用于肠道病毒CoxB5的RT-LAMP检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于肠道病毒CoxB5的RT-LAMP检测试剂盒，该试剂盒针对肠道病毒CoxB5VP1基因设计了6种LAMP引物,配合LAMP反应液构成肠道病毒CoxB5的RT-LAMP检测体系。本发明试剂盒具有快速、灵敏和特异的检测特点,而且检测成本低廉,操作简单,反应结果易于观察。适用于肠道病毒CoxB5的快速检测，尤其适用于基层推广和突发公共卫生事件的现场检测。
【专利说明】用于肠道病毒CoxB5的RT-LAMP检测试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学【技术领域】，尤其是涉及一种用于实验室诊断肠道病毒 CoxB5的RT-LAMP检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 研究显示，肠道病毒是导致病毒性脑炎爆发的主要病毒，全球各地每年都有肠道 病毒导致的病毒性脑炎发生，在希腊、韩国、斯洛伐克、台湾地区、香港地区、印度和中国大 陆均有发生，血清型各不相同。2006年，河南省信阳市爆发了一起由肠道病毒CoxB5 (柯萨 奇B5)引起的病毒性脑炎。在随后的2010年和2011年连续两年，平顶山市和漯河市又分 别爆发了一起由肠道病毒CoxB5引起的病毒性脑炎。2013年，在河南省安阳市也爆发了一 起由肠道病毒CoxB5引起的病毒性脑炎。种种现象表明，肠道病毒CoxB5在河南省已经形 成一定的规模，逐渐呈现出一种长期的、大范围流行的趋势。
[0003] 肠道病毒CoxB5的感染者轻者可致低烧，重者可出现小儿麻痹、脑炎、心肌炎和呼 吸衰竭等等。人类对肠道病毒CoxB5普遍易感，而且目前肠道病毒CoxB5既没有常规监测， 也没有常规计划免疫提供。鉴于这样的流行趋势、临床表现和免疫现状，肠道病毒CoxB5可 能会成为河南省一个新的突发公共卫生事件的热点。但针对这种严重的现状，现有的检测 方法却费时费力，成本高昂，不能满足现场快速诊断的需求。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种用于肠道病毒CoxB5的RT-LAMP检测试剂盒，本试剂 盒能够快速、简便、敏感、特意的检测病毒性脑炎患者中的肠道病毒CoxB5,为突发公共卫生 事件的处理提供准确的实验室诊断依据。
[0005] 为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案： 本发明所述的用于肠道病毒CoxB5的RT-LAMP检测试剂盒，包括六种反应引物，所述六 种反应引物依次为： FIP ：GTTGGTGGACGTCTGCCAGCGGTGCCCACGAAAGTGAA ； F3 ：TGTATGTGCCCCCAGGT ； BIP ：AAGACATGGGTCCCAAGACCACTTCTGGTACTGGCACAACCT ； B3 ：TCAGTCACGCCAGTAGGTT ； F1C ：GTTGGTGGACGTCTGCCAGC ； B1C ：AAGACATGGGTCCCAAGACCAC〇
[0006] 所述反应引物FIP是基于肠道病毒CoxB5 VP1基因3'端的F2c和Flc区设计而 成，由F2区和F1C区组成，F2区与F2c区互补，F1C区与Flc区序列相同；所述反应引物F3 是基于肠道病毒CoxB5 VP1基因3'端的F3c区设计而成，与F3c区互补；所述反应引物BIP 是基于肠道病毒CoxB5 VP1基因5'端的B1和B2区设计而成，由B1C和B2区组成，B1C区 与Blc区序列互补，B2区与B2区序列相同；所述反应引物B3是基于肠道病毒CoxB5 VP1 基因5'端的B3区设计而成，和B3c区互补；所述反应引物FIC和BIC是分别基于肠道病 毒CoxB5 VP1基因3'端的F2c区和5'端的B2区设计而成，分别与F2c区和B2区互补。
[0007] LAMP针对肠道病毒CoxB5 VP1基因设计引物，肠道病毒VP1区段是肠道病毒中和 抗原位点主要所在区域，也是肠道病毒基因型别的决定区域。针对该区域设计的引物保证 了检测的特异度。同时，LAMP引物的设计主要是基于肠道病毒CoxB5 VP1基因区域3'端 的F3c、F2c和Flc区以及5'端的Bl、B2和B3区等六个不同的位点设计的六种引物。
[0008] 本发明的优点主要体现在以下几点： 1、 灵敏度高：测试结果显示，肠道病毒CoxB5的RT-LAMP检测试剂盒的灵敏度比传统的 RT-PCR方法高2?5个数量级； 2、 特异性好：本发明以肠道病毒CoxB5标准株、肠道病毒CoxB5河南省标准株和肠道病 毒CoxB5型河南省流行株为模板，针对肠道病毒CoxB5型VP1区设计引物，引物特异性好、 准确性高； 3、 简便安全：操作简单、安全，无需专门的仪器设备，结果可直接通过肉眼观察； 4、 快速直观：速度快，可在3(T60min内完成，比PCR节约至少60min。
【专利附图】
【附图说明】
[0009] 图1是本发明的工作原理图。
[0010] 图2是RT-LAMP的特异性结果图。
[0011] 图3是RT-LAMP的敏感性结果图。
【具体实施方式】
[0012] 本发明所述的用于肠道病毒CoxB5的RT-LAMP检测试剂盒，它包括针对肠道病毒 CoxB5 VP1基因区段设计的FIP、F3、BIP、B3、F1C和B1C六种反应引物，六种反应引物的核 苷酸序列分别为： FIP ：GTTGGTGGACGTCTGCCAGCGGTGCCCACGAAAGTGAA ； F3 ：TGTATGTGCCCCCAGGT ； BIP ：AAGACATGGGTCCCAAGACCACTTCTGGTACTGGCACAACCT ； B3 ：TCAGTCACGCCAGTAGGTT ； FIC ：GTTGGTGGACGTCTGCCAGC ； BIC ：AAGACATGGGTCCCAAGACCAC〇
[0013] 本发明试剂盒的阳性质控品为原核表达的肠道病毒CoxB5河南省标准株 (GenBank序列号：HQ998851)。阴性质控品为去离子水（DW)。
[0014] 本发明的反应体系为：RNA 5· ΟμΙ?Ρ (8〇Mm/L) 0· 5μ1，ΒΙΡ (8〇Mm/L) 0· 5Pl，FIC (40Mm/L)0.5Pl，BIC (40Mm/L)0.5Pl，F3 (1〇Μπι/υ〇·5μ1，Β3 (1〇Μπι/υ〇·5μ1，酶溶液 (ΕΜ)1·〇μ1，2Χ反应缓冲液12·5μ1，去离子水（DW)3.5Pl。酶溶液（EM)，2X反应缓冲液， 去离子水（DW)均来自北京蓝谱生物科技有限公司生产的Loopamp?RNA Amplification kit (SLP244)。反应条件为：63°C 40min，85°C 5min。
[0015] 本发明试剂盒的主要组成成分见下表1。
[0016] 表1本发明试剂盒的主要组成成分
【权利要求】
1. 一种用于肠道病毒CoxB5的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：它包括六种反应引 物，所述六种反应引物依次为： FIP ：GTTGGTGGACGTCTGCCAGCGGTGCCCACGAAAGTGAA ； F3 ：TGTATGTGCCCCCAGGT ； BIP ：AAGACATGGGTCCCAAGACCACTTCTGGTACTGGCACAACCT ； B3 ：TCAGTCACGCCAGTAGGTT ； F1C ：GTTGGTGGACGTCTGCCAGC ； B1C ：AAGACATGGGTCCCAAGACCAC〇
2. 根据权利要求1所述的用于肠道病毒CoxB5的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：所 述反应引物FIP是基于肠道病毒CoxB5 VP1基因 3'端的F2c和Flc区设计而成，由F2区 和F1C区组成，F2区与F2c区互补，F1C区与Flc区序列相同；所述反应引物F3是基于肠 道病毒CoxB5 VP1基因 3'端的F3c区设计而成，与F3c区互补；所述反应引物BIP是基于 肠道病毒CoxB5 VP1基因 5'端的B1和B2区设计而成，由B1C和B2区组成，B1C区与Blc 区序列互补，B2区与B2区序列相同；所述反应引物B3是基于肠道病毒CoxB5 VP1基因 5' 端的B3区设计而成，和B3c区互补；所述反应引物FIC和BIC是分别基于肠道病毒CoxB5 VP1基因 3'端的F2c区和5'端的B2区设计而成，分别与F2c区和B2区互补。
【文档编号】C12Q1/70GK104152587SQ201410405707
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月18日 优先权日:2014年8月18日
【发明者】黄学勇, 李幸乐, 胡小宁, 马红霞, 杜燕华, 马宏, 许汴利, 刘国华 申请人:河南省疾病预防控制中心