一株低聚果糖合成菌及其发酵培养方法
【专利摘要】本发明提供了一株低聚果糖合成菌及其发酵培养方法。该低聚果糖合成菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus?amyloliquefaciens)NK-18，CGMCCNo.9505。利用本发明提供的低聚果糖合成菌株能够合成分子量为5-7KD的果聚糖，且分子量分布窄，d＝1.06-1.07。发酵液低聚果糖含量高，大于30g/L；发酵产物纯度高，大于98％。该菌株产低聚果糖的营养要求简单，传代稳定，且培养方式简单易行，具有良好的应用前景。
【专利说明】一株低聚果糖合成菌及其发酵培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物法制备低聚果糖的生产，具体的涉及一株低聚果糖的合成菌株及 其发酵培养方法。
【背景技术】
[0002] 果聚糖（Fructan，也叫果糖聚合物）是自然界普遍存在的，主要由果糖基连接而 成的生物大分子聚合物。分子量通常在几千到几百万之间。根据果糖基连接位置的不同， 果聚糖主要分为以下三类 ：（l)LeVan果聚糖：主要以β (2 -6)糖苷键连接；（2)菊糖：主 要以β (2 - 1)糖苷键连接；（3)混合果聚糖：一种混合型果聚糖，它由β (2 - 1)糖苷键 和β (2 - 6)糖苷键连接。细菌产果聚糖主要是以β (2 - 6)糖苷键连接Levan果聚糖。
[0003] Levan果聚糖除了具有天然多糖的共性外，还具有其他特性。食品方面：它可作为 功能性食品的重要组成部分、乳化剂及成膜剂等。医药方面：levan果聚糖具有抗肿瘤、免 疫调控、抗感染等作用，还可以作为血浆的替代品。化妆品方面：由于它具有与透明质酸相 类似的保湿效果以及对人体角质细胞和成纤维细胞增殖作用，可作为化妆品添加剂。因此， Levan果聚糖的生产具有巨大的市场前景。Levan果聚糖在植物中含量低，天然提取及分离 成本很高，不适宜工业化生产。因此利用微生物发酵法合成Levan果聚糖具有很好的应用 开发前景。
[0004] 低聚果糖是聚合度较低的果糖聚合物。低聚果糖为白色粉末状，甜味柔和清爽、清 香，无异味。除具有一般功能性低聚糖的物理化学性质外，还具有其独特的生理特性。它是 肠内双歧杆菌的活化增殖因子，可减少和抑制肠内腐败物质的产生，抑制有害细菌的生长， 调节肠道内平衡，改善肠道内微生物种群比例；能促进微量元素铁、钙的吸收与利用，以防 止骨质疏松症；可减少肝脏毒素，能在肠中生成抗癌的有机酸，有显著的防癌功能；且口味 纯正香甜可口，具有类似脂肪的香味和爽口的滑腻感。由于其显著的保健功能使得它在保 健品生产方面具有很好的市场前景。
【发明内容】
[0005] 一、要解决的技术问题
[0006] 本发明的目的之一是提供一株低聚果糖的合成菌，另一目的是提供该菌株的发酵 培养方法。
[0007] 二、技术方案
[0008] 本发明从食品中筛选得到一株低聚果糖合成菌，形态学特征为：在固体LB平板 上表现为菌落呈圆形，边缘整齐，较粘稠，半透明状。通过16SrDNA鉴定，确定为解淀粉芽 孢杆菌菌属（Bacillus amyloliquefaciens)菌株，命名为：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)NK_18。该菌株已于2014年8月12日保藏于中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；菌种保藏号 为：CGMCCNo. 9505。
[0009] 解淀粉芽抱杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)NK-18, CGMCC No. 9505 的分离方 法为：用灭过菌的小铲采用无菌操作将发酵食品接入无菌生理盐水中，-4°C条件下，在磁力 搅拌器上搅拌30分钟，然后转入10(TC处理15分钟；再进行梯度稀释，选择合适梯度的菌 悬液涂布在筛选平板上，挑取单菌落若干株传代纯化。
[0010] 解淀粉芽抱杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)NK-18, CGMCC No. 9505 的发酵特 征为：在利用碳水化合物进行发酵过程中会产酸；而且发酵液较粘稠。
[0011] 本发明的第二个目的是提供解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens) NK-18, CGMCC No. 9505用于生产低聚果糖的发酵培养方法。为实现这一目的，本发明采取 以下技术方案和操作步骤：
[0012] (1)菌种活化：接种解淀粉芽抱杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)NK-18,CGMCC No. 9505至LB固体培养基，在30-40°C恒温培养24小时；
[0013] (2)种子培养：将固体培养基活化的菌种接种至50mL种子培养基中，30_40°C， 150-200rpm振荡培养16-24小时；
[0014] (3)摇瓶发酵：以1%至2 %的接种量将种子液接入发酵培养基中，30-40°C， 150-200rpm振荡培养24-48小时；
[0015] (4)将发酵液8000rpm，4°C离心20min，取上清用4倍体积无水乙醇沉淀，收集沉 淀，用蒸馏水溶解，透析处理48小时，然后冷冻干燥得到发酵产物低聚果糖；
[0016] 其中所用到的培养基的组成为：
[0017] (1)培养皿固体培养基：蛋白胨8. 0-12. 0g/L，酵母粉3. 0-8. 0g/L， NaC19. 0-11. 0g/L，琼脂 15. 0-25. 0g/L，ρΗ6· 5-7. 2 ;
[0018] (2)种子培养基为：蛋白胨 5-10g/L，酵母粉 5-10g/L，NaC15-10g/L ;
[0019] (3)蔗糖 150-250g/L，尿素 1· 5-4. 5g/L，K2HP045g/L，KH2P043g/L，MgS0 40 . 6-0 . 9g/ L，微量元素（FeS04、CaCl2, MgS04, ZnCl2) 2mL/L。
[0020] 本发明与现有技术相比，突出优点在于：本发明提供的低聚果糖合成菌株分离自 发酵食品，具有安全性，对人体没有毒副作用；又该菌株发酵培养能够合成分子量为5-7KD 的果聚糖，且分子量分布窄，d = 1. 06-1. 07。发酵液低聚果糖含量高，大于30g/L ;发酵产 物纯度高，大于98%。该菌株产低聚果糖的营养要求简单，传代稳定，且培养方式简单易行， 具有良好的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 附图1为所合成的低聚果糖的13C核磁共振波谱；
[0022] 附图2为所合成的低聚果糖的1Η核磁共振波谱；
[0023] 附图3为所合成的低聚果糖的结构式。
[0024] 下面结合具体实例对本发明做进一步说明。
【具体实施方式】
[0025] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0026] 实施例1 :低聚果糖合成菌的分离筛选：用灭过菌的小铲采用无菌操作将发酵食 品接入无菌生理盐水中，-4°C条件下，在磁力搅拌器上搅拌30分钟，然后转入KKTC处理15 分钟；再进行梯度稀释，选择合适梯度的菌悬液涂布在筛选平板上，挑取菌落若干株传代纯 化。
[0027] 实施例2 :解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciensNK-18)的培养及低聚 果糖的检测：①菌种活化：接种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens NK-18至LB 固体培养基，在37°C恒温培养24小时；②种子培养：将固体培养基活化的菌种接种至50mL 种子培养基中，37°C，180rpm振荡培养24小时；③摇瓶发酵：以1%的接种量将种子液接入 发酵培养基中，37°C，180rpm振荡培养48小时；④低聚果糖的检测：核磁共振检测；水解果 聚糖测果糖单体含量。
[0028] 实施例3 :解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciensNK-18)的培养及低聚 果糖的检测：①菌种活化：接种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens NK-18至LB 固体培养基，在37°C恒温培养24小时；②种子培养：将固体培养基活化的菌种接种至50mL 种子培养基中，37°C，180rpm振荡培养16小时；③摇瓶发酵：以2%的接种量将种子液接入 发酵培养基中，37°C，180rpm振荡培养48小时；④低聚果糖的检测：核磁共振检测；水解果 聚糖测果糖单体含量。⑤检测结果：产量为30g/L ;纯度98% ;分子量为：5000-7000Da ;分 子量分布：1. 06。
[0029] 实施例4 :解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciensNK-18)的培养及低聚 果糖的检测：①菌种活化：接种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens NK-18至LB 固体培养基，在30°C恒温培养24小时；②种子培养：将固体培养基活化的菌种接种至50mL 种子培养基中，30°C，150rpm振荡培养16小时；③摇瓶发酵：以1%的接种量将种子液接 入发酵培养基中，30°C，150rpm振荡培养48小时；④低聚果糖的检测：核磁共振检测；水解 果聚糖测果糖单体含量。⑤检测结果：产量为40g/L ;纯度99% ;分子量为：5000-6000Da ; 分子量分布：1. 06。
[0030] 实施例5 :解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciensNK-18)的培养及低聚 果糖的检测：①菌种活化：接种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens NK-18至LB 固体培养基，在40°C恒温培养24小时；②种子培养：将固体培养基活化的菌种接种至50mL 种子培养基中，40°C，200rpm振荡培养16小时；③摇瓶发酵：以5%的接种量将种子液接入 发酵培养基中，40°C，200rpm振荡培养24小时；④低聚果糖的检测：核磁共振检测；水解果 聚糖测果糖单体含量。⑤检测结果：产量为50g/L ;纯度98% ;分子量为：6000-7000Da ;分 子量分布：1. 07。
[0031] 实施例6 :解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciensNK-18)的培养及低聚 果糖的检测：①菌种活化：接种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens NK-18至LB 固体培养基，在30°C恒温培养24小时；②种子培养：将固体培养基活化的菌种接种至50mL 种子培养基中，30°C，180rpm振荡培养16小时；③摇瓶发酵：以3%的接种量将种子液接入 发酵培养基中，30°C，180rpm振荡培养24小时；④低聚果糖的检测：核磁共振检测；水解果 聚糖测果糖单体含量。⑤检测结果：产量为35g/L ;纯度99% ;分子量为：5500-6500Da ;分 子量分布：1. 07。
【权利要求】
1. 一株低聚果糖合成菌-解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)NK_18， CGMCCNo. 9505。
2. 利用权利要求1所述解淀粉芽抱杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)NK_18，CGMCC No. 9505发酵合成低聚果糖的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤： ① 菌种活化：接种解淀粉芽抱杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)NK_18，CGMCC No. 9505至LB固体培养基，在30-40°C恒温培养24小时； ② 种子培养：将固体培养基活化的菌种接种至50mL种子培养基中，30-40°C， 150-200rpm振荡培养16-24小时； ③ 摇瓶发酵：以1-5%的接种量将种子液接入发酵培养基中，30-401：，150-200印111振 荡培养24-48小时； ④ 将发酵液8000rpm，4°C离心20min，取上清用4倍体积无水乙醇沉淀，收集沉淀，用蒸 馏水溶解，透析处理48小时，然后冷冻干燥得到发酵产物低聚果糖； 其中，种子培养基为：蛋白胨5-10g/L，酵母粉5-10g/L，NaC15-10g/L ;发酵培养基为： 蔗糖 150-250g/L，尿素 1. 5-4. 5g/L，K2HP045g/L，KH2P043g/L，MgS0 40. 6-0. 9g/L，微量元素 (FeS04, CaCl2, MgS04, ZnCl2) 2mL/L〇
【文档编号】C12R1/07GK104195077SQ201410405975
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月18日 优先权日:2014年8月18日
【发明者】宋存江, 冯俊, 韩丽芳, 王淑芳, 谷燕燕, 孙扬 申请人:南开大学