编码双峰驼肌球蛋白的核苷酸序列、双峰驼肌球蛋白及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种编码双峰驼肌球蛋白的核苷酸序列、双峰驼肌球蛋白及应用，涉及基因工程【技术领域】。本发明的主要技术方案为：一种编码双峰驼肌球蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列是序列表中SEQ?ID?NO:1第21-5939位。或者，所述核苷酸序列为在高严谨条件下与序列表中SEQ?ID?NO:1第21-5939位的核苷酸序列杂交且编码双峰驼肌球蛋白。或所述核苷酸序列与序列表中SEQ?ID?NO:1第21-5939位的核苷酸序列具有90％以上同源性且编码双峰驼肌球蛋白。本发明还提供一种双峰驼肌球蛋白，由如上所述核苷酸序列编码。优选的双峰驼肌球蛋白由序列表中SEQ?ID?NO:2所示的氨基酸组成。
【专利说明】编码双峰驼肌球蛋白的核苷酸序列、双峰驼肌球蛋白及应 用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程【技术领域】，特别是涉及编码双峰驼肌球蛋白的核苷酸序列、 双峰驼肌球蛋白及应用。
【背景技术】
[0002] 肌球蛋白（myosin)肌原纤维粗丝的组成单位，存在于平滑肌中。在肌肉运动中起 重要作用。其分子形状如豆芽状，由两条重链和多条轻链构成。两条重链的大部分相互螺 旋形地缠绕为杆状，构成豆芽状的杆，重链的剩余部分与轻链一起，构成豆芽的瓣。被激活 后，具有活性的、能分解ATP的ATP酶。其分子量约为51万。在粗丝中，都是分子的头朝向 粗丝的两端，呈纵向线性缔合排列。
[0003] 肌球蛋白是由森特?吉奥尔吉（A · Szent - Gyrgyi，1942)分离出来的，但是相当 于现在所说的肌动球蛋白物质是库恩（W.Khne，1859)最初从蛙中抽提出来的，并被命名为 肌球蛋白。肌球蛋白的ATP酶活性是由苏联的V.A.Engelhardt夫妇（1939)发现的。
[0004] 肌球蛋白作为细胞骨架的分子马达，是一种多功能蛋白质，其主要功能是为肌肉 收缩提供力。纤丝滑动学说（slidingfilamenttheory)认为肌肉收缩是由于肌动蛋白细丝 与肌球蛋白丝相互滑动的结果。在肌肉收缩过程中，粗丝和细丝本身的长度都不发生改变， 当纤丝滑动时，肌球蛋白的头部与肌动蛋白的分子发生接触、转动，最后脱离的连续过程， 其结果使细丝进行相对的滑动。
[0005] 1986年Spudich实验室首次建立体外模拟滑动体系，测试肌球蛋白与肌动蛋白相 互滑动产生的力。在1994年Finer等人成功地用双光钳进行单分子运动测试，这样就可以 在单分子水平上进行肌丝滑动研究以及测试其产生力量的大小，从而对肌球蛋白进行更深 入的研究。2005年，EI-Mounayri等比较了不善运动的人、经常参加运动的人和优秀的越野 滑雪选手股外肌单根肌纤维MHC组成，研究发现，与经常参加运动和优秀的越野选手相比， 不善运动人的肌纤维以I型和II a型MHC为主，另外还含有比例相对较高的（约20 % ) II b 型MHC和II a/ II b共存型MHC ;经常参加运动的人股外肌含有I型MHC的纤维明显增加， 含有II b以及II a/ II b共存型MHC的纤维明显减少。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明实施例提供一种编码双峰驼肌球蛋白的核苷酸序列，即提供双 峰驼中双峰驼肌球蛋白基因的cDNA序列，以及由该序列编码的双峰驼肌球蛋白。
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明采用了如下技术方案：
[0008] -方面，本发明实施例提供了一种编码双峰驼肌球蛋白的核苷酸序列，
[0009] 所述核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO: 1第21-5939位。
[0010] 或者，所述核苷酸序列为在高严谨条件下与序列表中SEQ ID NO: 1第21-5939位 的核苷酸序列杂交且编码双峰驼肌球蛋白。
[0011] 或者，所述核苷酸序列与序列表中SEQ ID NO: 1第21-5939位的核苷酸序列具有 90 %以上同源性且编码双峰驼肌球蛋白。
[0012] 另一方面，本发明实施例还提供一种双峰驼肌球蛋白，由如上所述核苷酸序列编 码。
[0013] 优选的双峰驼肌球蛋白由序列表中SEQ ID N0:2所示的氨基酸组成。
[0014] 或者，双峰驼肌球蛋白为序列表中SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列经过一个或几 个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加获得的衍生蛋白质。
[0015] 另一方面，本发明实施例还提供一种重组表达载体，包含如上所述核苷酸序列，或 编码如上所述蛋白质。
[0016] 另一方面，本发明实施例还提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如上所述的重 组表达载体。
[0017] 另一方面，本发明实施例还提供一种获取编码双峰驼肌球蛋白的核苷酸序列的方 法，其特征在于：
[0018] PCR的正向引物为：
[0019] SEQ ID N0:3:5, -ATGGGCAAGC TGCTCCAGCA GC-3,；
[0020] 反向引物为：
[0021] SEQ ID N0:4:5' -CTGGCTGCTG GAGCAGCTTG CC-3'。
[0022] 与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0023] 有"沙漠之舟"之称的骆驼由于沙漠地面极为松软，限制了骆驼的狂奔疾驰，而沙 漠食物的匮乏以及水源的奇缺，又使骆驼不得不具有较快的行走速度和持久的耐力。长期 自然选择的结果，使骆驼的体形结构又比其他动物特殊，其颈部较长，呈"乙"字形，有利于 保持身体平衡；体躯较短，前腿长，支持面小而重心高，便于躯体的前移和迈出较大的步伐； 后肢短而呈刀状，具有较强的推动力和耐久力。
[0024] 由于骆驼同其他动物相比有持久的耐力，可以适应沙漠中食物的匮乏及水源的奇 缺，肌球蛋白是肌肉运动中非常重要的一种蛋白，所以研究骆驼的肌球蛋白有非常重要的 意义。本发明参考了其他八种动物的肌球蛋白基因序列，克隆并测序得到了双峰驼肌球蛋 白基因的cDNA序列，并对八种物种基因的CDS序列进行同源性比较并作进化树，为今后研 究双峰驼肌球蛋白提供基础资料。
[0025] 本发明研究双峰驼的肌球蛋白序列及进化树可以直观的表现出双峰驼肌球蛋白 序列与其他物种此蛋白序列的差异，为以后研究双峰驼及其他物种中的耐力研究提供实验 数据，对研究双峰驼及其他物种以及人类的耐力运动提供一定的理论依据促进运动生理学 的发展。因此本发明具有很大的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 图1为实施例1中双峰驼的肌球蛋白基因 RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；
[0027] 图2a、2b、2c、2d、2e为构建系统发生树所用肌球蛋白氨基酸同源性比较；
[0028] 图3为不同物种肌球蛋白氨基酸序列系统进化树。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定。
[0030] 以下实施例中，所用百分比浓度如未特定指明，均为体积百分比浓度。
[0031 ] 实施例1 :双峰驼肌球蛋白基因 cDNA序列的克隆
[0032] 1、组织分离（Isolation)
[0033] 从内蒙古阿拉善盟采得双峰驼，快速屠宰并取肝脏样，将组织样迅速放入液氮中 冷冻后于_70°C保存，拿回实验室准备提取组织总RNA。
[0034] 2、总 RNA 的分离（Total RNA isolation)
[0035] (1)提取RNA的准备工作
[0036] 玻璃制品用0. 1M的NaOH浸泡过夜，用自来水反复冲洗，再用蒸馏水冲洗2遍， 180°C烘烤4小时。
[0037] 匀浆器、电泳槽用3%的双氧水浸泡20-30分钟，再用0. 1%的DEPC(焦碳酸二乙 酯）水冲洗，由于未灭活的DEPC对PCR反应有影响，可用0. 5 %的SDS (十二烷基硫酸钠） 处理。
[0038] Tip头、EP管用0. 1 %的DEPC水浸泡过夜，高压灭菌使DEPC失活。
[0039] 双蒸水和溶液用DEPC处理，即每100ml水或溶液加0. lmlDEPC液，室温放置过夜， 高压灭菌30分钟DEPC失活。
[0040] (2)组织总RNA提取
[0041] 取 100mg在液氮中冻存的组织样放入有 lml Trizol (trizal reagent, invitrogen BRL，USA)的匀浆器管中匀浆。4°C 12000g离心10分钟，吸取上清液，15-30°C温育5分钟， 加0. 2ml氯仿，盖上盖子，用手剧烈震荡15秒，15-30°C温育2-3分钟，4°C 12000g离心15 分钟。吸取上清液，加0.8ml异丙醇，混合均匀。15-30°C温育10分钟，4°C 12000g离心10 分钟，离心管底部白色沉淀即为RNA。倒掉上清，加 lml 75v/v%乙醇洗涤RNA，4°C 7500g 离心10分钟，自然干燥或真空干燥RNA。溶于水（RNase free)中分装，-70°C保存。
[0042] (3)组织总RNA的鉴定
[0043] 通过分光光度计上测定RNA含量并且用琼脂糖电泳分析RNA的质量，具体方法如 下：电泳槽用RNA清洗液（100mM NaOH，ImMEDTA)浸泡4 一 5小时，再用DEPC处理过的水反 复冲洗数次后倒入1 X TBE待用，琼脂糖凝胶用1 X TBE配制。在10ul上样缓冲液（2 X TBE， 13%菲可，0. 1%溴酚兰，7M尿素）中加入lul以上组织总RNA，65°C变性10分钟后立即放 入冰水中2 - 3分钟，点样于琼脂糖凝胶中电泳。
[0044] 3.全长 cDNA 的克隆（Cloning of Full-length cDNA)
[0045] (1)引物设计及合成
[0046] 根据 GenBanK 发表的人（Accession No:CAD91136. 1)、鼠 （Accession N〇:EDL10431.1)、牛（Accession N〇:NP_001179691.1)等物种的肌球蛋白基因 mRNA序列 0RF侧翼同源序列，设计如下引物用于PCR扩增，以获得双峰驼肌球蛋白基因 cDNA序列。引 物用Primer Premier 5.0自行设计，由上海桑尼生物科技有限公司合成，该引物对的核苷 酸序列分别为SEQ ID N0:3(正向）和SEQ ID N0:4(反向），序列信息如下：
[0047] SEQ ID N0:3(正向）：5, -ATGGGCAAGCTGCTCCAGCAGC-3，
[0048] SEQ ID N0:4(反向）：5, -CTGGCTGCTGGAGCAGCTTGCC-3，
[0049] (2) RT-PCR 扩增
[0050] 按大连宝生物反转录试剂盒（BcaBEST RNA PCR Kit Ver. 1. 1)要求进行反转录。 反转录反应液组成：l〇ul 2XBca 1st Buffer，4ul 25Mm MgS04，lul dNTP Mixture，0.5ul Rnase Inhibitor(40U/ul),lul BcaBEST Polymerase(22U/ul),lul Oligo dT Primer,lul RNA Sample，1.5ul Rnase Free dH20,总体系为 20ul。反转录反应条件：65°C1 分钟，30°C5 分钟（15分钟-30分钟内匀速升温），65°C 25分钟，98°C 5分钟，5°C 5分钟。PCR扩增条件： 97°C变性5分钟；95°C 30秒一55°C 30秒一72°C 1分钟，如此进行30次循环；72°C延伸10 分钟，4 °C保存。
[0051] (3)克隆和测序
[0052] PCR扩增片段的回收。片段回收按上海华舜小量胶回收试剂盒说明进行，操作过 程如下：尽可能小的割下含DNA的琼脂糖块，放入1. 5mlEP管中。按每100mg琼脂糖加入 300ulSl液的比例加 S1液，50°C水浴10分钟。将溶化的琼脂糖液移入吸附柱，10000g离心 1分钟，倒掉管中液体。在吸附柱中加入500ul W1液，10000g离心15秒。倒掉管中液体， 在吸附柱中加入500ul W1液，静置1分钟后，10000g离心15秒，倒掉管中液体。离心1分 钟，将吸附柱放入一个干净的1. 5mlEP管中，在吸附膜中央加入30ulTl液，静置1分钟后， 10000g离心1分钟，EP管中液体即为回收的DNA。
[0053] 回收片段同T载体的连接。连接用TaKaRa pMD18-T Vector试剂盒，操作过程 如下：在 EP 管中制备下列连接反应液：pMD 18-T Vector(50ng/ul)0.5ul，DNA 20-40ng， Solution 15ul，加 dH20至10ul。将上述反应液在16°C反应30分钟（过夜也可以），产物 用于转化感受态细胞。
[0054] 质粒的转化。从一70°C冰箱中取出保存的感受态细胞，冰浴助溶。100ul感受态 细胞加入l〇ul连接产物，冰浴30分钟。42°C水浴热应激90秒钟，立即置入冰浴中2分钟。 加400ul液体LB培养基，37°C复活50分钟。取100ul铺于LB平板上，平板含0. 1 % (V/V) 的氨节青霉Amp (100mg/ml)，37°C恒温培养10-15小时。
[0055] 转化菌落的PCR鉴定与培养。用记号笔标记转化培养的单菌落，用灭菌的牙签蘸 取单菌落。将牙签头放入在加有PCR反应液（不含模板）的EP管中晃动，使单菌落充当模 板。用获得该片段的PCR条件进行扩增，PCR产物同Marker-起进行琼脂糖凝胶电泳（结 果如附图1所示），鉴别T载体上是否含有目的片段，若得到目的片段，可用灭菌枪头挑取在 平板上的与之对应的单菌落，放入40ml LB液体培养基中，先在液体中加入0.1% (V/V)的 青霉素钠（l〇〇mg/ml)，37°C过夜摇菌培养，用于质粒回收。
[0056] 质粒的回收。质粒回收用上海华舜小量质粒抽提纯化试剂盒，操作步骤如下：将转 化培养的菌液加入1. 5mlEP管中，4000转/分钟离心，倒掉液体获细菌沉淀。细菌沉淀不 够时可再加一次菌液离心。在细菌沉淀中加入250ulPl液，振荡悬浮。加入250ulP2液，温 和摇匀，室温静置4分钟。加入350ulP3液，温和摇匀。离心10分钟，将上清液小心移入吸 附柱，离心15秒，倒掉液体。在吸附柱中加入500ulWl，离心15秒，倒掉液体。在吸附柱中 加入500ulWl，静置1分钟，离心15秒，倒掉液体。离心1分钟，将吸附柱放入一个干净的 1. 5mlEP管中，在吸附膜中央加入25-30ulTl液，静置1分钟后，离心1分钟，EP管中液体即 为回收的质粒。
[0057] 质粒的酶切鉴定。为了证明回收质粒确为插入目的片段的重组质粒，采用双酶 切法鉴定。本研究具体操作如下：根据TaKaRa pMD18-TVector图，选择内切酶Bam Η I和 Hin d III，保证目的片段中无这两种酶的切点。组成如下酶切反应体系：Bam Η I lul，Hin d III lul，10XKBuffer 2ul，DNA 彡 lul，加 dH20 至 20ul。30°C反应 3 小时，琼脂糖凝胶电 泳检测。
[0058] 重组质粒的测序。取20ul重组质粒于EP管中，封口膜密封，交生物技术公司测序。
[0059] 实施例2 :双峰驼肌球蛋白基因编码序列同源性比较和系统发生树构建
[0060] 1、双峰驼肌球蛋白的序列信息与生物信息学分析
[0061] 本发明双峰驼肌球蛋白⑶S的长度为5953bp，其中21-23位为起始密码子ATG， 5937-5939位为终止密码子TGA，21-5939位为编码蛋白质区域（CDS),详细序列见SEQ ID NO: 1。根据全长CDS推导出双峰驼肌球蛋白的氨基酸序列，共1972个氨基酸残基，详见SEQ ID N0:2,在线预测（ http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html)结果显示，其分子量为 227223. 04道尔顿，等电点（pi)为5. 63。
[0062] 2、肌球蛋白基因编码序列系统发生树构建
[0063] 在GenBank上搜索并获得人、鼠等八种物种的八条肌球蛋白基因的编码蛋白序 列，加上本发明获得的SEQ ID N0. 2序列，利用分子生物学软件MEGA4构建了系统发生树 (见附图3)。结果显示：双峰驼肌球蛋白基因同牛、人的亲缘关系最近。与大熊猫的亲缘关 系最远。
[0064] 双峰驼和人、鼠、牛等动物用Clustal X中对齐的肌球蛋白基因编码氨基酸序列同 源性比较结果见附图2a_2e。不同物种肌球蛋白的氨基酸序列相似性见表1，各物种肌球蛋 白氨基酸的个数及分子量见表2,各物种肌球蛋白氨基酸的比例（％)见表3。
[0065] 表1 :不同物种肌球蛋白的氨基酸序列相似性
[0066]
【权利要求】
1. 一种编码双峰驼肌球蛋白的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列是序列表中 SEQ ID NO: 1 第 21-5939 位。
2. -种编码双峰驼肌球蛋白的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列在高严谨条 件下与权利要求1所述的核苷酸序列杂交且编码双峰驼肌球蛋白。
3. -种编码双峰驼肌球蛋白的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列与权利要求 1所述的核苷酸序列具有90%以上同源性且编码双峰驼肌球蛋白。
4. 一种双峰驼肌球蛋白，由权利要求1-3任一项所述核苷酸序列编码。
5. 根据权利要求4所述的双峰驼肌球蛋白，其特征在于，由序列表中SEQ ID N0:2所示 的氨基酸组成。
6. -种双峰驼肌球蛋白，其特征在于，为序列表中SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列经过 一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加获得的衍生蛋白质。
7. -种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求1-3任一项所述核苷酸序列，或编码 权利要求4-6任一项所述蛋白质。
8. -种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求7所述的重组表达载体。
9. 获取编码双峰驼肌球蛋白的核苷酸序列的方法，其特征在于： PCR的正向引物为： SEQ ID N0:3:5' -ATGGGCAAGC TGCTCCAGCA GC-3' ； 反向引物为： SEQ ID N0:4:5' -CTGGCTGCTG GAGCAGCTTG CC-3'。
【文档编号】C12N15/63GK104152459SQ201410410613
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月19日 优先权日:2014年8月19日
【发明者】陈钢粮 申请人:新疆旺源驼奶实业有限公司