌分离自森林土壤。
[0207] 利用"钌红"法分离了水解果胶的细菌菌株。在这种方法中，在YP琼脂平板上形 成了数个细菌菌落。用钌红溶液淹没YP平板。表现出光环的菌落被鉴定为水解果胶的菌 株。
[0208] 用"丁香醛连氮"方法分离了分泌漆酶的细菌菌株。在LPA平板上形成了细菌菌 落，用丁香醛连氮溶液淹没所述细菌菌落。形成紫色着色的细菌菌落被鉴定为分泌漆酶的 细菌。
[0209] 利用"酪蛋白"方法分离了水解蛋白的细菌菌株。使细菌菌落生长于琼脂偶氮酪 蛋白平板上。表现出白色沉淀带的菌落被鉴定为分解蛋白的细菌菌株，白色沉淀带表示酪 蛋白分解。
[0210] 利用"刚果红"方法分离了分泌木聚糖酶的细菌菌株。使细菌菌落生长于木聚 糖-琼脂平板上。用刚果红溶液淹没在木聚糖琼脂平板上形成的细菌菌落。形成光环的细 菌菌落被鉴定为分泌木聚糖酶的细菌。
[0211] 利用"刚果红"方法分离了水解纤维素的细菌菌株。使细菌菌落生长于CMC琼脂 平板上。用刚果红溶液淹没形成于CMC琼脂平板上的细菌菌落。形成光环的细菌菌落被鉴 定为分泌木聚糖酶的细菌。
[0212] 除了在37°C下培养水解蛋白的细菌外，将细菌培养物培养于20°C。
[0213] 酶的部分钝仆,
[0214] 利用两个连续过程将果胶酶部分纯化。首先利用离子交换层析（CM琼脂糖），接着 利用凝胶过滤层析（SephadexG-75)。
[0215] 利用是三个连续过程将漆酶部分纯化。首先利用30-80 %硫酸铵切割方法 (ammoniumsulphatecutmethod),随后利用离子交换层析（CM琼脂糖，最后利用凝胶过滤 层析（SephadexG-75).
[0216] 利用是三个连续过程将蛋白酶纯化。首先利用30-80%硫酸铵切割方法，随后利用 离子交换层析（CM琼脂糖），最后利用凝胶过滤层析（SephadexG-50)。
[0217] 利用两个连续过程将纤维素酶部分纯化。首先利用离子交换层析（DEAE cellulose),接着利用凝胶过滤层析（SephadexG-100)。
[0218] 利用两个连续过程将木聚糖酶部分纯化。首先利用离子交换层析（CM琼脂糖），接 着利用凝胶过滤层析（SephadexG-50)。
[0219] 酶活件测定
[0220] 利用TBA方法，将来自细菌的果胶酶与聚半乳糖醛酸（PGA)在25mMTris-HCl缓 冲液（pH-8. 5)中、在20°C下孵育2小时，孵育2小时后，于550nm测定红色的形成。
[0221] 利用丁香醛连氮测定，测定漆酶活性，丁香醛连氮测定测定525nm下的吸光度。将 lml上清液的适当稀释物添加于3ml25mMTris-HCl缓冲液（pH8. 5)中，并添加2ml底物 丁香醛连氮溶液（甲醇和被二恶烷1 : 2稀释），以使总测定系统达到5ml。从稻草到深粉 红色或紫罗兰的即时颜色变化证实漆酶活性。该测定在20°C下进行。
[0222] 利用偶氮酪蛋白方法测定蛋白酶活性。将蛋白酶与1% (w/v)偶氮-酪蛋白于 37°C在25mMpH8. 5的Tris-HCl缓冲液中孵育10分钟。通过添加4ml5%三氯乙酸终止反 应。将内容物以3000Xg离心lOmin(分钟）。取1毫升上清液，通过添加5ml0. 4MNa2C03， 接着添加〇. 5mlFolinsCiocalteus试剂，测定产物。获得660nm下样品的光密度。
[0223] 利用二硝基水杨酸方法，进行纤维素酶测定。取lml培养物滤液置于测试管中，并 用2ml蒸馏水平衡。向制备的培养物滤液添加3mlDNS试剂。在沸水浴中将测试管中的内 容物加热5min。加热后，允许内容物在室温下冷却。在冷却时间，添加7ml新鲜制备的40% 酒石酸钾钠溶液。冷却后，在U.V.分光光度计中于510nm读取样品。利用标准图形测定还 原糖的量。
[0224] 1%桦木木聚糖溶液作为底物，测定木聚糖酶活性，并利用二硝基水杨酸方法测定 释放的还原糖的量。酶活性的一个单位定义为，在给定条件下，每分钟产生的ImM木糖当 量。在U.V.分光光度计中，于410nm读取样品。
[0225]将酶捕获于SWCNT中
[0226] 参考图17,下面的内容是将酶截留于脂质功能化SWCNT100中的抽样法。
[0227] 首先将多个SWCNT101与脂质102混合。脂质与SWCNT的比例（wt/wt)为约5 : 1。 基础功能化化学是现有技术已知的，参见例如Bhattacharyyaetal.，Nanotechnology, 23 (2012) 385304 (8pp)或IP0592/K0L/2012 和PCT/IB2012/001509。简而言之，允许两个纳 米表面在紧密的毛细管中相互作用。根据固态相互作用，只要界面区发生反应，则界面会扩 散。预期在界面分子再定位。与固态化学反应一样，这一再定位可以视为与扩散或易位机 制偶联的纳米规模的反应。
[0228] 脂质与SWCNT109的连接产生具有极性头部103和尾部104的SWCNT。脂质功能 化SWCNT105可以具有附着于SWCN的一个末端或SWCN的两个末端或的极性头部。
[0229] 脂质功能化SWCNT将自组装110为"纳米笼" 106。
[0230] 将纳米笼与酶107混合，并将混合用声波111处理约2-5分钟。用于下文实验的 脂质功能化SWCNT的量：酶的量为0. 5mg/mlSWCNT:0. 18mg/ml果胶裂解酶、0. 25mg/ml漆 酶、0?llmg/ml纤维素酶、0? 2mg/ml木聚糖酶以及0? 22mg/ml蛋白酶。
[0231] 声波处理将纳米笼106分解成个体脂质功能化SWCNT105,其位于具有酶107的溶 液中。声波处理后，脂质功能化SWCNT会自再组装112。在自再组装过程中，酶会被截留于 形成的纳米笼108中。
[0232] 为了观察纳米颗粒是否能影响SWCNT捕获的酶的活性，将酶截留于具有Cu20或 Hap或两者的SWCNTnanorope笼中，并测定活性。对于漆酶而言，Cu20的浓度为0.ImM，对 于木聚糖酶而言，Hap浓度为13. 2iiM，for对于果胶裂解酶而言，为17. 6iiM，对于纤维素酶 而言，浓度为22iiM。
[0233] 允许脂质与固态SWCNT从一端和两端相互作用。分子再定位发生于SWCNT和脂质 的界面。这些复合体在目的水或缓冲液（例如lml25mMTris-HCl缓冲液（pH8. 5))中形成 假胶束结构。于40°C，lml25mMTris-HCl缓冲液（pH8. 5)中存在的酶被捕获于所述结构 的内核内。在测定这些SWCNT捕获的酶的活性后，将复合体以1000RPM离心5分钟，随后进 行温和的声波处理。离心过程用于从未功能化的SWCNT中纯化功能化的SWCNT。声波处理 后，分子组装崩溃。声波处理进行2分钟。当在酶存在的情况下允许再组装时，复合体与 40°C下捕获于所述结构内核的酶形成相同的超分子结构（纳米笼）。通常，允许组装再组装 48小时。
[0234] 酶动力学参数
[0235] 酶在工业过程中的使用经常需要高温和低温反应，以便提高生产力。这反过来暗 示，酶在低温下是耐受性的。为了洞察纯化的果胶酶、漆酶、蛋白酶、纤维素酶以及部分纯化 的木聚糖酶对高温以及低温的耐受性，测定动力学参数（下文给出）。为了研究酶动力学， 缓冲液（25mMTris-HCl，pH8. 5)不含补充的相应钙离子和铜离子，仅将Hap和Cu20纳米颗 粒添加于相应测定体系中。
[0236] Km、Vmax以及活化會R(Ea)
[0237]计算Hap处理和未处理的果胶酶、蛋白酶、纤维素酶（cellulose)以及木聚糖酶， 和Cu20纳米颗粒处理和未处理的纯化的漆酶的动力学参数，即Km、Vmax以及活化能（Ea)。 计算温度范围4-80°C的活化能（Ea)。
[0238] Km衡量酶如何有效结合底物，即酶与底物之间的亲和性。Km小表示结合紧密，而 Km大则表不结合较弱。
[0239] Vmax衡量一旦与其酶结合，底物会被以何种速率转化为产物。
[0240] Ea是引起化学反应所需的最低能量。
[0241] 结果
[0242] 与未捕获的酶相比，脂质功能化SWCNT捕获增强酶-底物特异性，并且降低活化 能。参考表1-3,被纳米颗粒（NP)截留于脂质功能化SWCNT中的所有酶，与其未捕获的副 本（无NP)相比，在所有温度范围（4°C、30°C和80°C)内，都表现出明显更高的Vmax以及 更低的Km和Ea。这些结果表明，脂质功能化SWCNT截留增强了截留酶的活性，这允许酶在 其正常温度范围外高效率发挥功能。
[0243] 表1. 4°C下的酶动力学
[0244]

【权利要求】
1. 酶组合物，包含： 一种或多种脂质功能化石墨烯或脂质功能化富勒烯；和 至少一种酶，所述酶被所述脂质功能化石墨烯或脂质功能化富勒烯截留但不与其连 接，其中与对照酶相比，所述组合物中的截留酶的活性增强。
2. 如权利要求1所述的组合物，其中所述截留酶包括漆酶、果胶酶、蛋白酶、纤维素酶 以及木聚糖酶中的一种或多种。
3. 如权利要求1所述的组合物，其中所述截留酶包括嗜冷酶、嗜温酶和嗜热酶中的一 种或多种。
4. 如权利要求1所述的组合物，其中所述截留酶增强的活性包括下述中的一种或多 种：增强的pH耐受:性、增强的耐温性、提1?的半寿期、提1?的Vmax、提1?的Km以及提1?的活 化能（Ea)。
5. 如权利要求1所述的组合物，还包括多个纳米颗粒，其中所述纳米颗粒与所述酶接 触但不与其连接。
6. 如权利要求5所述的组合物，其中所述纳米颗粒包括羟磷灰石、铜、氯化镁、氯化锰、 氯化钙、锌、镁以及锰中的一种或多种。
7. 如权利要求1所述的组合物，其中所述脂质功能化富勒烯包含至少一个脂质功能化 碳纳米管。
8. 如权利要求1所述的组合物，其中所述脂质功能化石墨烯或脂质功能化富勒烯包含 至少一种脂质，所述脂质包括磷脂、鞘脂、鞘磷脂以及类固醇中的一种或多种。
9. 如权利要求7所述的组合物，其中所述一个脂质功能化碳纳米管包括单壁碳纳米管 (SWCNT)、双壁碳纳米管或多壁碳纳米管中的一种或多种。
10. 处理底物的方法，所述方法包括： 使第一底物与酶组合物接触，所述酶组合物包含： 脂质功能化石墨烯或脂质功能化富勒烯；和 至少一种截留酶， 其中所述酶被所述脂质功能化石墨烯或脂质功能化富勒烯截留但不与其连接，且其中 与对照酶相比，所述酶组合物中的截留酶具有增强的活性。
11. 如权利要求10所述的方法，其中： 所述脂质功能化富勒烯包含至少一种脂质功能化碳纳米管，其包括单壁碳纳米管 (SWCNT)、双壁碳纳米管或多壁碳纳米管中的一种或多种； 所述酶组合物包含多个纳米颗粒，其中所述纳米颗粒与所述酶接触但不与其连接，其 中所述纳米颗粒包括羟磷灰石、铜、氯化镁、氯化锰、氯化钙、锌、镁以及锰中的一种或多种； 以及 所述截留酶包括漆酶、果胶酶、蛋白酶、纤维素酶以及木聚糖酶中的一种或多种。
12. 如权利要求10所述的方法，其中所述接触在约4°C至约30°C的温度下进行。
13. 如权利要求10所述的方法，其中所述接触在约35°C至约80°C的温度下进行。
14. 如权利要求10所述的方法，还包括： 分离所述酶组合物与所述第一底物；和 使第二底物与所述酶组合物接触。
15. 截留酶的方法，所述方法包括： 使一种或多种脂质功能化石墨烯或脂质功能化富勒烯和至少一种酶在混合物中、在适 合将所述酶截留于所述脂质功能化石墨烯或脂质功能化富勒烯中的条件下接触； 和声波处理所述混合物。
16. 如权利要求15所述的方法，其中所述截留酶包括嗜冷酶、嗜温酶以及嗜热酶中的 一种或多种。
【文档编号】C12N11/14GK104342429SQ201410401014
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2014年8月11日 优先权日:2013年8月9日
【发明者】A·K·达斯古普塔, N·杜塔, K·查克拉博蒂, T·巴特查里亚, A·穆霍帕德亚 申请人:加尔各答大学