一种烟草发酵所得烟用香料及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种烟草发酵所得烟用香料及其应用。从云南烤烟红花大金元品种烟叶中分离了一株优势微生物，分类命名为长孢洛德酵母(Lodderomyces elongisporus).CGMCC6645。将该酵母接种到以烟草为原料的培养基中进行发酵培养。培养之后的发酵产物具有天然香味，含有苯乙醇、4-羟基丁酸内酯、邻苯二甲酸二丁酯等多种致香成分。将该烟用香料添加到烟丝中，具有有效增加清香感，改善烟气口感和余味，提高喉部舒适性，降低刺激性，掩盖杂气，以及使吸味更加柔和的良好效果。整个生产工艺简单、实用，具有良好的应用前景。
CGMCC No.6645
2012.10.08
【专利说明】一种烟草发酵所得烟用香料及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于卷烟香精香料【技术领域】，具体是涉及一种用酵母菌发酵烟草后得到的 烟用香料。同时，本发明还涉及该烟用香料在卷烟生产中的具体应用。
【背景技术】
[0002] 烟草是我国财政的重要支柱之一。国家烟草专卖局在"十一五"中国卷烟科技发 展纲要第7条明确指出，要"攻克影响烟叶香气质、香气量的关键技术"，缩小与国外烟叶质 量差距，以提高国内外市场竞力。
[0003] 烟用香精香料是专供各种烟草制品加香矫味使用的一种添加剂。烟用香精香料技 术是烟草行业的核心技术之一。通过近年的研究，国内在烟用香精香料技术方面取得了一 定成绩，对形成中式卷烟香气和吃味特征做出了贡献。烟用香料一般分为天然烟用香料和 人工合成烟用香料。天然烟用香料在加入卷烟后经燃烧裂解能释放出香气香味，在卷烟生 产中占据着非常重要地位。
[0004] 随着中国烟草工业的快速发展，大品牌的形成，卷烟减害降焦的要求，以及烟草品 类的进一步完善，对高品质天然烟用香精香料的需求与日俱增，天然香料资源日渐短缺，市 场价格比较昂贵。微生物发酵生产天然香料具有发酵周期短、发酵效率高、低成本、高收益、 环境友好等优势，能够满足天然香料工业的需求。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种以特殊的产香酵母发酵烟草后 制备得到的烟用香料，该香料符合天然香料的要求，能够与烟香形成良好的配伍。
[0006] 本发明的目的还在于提供所述烟用香料在卷烟生产中的具体应用。
[0007] 本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
[0008] 除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。
[0009] 本发明从云南烤烟红花大金元品种烟叶中分离了一株优势微生物0F-08作为试 验菌种，对其进行了 26S rDNA分析，鉴定结果表明该菌株属于长孢洛德酵母，其分类命名为 Lodderomyces elongisporus，保藏号为 CGMCC No. 6645。
[0010] 本发明所述的长孢洛德酵母（Lodderomyces elongisporus)菌株的形态学特征 为：菌落较大，呈卵球形，奶白色凸起，菌落比较粗糙，边缘整齐；在液体培养基中，培养液 澄清有沉淀，且有菌蹼。
[0011] 本发明所述的长孢洛德酵母0F-08的分子鉴定特征为：利用通用引物NL-I (5'CAT ATCAATAAGCGGAGGAAAAG3'）和 NL-4 (5' GGTCCGTGITTCAAGACGG3'），以长孢洛德酵母 0F-08 的 基因组DNA作为模板扩增得到600bp左右的PCR产物，回收测序、校正之后得到的0F-08菌 株的部分26S rDNA基因序列578bp，该序列已经提交国际核苷酸序列数据库（GenBank)，序 列索引号为JQ916053。
[0012] 利用所述长孢洛德酵母菌发酵烟草，制备得到一种烟用香料，其特征在于：将烟草 粉碎后与水按1:5?1:50的质量比配制成发酵培养基，高压灭菌后按1%的质量比接种长 孢洛德酵母CGMCC6645,发酵培养2天后对发酵液进行过滤浓缩，即得所需烟用香料。
[0013] 所述的烟草与水的质量比优选为1:20。
[0014] 所述的烟草包括烟片、烟梗或烟末；优选为烟梗。
[0015] 所述烟草发酵所得烟用香料在卷烟生产中的应用，具体为：在卷烟制丝加料阶段， 将所述烟用香料喷洒在预先平衡好的烟丝上，添加量为8?12g/箱烟丝；其中，烟丝平衡的 条件为：温度22±2°C，相对湿度60% ±2%，平衡时间24h。
[0016] 与现有技术相比，本发明具有以下突出的优点：
[0017] (1)通过长孢洛德酵母菌发酵烟草得到的烟用香料，具有天然香料的香味，通过 GC-MS检测，结果表明发酵液中含有苯乙醇、4-羟基丁酸内酯、邻苯二甲酸二丁酯等致香成 分；将该香料添加到卷烟中进行评吸，具有有效增加清香感，改善烟气口感和余味，提高喉 部舒适性，降低刺激性，掩盖杂气，以及使吸味更加柔和的良好效果。
[0018] (2)本发明原料价格低廉，来源丰富；所用菌株易于保存，易于活化和发酵；
[0019] (3)生产工艺简单、操作容易、成本低廉，便于实现大规模工业化生产，具有良好的 开发应用前景。
[0020] 保藏生物材料的说明
[0021] 本发明的菌株，已于2012年10月08日，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心（CGMCC);该中心地址：中国北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研 究所。该菌株分类命名为长孢洛德酵母（Lodderomyces elongisporus);保藏号为CGMCC No.6645〇
【具体实施方式】
[0022] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例及试验数 据，对本发明作进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发 明，并不用于限定本发明。
[0023] 实施例1
[0024] -长孢洛德酵母菌0F-08 (L. elongisporus 0F-08)的筛选方法。
[0025] 烟叶样品用自来水冲洗3_5min并用细毛刷清除叶片表面污垢。叶片自然晾干后， 随机选5片叶子，在健康部位（无病斑）用无菌剪刀随机取下3X3cm 2的组织块3-5片，混 合后用无菌水漂洗5min并用无菌滤纸吸干水分。称取IOg叶块，按下述程序进行表面消 毒：75%的无菌酒精浸泡lmin，无菌水清洗3次，并用无菌滤纸吸干水分，避免酒精残留； 再用有效氯含量为3 %的NaClO溶液浸泡2min，无菌水清洗后吸干水分，置于超净工作台中 备用。取200 μ L最后一次洗涤组织的无菌水涂布在YH)培养基平板，28°C培养2d后无酵 母菌菌落出现，表明消毒彻底。将经过表面消毒的组织块放在无菌研钵中研磨至浆状，加入 IOmL无菌水，混匀后用3层无菌擦镜纸过滤，获得的滤液用无菌水稀释至ΙΟ'ΙΟ'ΚΓ3。每 一稀释度取200 μ L涂布一个YH)培养基平板，每个浓度设定3个重复，三个浓度共9皿。涂 布平板在超净工作台中放置5h后于32°C下倒置培养2d，统计每平板的微生物菌落数，并对 所得的内生酵母进行纯化、保存和鉴定，得到了长孢洛德酵母（L. elongisporus 0F-08)。
[0026] 实施例2
[0027] -发酵烟草材料
[0028] 取适量烟草材料（包括碎烟片、烟梗、烟梗末等），分别用蒸馏水稀释5倍、10倍、 15倍、20倍、30倍和50倍，高压灭菌后按1 %的接种量接入长孢洛德酵母菌CGMCC6645对 其进行发酵，培养两天后观察发酵液变化情况，结果表明，发酵液具有天然香味。通过比较 不同的烟草材料发酵情况，结果表明，发酵烟梗末所得的香料，香味比较纯正、浓厚。并且， 发酵材料和水的比例不同，发酵液的变化情况不一样，产香效果也不一样。烟草材料和水的 比例为1:20时，发酵效果比较明显。
[0029] 实施例3
[0030] --发酵液的萃取
[0031] 将实施例2所得的发酵液过滤除渣后，用二氯甲烷溶剂同时蒸馏萃取3h，萃取液 用无水硫酸钠干燥，置于4°C过夜，过滤，减压浓缩至约lml，浓缩液用于GC-MS分析（详见 表1)。对照为不接种酵母菌的培养基。
[0032] --发酵液物质成分测定
[0033] 酵母菌发酵烟草材料所得香料中含有多种烟用香料成分，包括苯乙醇、邻苯二甲 酸二丁酯、4-羟基丁酸内酯、糠醛、7-羟基-6-甲氧基香豆素、对羟基苯乙醇、莨菪亭、二轻 猕猴桃内酯等。其中，最主要的成分为具有天然香味的苯乙醇，为29. 312%。其次为4-羟 基丁酸内酯，含量为6. 795%，再次为邻苯二甲酸二丁酯，为6. 591 %。而在对照中，5-羟 甲基糠醛的含量最高，为19. 918%，其次为烟碱，占总物质成分的9. 312%，再次为7-羟 基-6-甲氧基香豆素，占总含量的9. 765%。另外，经酵母菌发酵后，发酵液中的烟碱含量也 有所降低，从原来的11. 259%降到1. 831%。结果表明，酵母菌0F-08对烟草材料的发酵不 仅可以产生天然香料，对烟草等还具有显著地改善作用。
[0034] 表1烟草材料发酵液物质成分含量检测结果 [0035]
【权利要求】
1. 一种烟草发酵所得烟用香料，其特征在于：将烟草粉碎后与水按1:5?1:50的质量 比配制成发酵培养基，高压灭菌后按1 %的质量比接种长孢洛德酵母CGMCC6645,发酵培养 2天后对发酵液进行过滤浓缩，即得所需烟用香料。
2. 根据权利要求1所述的烟草发酵所得烟用香料，其特征在于：所述的烟草与水的质 量比优选为1:20。
3. 根据权利要求1所述的烟草发酵所得烟用香料，其特征在于：所述的烟草包括烟片、 烟梗或烟末；优选为烟梗。
4. 权利要求1所述烟草发酵所得烟用香料在卷烟生产中的应用，具体为：在卷烟制丝 加料阶段，将所述烟用香料喷洒在预先平衡好的烟丝上，添加量为8?12g/箱烟丝；其中， 平衡的条件为：温度22±2°C，相对湿度60% ±2%，平衡时间24h。
【文档编号】C12R1/645GK104223353SQ201410408908
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年8月19日 优先权日:2014年8月19日
【发明者】冯斌, 段焰青, 李利君, 杨培香, 夏建军, 党立志, 王文元, 刘亚 申请人:云南中烟工业有限责任公司