同时分离培养犬骨髓间充质干细胞和多功能造血干细胞的方法
【专利摘要】本发明涉及犬干细胞分离培养技术，尤其是体外同时分离培养犬骨髓间充质干细胞和多功能造血干细胞的技术。本发明的特征在于在分离骨髓单个核细胞的基础上，贴壁培养原代间充质干细胞的同时，采用半量换液，再加入单个核细胞培养悬液的方法，即利用贴壁生长的间充质干细胞所提供的造血微环境培养悬浮生长的多功能造血干细胞，从而达到同时分离培养犬骨髓间充质干细胞和多功能造血干细胞的目的。
【专利说明】同时分离培养犬骨髓间充质干细胞和多功能造血干细胞的 方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及犬干细胞分离培养技术，尤其是体外同时分离培养犬骨髓间充质干细 胞和多功能造血干细胞的技术。
【背景技术】
[0002] 骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stemcells, BMMSCs)是一种存在 于骨髓的非造血干细胞，来源方便、无免疫排斥、具多系分化和高度增殖潜力，近年来在基 础研究领域、临床组织器官修复领域和疾病治疗领域呈现出极为诱人的前景；多功能造血 干细胞（Hematopoietic stem cells, HSCs)是骨髓等造血组织中一类原始细胞，具有自 我更新定向分化（即分化成各类成熟血细胞）及归巢（即静脉输注后经外周血循环进入 髓窦，再跨越血管内皮屏障并定位于骨髓的血管外间隙）等生物学功能，对于血液细胞的 再生和重建发挥着重要作用。
[0003] 传统分离BMMSCs和HSCs的方法主要包括密度梯度离心法、流式细胞仪分离法、 磁珠分选法等，但局限于所需操作步骤繁琐，所需时间久，对细胞损伤大，人为因素多，而且 HSCs的体外培养需要加入各种生长因子和诱导因子。因此当进行大规模细胞分离培养时需 要一种省时省力并且高效的细胞分离培养的方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于建立一种适用于体外进行大规模细胞分离培养，能高效同时分 离培养犬BMMSCs和HSCs的方法，为后续犬类干细胞的研究和临床应用提供物质基础和技 术支撑。
[0005] 本发明公开了一种分离培养犬骨髓间充质干细胞和多功能造血干细胞的方法，其 特征在于在分离骨髓单个核细胞的基础上，贴壁培养原代间充质干细胞的同时，采用半量 换液，再加入单个核细胞培养悬液的方法，即利用贴壁生长的间充质干细胞所提供的造血 微环境培养悬浮生长的多功能造血干细胞，从而达到同时分离培养犬骨髓间充质干细胞和 多功能造血干细胞的目的，具体操作步骤如下 ： 步骤1、BMMSCs和HSCs的体外分离：常规麻醉实验犬，髂后上棘备皮、消毒、铺巾，用 含lml肝素钠的骨髓穿刺针分2?3点共抽取骨髓约10ml，混匀防凝，迅速转入50ml消毒 离心管，用等量DMEM/F12稀释混匀；取10支底部加入5ml淋巴细胞分离液的离心管，加入 的淋巴细胞分离液浓度为1.077 g/ml，上层分别贴壁流入等量骨髓稀释液，封口，控制温度 4°C，离心机转速为2000 r/min，离心20min去除上层脂肪细胞，吸取中间交界处白膜层细 胞，然后用4°C的10 ml DMEM/F12混匀洗涤界层细胞，再次离心20min，转速2000r/min，去 除上清液，重复上述洗涤界层细胞步骤1次；用含15% FBS、100 U/ml青霉素、100 U/ml链 霉素的DMEM/F12培养基5ml重悬沉积物； 步骤2、台盼蓝染色测定细胞活力：取0.4g台盼蓝，加入100 ml的0. 1 M PBS溶液中， 配制成 0· 4% 台盼蓝溶液，(λ 1M PBS 溶液配方：NaCl 8g，KC1 (λ 2g，Na2HP04. 12H20 3. 488g， KH2P04 0.2g，加三蒸去离子水至1000 ml，调整PH值为7. 4,0.22 Mm滤膜过滤除菌。取 0.4%台盼蓝溶液0.5 ml、DMEM/F12培养基0.3 ml和细胞悬液0.2 ml充分混匀，用血球 计数板计数活细胞（未着色细胞）和死细胞（着色细胞），共计数500个细胞，计算细胞活 力，细胞活力（％) =(细胞总数一着色细胞数）/细胞总数X 100%。如台盼蓝染色细胞 活力彡95%，则可进行下一步操作，否则重复步骤1 (重复步骤l、BMMSCs和HSCs的体外分 离）； 步骤3、培养贴壁的BMMSCs:首次培养时用含15% FBS、100 U/ml青霉素、100 U/ml链 霉素（双抗）的DMEM/F12培养液调整细胞密度，以1 X 106/ml细胞密度5 ml的培养液接种 于25 cm2的一次性细胞培养瓶内，置于温度37°C，5% C02、饱和湿度的细胞培养箱中培养， 培养3天后首次换液，去除红细胞、悬浮生长的骨髓造血干细胞及其它未贴壁的骨髓干细 胞，以后每隔3天换液1次，即换新鲜的含有15% FBS、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素 的DMEM/F12培养液，待细胞生长至70%?80%融合时，用0. 25%胰蛋白酶消化2?3min，用 含10%的FBS及双抗的DMEM/F12终止消化，反复吹打瓶壁细胞，制成单细胞悬液按1:3传 代，倒置显微镜逐日观察，直至贴壁细胞彼此融合铺满瓶底时，重复上述操作，反复传代扩 增，收集； 步骤4、培养悬浮生长的HSCs:由于HSCs在体外悬浮生长，且需要基质细胞支持的生长 环境，因此在步骤3培养BMMSCs的过程中，在第二次换液时，弃去细胞瓶内的全部上清液， 加入由步骤1、2所得到的细胞悬液，用含10% FBS及双抗的DMEM/F12培养液调整细胞密 度为lX106/ml，吸取5 ml细胞悬液直接接种于贴壁细胞层的上面，此后每6天半量换液， 即从培养瓶中取出2. 5 ml细胞培养悬液，离心20min，转速2000r/min，收集细胞沉淀即为 HSCs，然后再加入2. 5 ml的含10% FBS及双抗的DMEM/F12培养液，按此法继续培养下去， 倒置显微镜观察细胞生长情况，直到帖壁的BMMSCs生长至80%融合时，可同时收集悬浮生 长的HSCs和帖壁生长的BMMSCs ; 步骤5、细胞鉴定：（1)形态学鉴定：倒置显微镜下观察贴壁生长的BMMSCs呈长梭形 或多边形的纤维细胞状，悬浮生长的HSCs呈圆形，细胞光亮，折光性好；（2)流式细胞术鉴 定：分别取培养的BMMSCs和HSCs，用PBS制成30〇μ1含有2. 5 X 106个的单细胞悬液；分装 至6只1. 5ml的Eppendof管中，分别加入5〇μ1羊血清封闭30min ;再分别加入鼠源一抗 CD14、CD34、CD44、CDlla、HLA2DR 及对照 PBS 各 5μ1，混匀，反应 30min ;PBS 离心洗涤 2 次， 去除未标记上的抗体；各管用PBS配制成99μ1细胞悬液；每管再加入?μ? FITC标记山羊 抗小鼠 IgG(H+L)二抗，混匀，37°C下避光反应15min ;PBS离心洗涤2次；每管再加入lml PBS重新混悬细胞，用流式细胞仪检测细胞表面抗原⑶14、⑶34、⑶44、⑶11a和HLA2DR的 表达；BMMSCs强表达⑶44 (间充质干细胞特异性分子抗原），HSCs强表达⑶34 (造血干细 胞特异性分子抗原）； 步骤6、BMMSCs和HSCs的冻存及复苏：（1)冻存：每代的BMMSCs和HSCs，除用于延续 培养和进行相关实验所有外，全部冻存。细胞冻存液：10% DMS0,40% FBS，50% DMEM/F12维 持培养液调整细胞浓度为IX l〇6/ml，加入无菌的细胞冻存管中，每管1. 5 ml，应用程序降 温仪冻存于液氮中；（2)复苏：从液氮中迅速取出细胞冻存管，立即置入37°C水浴箱，轻轻 摇动使其尽快融化，取出冻存管，用75%乙醇消毒后开启，吸出细胞悬液，注入离心管，转速 2000r/min，离心20min，去除上清液，用含10% FBS及双抗的DMEM/F12培养液培养液重悬细 胞沉淀，置温度37°C，5% C02、饱和湿度的细胞培养箱中培养。
[0006] 本方法在传统分离培养的方法上进行了创新和改进，克服了犬干细胞分离时繁琐 的筛选步骤，犬多功能造血干细胞悬浮于培养液、不易生长、需要加入各种生长因子和诱导 因子的缺陷，使用本发明的方法能同时分离培养犬骨髓间充质干细胞和多功能造血干细 胞，所得到的细胞形态均一，培养细胞所需时间缩短，分离得到的两种干细胞纯度较高，增 殖较快。本发明方法为犬类干细胞的研究和应用提供了丰富的材料来源，具有广泛的犬类 临床医学应用前景。
【具体实施方式】
[0007] 实施例1、步骤1、BMMSCs和HSCs的体外分离：常规麻醉实验犬，髂后上棘备皮、 消毒、铺巾，用含lml肝素钠的骨髓穿刺针分2?3点共抽取骨髓约10ml，混匀防凝，迅速 转入50ml消毒离心管，用等量DMEM/F12稀释混匀；取10支底部加入5ml淋巴细胞分离 液（1.077 g/ml)的离心管，上层分别小心加入（贴壁流入）等量骨髓稀释液，封口。4°C， 2000 r/min，离心20min去除上层脂肪细胞，小心吸取中间交界处白膜层细胞。用4°C 10ml DMEM/F12混匀洗涤界层细胞，2000r/min，离心20min，去除上清液，重复洗涤1次；用含15% FBS、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素的DMEM/F12培养基5ml重悬沉积物； 步骤2、台盼蓝染色测定细胞活力：取0· 4 %台盼蓝（PBS配制）0· 5 ml、DMEM/F12培 养基0.3 ml和细胞悬液0.2 ml充分混匀，用血球计数板计数活细胞（未着色细胞）和死 细胞（着色细胞），共计数500个细胞，计算细胞活力，细胞活力（％) =(细胞总数一着色 细胞数）/细胞总数X 100%。如台盼蓝染色细胞活力彡95%，则可进行下一步操作，否则重 复步骤1 ; 步骤3、培养贴壁的BMMSCs :首次培养时用含15% FBS及双抗（青链霉素）的DMEM/F12 培养基调整细胞密度，以IX l〇6/ml细胞密度5 ml的培养液接种于直径为25 cm2的培养 瓶内，置37°C，5% C02、饱和湿度的细胞培养箱中培养。培养3天后首次换液，去除红细胞、 悬浮生长的骨髓造血干细胞及其它未贴壁的骨髓干细胞。以后每隔3天换液1次，细胞生 长至70%?80%融合时，用0. 25%胰蛋白酶+0. 0396EDTA 3 ml消化2?3min，用含10%的 FBS及双抗的DMEM/F12终止消化，反复吹打瓶壁细胞，制成单细胞悬液按1:3传代，倒置显 微镜逐日观察，直至贴壁细胞彼此融合铺满瓶底时，重复上述操作，反复传代扩增，收集。
[0008] 步骤4、培养悬浮生长的HSCs :由于HSCs在体外悬浮生长，且需要基质细胞支持的 生长环境，因此在步骤3培养BMMSCs的过程中，在第二次换液时，弃去细胞瓶内的全部上清 液，加入由步骤1、2所得到的细胞悬液。用含10% FBS及双抗（青链霉素）的DMEM/F12培 养液调整细胞密度为IX l〇6/ml，吸取5 ml细胞悬液直接接种于贴壁细胞层的上面。此后 每6天半量换液，即从培养瓶中取出2. 5 ml细胞培养悬液，2000r/min，离心20min，收集细 胞沉淀即为HSCs。然后再加入2. 5 ml新鲜培养液，按此法继续培养下去，倒置显微镜观察 细胞生长情况，直到帖壁的BMMSCs生长至80%融合时，可同时收集悬浮生长的HSCs和帖壁 生长的BMMSCs。
[0009] 步骤5、细胞鉴定：（1)形态学鉴定：倒置显微镜下观察贴壁生长的BMMSCs呈长梭 形或多边形的纤维细胞状，悬浮生长的HSCs呈圆形，细胞光亮，折光性好。（2)流式细胞术 鉴定：分别取培养的BMMSCs和HSCs，用PBS制成30〇μ1含有2. 5X 106个的单细胞悬液；分 装至6只1. 5ml的Eppendof管中，分别加入5〇μ1羊血清封闭30min ;再分别加入鼠源一抗 CD14、CD34、CD44、CD1 la、HLA2DR 及对照 PBS 各 5μ1，混匀，反应 30min ;PBS 离心洗涤 2 次， 去除未标记上的抗体。各管用PBS配制成99μ1细胞悬液；每管再加入?μ? FITC标记山羊 抗小鼠 IgG(H+L)二抗，混匀，37°C下避光反应15min ;PBS离心洗涤2次；每管再加入lml PBS重新混悬细胞，用流式细胞仪检测细胞表面抗原⑶14、⑶34、⑶44、⑶11a和HLA2DR的 表达。BMMSCs强表达⑶44 (间充质干细胞特异性分子抗原），HSCs强表达⑶34 (造血干细 胞特异性分子抗原）。
[0010] 步骤6、BMMSCs和HSCs的冻存及复苏：（1)冻存：每代的BMMSCs和HSCs，除用于 延续培养和进行相关实验所有外，全部冻存。细胞冻存液：10% DMS0,40% FBS，50% DMEM/ F12维持培养液调整细胞浓度为1 X 106/ml，加入无菌的细胞冻存管中，每管1. 5 ml，应用程 序降温仪冻存于液氮中；（2)复苏：从液氮中迅速取出细胞冻存管，立即置入37°C水浴箱， 轻轻摇动使其尽快融化，取出冻存管，用75%乙醇消毒后开启，吸出细胞悬液，注入离心管， 转速2000r/min，离心20min，去除上清液，用含10% FBS及双抗的DMEM/F12培养液培养液 重悬细胞沉淀，置温度37°C，5% C02、饱和湿度的细胞培养箱中培养。
【权利要求】
1. 一种分离培养犬骨髓间充质干细胞和多功能造血干细胞的方法，其特征在于在分离 骨髓单个核细胞的基础上，贴壁培养原代间充质干细胞的同时，采用半量换液，再加入单个 核细胞培养悬液的方法，即利用贴壁生长的间充质干细胞所提供的造血微环境培养悬浮生 长的多功能造血干细胞，从而达到同时分离培养犬骨髓间充质干细胞和多功能造血干细胞 的目的，具体操作步骤如下： 步骤1、BMMSCs和HSCs的体外分离：常规麻醉实验犬，髂后上棘备皮、消毒、铺巾，用 含lml肝素钠的骨髓穿刺针分2?3点共抽取骨髓约10ml，混匀防凝，迅速转入50ml消毒 离心管，用等量DMEM/F12稀释混匀；取10支底部加入5ml淋巴细胞分离液的离心管，加入 的淋巴细胞分离液浓度为1.077 g/ml，上层分别贴壁流入等量骨髓稀释液，封口，控制温度 4°C，离心机转速为2000 r/min，离心20min去除上层脂肪细胞，吸取中间交界处白膜层细 胞，然后用4°C的10 ml DMEM/F12混匀洗涤界层细胞，再次离心20min，转速2000r/min，去 除上清液，重复上述洗涤界层细胞步骤1次；用含15% FBS、100 U/ml青霉素、100 U/ml链 霉素的DMEM/F12培养基5ml重悬沉积物； 步骤2、台盼蓝染色测定细胞活力：取0.4g台盼蓝，加入100 ml的0. 1 M PBS溶液中， 配制成 0· 4% 台盼蓝溶液，(λ 1Μ PBS 溶液配方：NaCl 8g，KC1 0· 2g，Na2HP04. 12H20 3. 488g， KH2P04 0. 2g，加三蒸去离子水至1000 ml，调整PH值为7. 4,0. 22 Mm滤膜过滤除菌； 取0. 4%台盼蓝溶液0. 5 ml、DMEM/F12培养基0. 3 ml和细胞悬液0. 2 ml充分混匀， 用血球计数板计数活细胞（未着色细胞）和死细胞（着色细胞），共计数500个细胞，计算 细胞活力，细胞活力（％) =(细胞总数一着色细胞数）/细胞总数X 100%; 如台盼蓝染色细胞活力>95%，则可进行下一步操作，否则重复步骤1 (重复步骤1、 BMMSCs和HSCs的体外分离）； 步骤3、培养贴壁的BMMSCs:首次培养时用含15% FBS、100 U/ml青霉素、100 U/ml链 霉素（双抗）的DMEM/F12培养液调整细胞密度，以1 X 106/ml细胞密度5 ml的培养液接种 于25 cm2的一次性细胞培养瓶内，置于温度37°C，5% C02、饱和湿度的细胞培养箱中培养， 培养3天后首次换液，去除红细胞、悬浮生长的骨髓造血干细胞及其它未贴壁的骨髓干细 胞，以后每隔3天换液1次，即换新鲜的含有15% FBS、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素 的DMEM/F12培养液，待细胞生长至70%?80%融合时，用0. 25%胰蛋白酶消化2?3min，用 含10%的FBS及双抗的DMEM/F12终止消化，反复吹打瓶壁细胞，制成单细胞悬液按1:3传 代，倒置显微镜逐日观察，直至贴壁细胞彼此融合铺满瓶底时，重复上述操作，反复传代扩 增，收集； 步骤4、培养悬浮生长的HSCs :由于HSCs在体外悬浮生长，且需要基质细胞支持的生长 环境，因此在步骤3培养BMMSCs的过程中，在第二次换液时，弃去细胞瓶内的全部上清液， 加入由步骤1、2所得到的细胞悬液，用含10% FBS及双抗的DMEM/F12培养液调整细胞密 度为lX106/ml，吸取5 ml细胞悬液直接接种于贴壁细胞层的上面，此后每6天半量换液， 即从培养瓶中取出2. 5 ml细胞培养悬液，离心20min，转速2000r/min，收集细胞沉淀即为 HSCs，然后再加入2. 5 ml的含10% FBS及双抗的DMEM/F12培养液，按此法继续培养下去， 倒置显微镜观察细胞生长情况，直到帖壁的BMMSCs生长至80%融合时，可同时收集悬浮生 长的HSCs和帖壁生长的BMMSCs ; 步骤5、细胞鉴定：（1)形态学鉴定：倒置显微镜下观察贴壁生长的BMMSCs呈长梭形 或多边形的纤维细胞状，悬浮生长的HSCs呈圆形，细胞光亮，折光性好；（2)流式细胞术鉴 定：分别取培养的BMMSCs和HSCs，用PBS制成30〇μ1含有2. 5X 106个的单细胞悬液；分装 至6只1. 5ml的Eppendof管中，分别加入5〇μ1羊血清封闭30min ;再分别加入鼠源一抗 CD14、CD34、CD44、CDlla、HLA2DR 及对照 PBS 各 5μ1，混匀，反应 30min ;PBS 离心洗涤 2 次， 去除未标记上的抗体；各管用PBS配制成99μ1细胞悬液；每管再加入?μ? FITC标记山羊 抗小鼠 IgG(H+L)二抗，混匀，37°C下避光反应15min ;PBS离心洗涤2次；每管再加入lml PBS重新混悬细胞，用流式细胞仪检测细胞表面抗原⑶14、⑶34、⑶44、⑶11a和HLA2DR的 表达；BMMSCs强表达⑶44 (间充质干细胞特异性分子抗原），HSCs强表达⑶34 (造血干细 胞特异性分子抗原）； 步骤6、BMMSCs和HSCs的冻存及复苏：（1)冻存：每代的BMMSCs和HSCs，除用于延续 培养和进行相关实验所有外，全部冻存； 细胞冻存液：10% DMS0,40% FBS，50% DMEM/F12维持培养液调整细胞浓度为1X106/ ml，加入无菌的细胞冻存管中，每管1.5 ml，应用程序降温仪冻存于液氮中；（2)复苏：从 液氮中迅速取出细胞冻存管，立即置入37°C水浴箱，轻轻摇动使其尽快融化，取出冻存管， 用75%乙醇消毒后开启，吸出细胞悬液，注入离心管，转速2000r/min，离心20min，去除上清 液，用含10% FBS及双抗的DMEM/F12培养液培养液重悬细胞沉淀，置温度37°C，5% C02、饱 和湿度的细胞培养箱中培养。
【文档编号】C12N5/0789GK104152409SQ201410405353
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月18日 优先权日:2014年8月18日
【发明者】严玉霖, 汪登如, 曹景锋, 陈玲, 严梓丹 申请人:云南农业大学