Ace2多肽的制作方法
【专利摘要】本发明涉及重组ACE2多肽，其中所述ACE2多肽以二聚体存在。所述二聚体特别地由糖基化的单体形成并且被用于制备具有延长的半衰期的药学产品。
【专利说明】ACE2多肽
[0001] 本分案申请是基于申请号为200880100650. 6(国际申请号为PCT/ AT2008/000211)，申请日为2008年6月12日，发明名称为"ACE2多肽"的原始中国专利申 请的分案申请。
[0002] 本发明涉及重组蛋白质生产的领域。
[0003] 血管紧张素转化酶（ACE2)是肾素-血管紧张素系统的关键酶。它作为羧肽酶锚固 于膜上，作为受体主要在肺细胞、肾细胞和心脏细胞以及内皮细胞上表达并裂解各种肽底 物。知名的代表底物是血管紧张素-II(Ang II)，其被裂解为血管紧张素l-7(Angl-7);血 管紧张素-1，其被裂解为血管紧张素1-9 ;同样地，还有apelin和缓激肽。Ang II和Angl-7 是肾素_血管紧张素系统的拮抗剂。ACE2通过控制肽比例而决定性地负责血管厚度的调整 以及内皮细胞的通透性并因此影响有机体的内环境稳定。ACE2的表达尤其受细胞因子调节 并且在各种炎症中降低，这继而导致Ang II (ACE2最重要的底物之一）的病理性增加。
[0004] ACE2用于治疗急性肺病的两种形式ARDS或ALI，随这两种病在肺中出现下调的 ACE2表达。对于该种治疗使用重组的可溶性人ACE2,其被全身性给予从而在最短的时间内 供整个有机体使用，以便降低增加的Ang II浓度并与此同时产生Angl-7。这补偿了增加的 Ang II浓度的负性作用。为此，很希望拥有一种产物，其具有合适的药学特征：相应地，其具 有在有机体内良好的分布、药学上有意义的半衰期以及具有低免疫原性的适宜的物质。特 别是该产物必须是有酶活性的、可良好溶解的以及在溶液中稳定的，并且可以以高纯度可 重复地和经济地进行制备。
[0005] Tipnis 等人（J Biol Chem. 275(43) (2000) : 33238-43)描述了 ACE2(在此文中还 被称为ACEH)的分离和其cDNA的分离。通过在CH0细胞中进行生产获得了具有120kDa摩 尔质量的糖基化的蛋白质单体。去糖基化后该蛋白质具有85kDa的质量。
[0006] Donoghue(Circ Res. 87(5) (2000) :1-9)描述了可溶性ACE2在CH0细胞中的表达， 它没有完全被糖基化，并且表征为约90kDa的摩尔质量。此外，该文献还涉及各种ACE2序 列的序列对比和抗ACE2抗体。
[0007] W0 2004/023270 A2涉及ACE2单体在昆虫细胞Sf9中表达后ACE2的结晶。在此 情况下，该蛋白质的摩尔质量在质谱分析后给出89. 6kDa。
[0008] 有效的酶替代疗法的治疗型转变需要这样的制备方法，其经济地和可重复地制备 高纯度的药学上有效的产物。ACE2的可溶的、细胞外截段包含7个N-糖基化位点。非糖基 化的ACE2是不溶的，倾向于聚集，是增强的免疫原并且具有缩短的半衰期。此外，它具有小 的流体力学直径，其主要地不会负面地影响纯化。因此，本发明的目的是提供具有好的体内 半衰期的高活性ACE2。该目的通过权利要求的具体内容来实现。
[0009] 本发明涉及重组ACE2多肽，其以二聚体存在。优选的是糖基化的重组ACE2多肽， 其中ACE2多肽单体的糖基基团具有总计至少10、11、12、13、14、15或至少16个唾液酸残 基，优选14个唾液酸残基，并且其中ACE2多肽以二聚体存在。同样地，本发明包含具有本 文所述的糖基化的、摩尔加权平均的和进一步详细说明的ACE2单体。优选所述二聚体是同 二聚体，其单体单位特别地具有相同的序列和糖基化。通常，所述单体单位是非共价结合的 二聚体。单体可以通过变性步骤毫无困难地从二聚体获得。优选所有本文所述的糖基化不 但涉及二聚体而且也涉及单体，包括二聚体复合物的一个或两个单体。特别优选所述二聚 体包含两个锌离子。
[0010] "唾液酸残基"，特别地理解为N-乙酰神经氨酸类型（Neu5Ac)的残基，特别是在 N-或0-糖基化。
[0011] 原则上，对于其半衰期从而其效应而言，治疗剂的稳定性是非常重要的标准。
[0012] 迄今为止，重组人ACE2仅鉴定为单体，并且在关于其功能、其晶体结构以及关于 其与高特异性抑制剂相互作用的文献中也被描述为如此。
[0013] 因此，例如在参考 Vickers 等人（J Biol Chem277 (17)，2002:14838-14843)的情 况下，Towler 等人（J Biol Chem279 (17) ,2004:17996-18007)描述了 ACE2 在昆虫细胞 Sf9 中的表达，其在作为最后纯化步骤的小心的大小排阻色谱法之后以单体获得。单体的摩尔 质量为89. 6kDa。
[0014] 商购可得的ACE2同样以单体形式存在（来自R&D Systems,编录号933-ZN，批号 FIU035071)，其根据Tipnis等人（2000,同上）中的所述方法而制备，所不同的是，使用NS0 代替CH0细胞作为表达系统。它被描述为单体，其不但在还原条件下而且在非还原条件下 具有120kDa的摩尔重量。
[0015] 根据 Donoghue 等人（Circ Res87, 2000: el-e9)，ACE2 单体在 CH0 细胞中表达，其 分泌后显示90kDa的分子量。
[0016] 所有本文列出的文献和出版物通过引用而合并入本文。
[0017] 根据本发明，为了使根据本发明的治疗剂稳定，发展了一种方法，其仅导致稳定的 ACE2二聚体，所述二聚体相比于ACE2单体不但具有生产技术上的而且具有药学上的优点。
[0018] 所述二聚体化带来下列的优点：
[0019] ?在生理溶液中更好的溶解度和生物利用率：该二聚体显示高的溶解度和更长的 体内半衰期和利用率。
[0020] ?无聚集体形成：该ACE2二聚体了形成稳定的复合物，而不会附加更多的ACE2分 子以形成二聚体。
[0021] ?减少的蛋白酶攻击：因为单次蛋白质切割后，在此所有的可能性都表明C-末端 部分在二聚体内部，该C-末端不被降解。
[0022] ?增加的半衰期：由于低免疫原性、更好的溶解度和降低的对蛋白水解的易感性， 所述蛋白质的半衰期增加了。
[0023] ?简单的蛋白质纯化:ACE2二聚体的流体力学直径基于其结构和大于计算直径的 突出的溶剂化外壳。因此，ACE2二聚体能够通过大小分离柱从来自蛋白质表达的常规杂质， 例如血清白蛋白（67kDa)中出色地被分离。
[0024] 优选重组ACE2多肽在可能的N-糖基化位置的至少80%处被糖基化并且具有大 于 10% (总 ACE2 的质量％ )或 11 %、12%、13%、14%，优选大于 15%或 16%、17%、18%、 19%，特别地大于20%或21%、22%、23%、24%或25%的糖部分。
[0025]发展了 一种制备方法，其可重复地制备高纯度的且有酶活性的、高度复杂的糖基 化ACE2。该产物表征为其高的糖部分（>20质量％ )和复杂的、高度支化的、部分带负电荷 的糖结构。这对产物的溶解度、生物利用率、酶活性以及药学性质产生积极作用。通过选择 合适的表达构建体、合适的表达宿主、优化的筛选策略，通过针对细胞代谢经调整的培养基 以及通过细致的伴随克隆分析和筛选，可以制备分泌所希望产物的细胞系。
[0026] ACE2已经在昆虫细胞Sf9和小鼠细胞NS0中进行了表达。该物质主要在体外试验 中使用。ACE2在CH0细胞中的瞬时表达也有结果。至今还没有产生具有方法适宜的生产率 的细胞系。此外，还没有进行关于产物性质（特别是关于N-糖基化）的相应的克隆筛选。
[0027] 蛋白质的溶解度不仅由其氨基酸序列而且由其折叠以及由翻译后修饰所决定。主 要是所负载的糖结构，其决定性地增加蛋白质的溶解度并影响其药学特征。因此，就EP0而 言，可以表明，复杂的支化糖结构的存在积极影响这些蛋白质的半衰期。
[0028] 原则上，为了进行ACE2的重组表达，考虑各种表达系统，其中基于缺失的N-糖基 化位点加工（Prozessierung)的原核生物宿主细胞不再进行测试。
[0029] 优选至少70 %的糖基化的N-糖基化位点具有选自式1-8的相互独立的结构：
【权利要求】
1. 重组ACE2多肽，其以二聚体存在。
2. 根据权利要求1的重组ACE2多肽，其特征在于，它被糖基化，其中ACE2多肽单体的 糖基基团具有总共至少14个唾液酸残基。
3. 根据权利要求2的重组ACE2多肽，其特征在于，可能的N-糖基化位点的至少80 % 被糖基化并且具有大于10 % (质量％，相对于整个ACE2分子），优选大于15 %，特别地大于 20 %的糖部分。
4. 根据权利要求1、2或3的重组ACE2多肽，其特征在于，糖基化的N-糖基化位点的至 少70%相互独立地选自式1-8的结构：
5. 根据权利要求1至4之一的重组ACE2多肽，其特征在于，所有可能的N-糖基化位点 是都被糖基化的。
6. 根据权利要求1至5之一的重组ACE2多肽，其特征在于，至少80 %，优选至少90 %， 特别地100 %的糖基化的N-糖基化位点具有式1-8的结构。
7. 根据权利要求1至6之一的重组ACE2多肽，其特征在于，所述二聚体的ACE2单体单 位具有至少90kDa，优选至少92kDa，尤其优选至少94kDa，特别是至少96kDa，特别优选至少 98kDa，最优选至少IOlkDa的分子量。
8. 根据权利要求1至7之一的重组ACE2多肽，其特征在于，所述ACE2多肽不具有跨膜 结构域，优选ACE2多肽链由SEQIDNO: 1的氨基酸18-740或其酶活性片段组成。
9. 根据权利要求1至8之一的重组ACE2多肽，其特征在于，与SEQIDNO: 1的Ser740 相应的丝氨酸是O-糖基化的。
10. 根据权利要求1至9之一的重组ACE2多肽，其特征在于，至少70 %，优选地至少 80 %，特别是至少90 %，最优选100 %的糖基化的N-糖基化位点具有唾液酸，优选与SEQID NO: 1 的Asn53、Asn90、Asnl03、Asn322、Asn432、Asn546、Asn690 对应的N-糖基化位点被唾 液酸化。
11. 根据权利要求1至10之一的重组ACE2多肽，其特征在于，至少30%，优选至少 40%，特别是至少55%，最优选至少70%的糖基化的N-糖基化位点具有两个唾液酸。
12. 根据权利要求1至11之一的重组ACE2多肽，其特征在于，与SEQIDN0:1的Asn53 相应的天门冬酰胺被N-糖基化，优选地具有如在权利要求4中定义的根据式1、2、3、4、5、6、 7或8的结构的聚糖。
13. 根据权利要求1至12之一的重组ACE2多肽，其特征在于，与SEQIDN0:1的Asn90 相应的天门冬酰胺被N-糖基化，优选地具有如在权利要求4中定义的根据式1、2、3、4、5、6、 7或8的结构的聚糖。
14. 根据权利要求1至13之一的重组ACE2多肽，其特征在于，与SEQIDN0:1的Asnl03 相应的天门冬酰胺被N-糖基化，优选地具有如在权利要求4中定义的根据式1、2、3、4、5、6、 7或8的结构的聚糖。
15. 根据权利要求1至14之一的重组ACE2多肽，其特征在于，与SEQIDN0:1的Asn322 相应的天门冬酰胺被N-糖基化，优选地具有如在权利要求4中定义的根据式1、2、3、4、5、6、 7或8的结构的聚糖。
16. 根据权利要求1至15之一的重组ACE2多肽，其特征在于，与SEQIDN0:1的Asn432 相应的天门冬酰胺被N-糖基化，优选地具有如在权利要求4中定义的根据式1、2、3、4、5、6、 7或8的结构的聚糖。
17. 根据权利要求1至16之一的重组ACE2多肽，其特征在于，与SEQIDN0:1的Asn546 相应的天门冬酰胺被N-糖基化，优选地具有如在权利要求4中定义的根据式1、2、3、4、5、6、 7或8的结构的聚糖。
18. 根据权利要求1至17之一的重组ACE2多肽，其特征在于，与SEQIDN0:1的Asn690 相应的天门冬酰胺被N-糖基化，优选地具有如在权利要求4中定义的根据式1、2、3、4、5、6、 7或8的结构的聚糖。
19. 重组ACE2多肽的制剂，其包含至少根据权利要求1至18之一的多肽，其特征在于， 具有通过凝胶电泳所测得的低于IOOkDa,优选低于104kDa，特别优选低于108kDa，特别是 低于112kDa，尤其优选低于117kDa，最优选低于119kDa的分子量的所述ACE2多肽部分以 低于20 %，优选低于10 %，尤其优选低于5 %，最优选低于1 %，特别是0 %存在。
20. 根据权利要求19的制剂，其特征在于，具有跨膜结构域的ACE2多肽部分以低于 20%，优选低于10%，尤其优选低于5%，最优选低于1%，特别是0%存在。
21. 根据权利要求19或20的制剂，其特征在于，ACE2的多聚体部分以低于20%，优选 低于10%，尤其优选低于5%，最优选低于1%，特别是0%存在。
22. 根据权利要求19至21之一的制剂，其特征在于，ACE2分子的ACE2二聚体部分为 至少70 %，优选至少80 %，尤其优选至少90 %，特别优选至少95 %，最优选至少99 %。
23. 根据权利要求19至22之一的制剂，其特征在于，具有相应于SEQIDNO: 1的Asn53 的N-糖基化天门冬酰胺的ACE2多肽部分大于60 %，优选大于70 %，尤其优选大于80 %，特 别优选大于90%，最优选大于99%，特别为100%，并优选地具有如在权利要求4中定义的 根据式1、2、3、4、5、6、7或8的结构的聚糖。
24. 根据权利要求19至23之一的制剂，其特征在于，具有相应于SEQIDNO: 1的Asn90 的N-糖基化天门冬酰胺的ACE2多肽部分大于60 %，优选大于70 %，尤其优选大于80 %，特 别优选大于90%，最优地大于99%，特别是100%，并优选地具有如在权利要求4中定义的 根据式1、2、3、4、5、6、7或8的结构的聚糖。
25. 根据权利要求19至24之一的制剂，其特征在于，具有相应于SEQIDNO: 1的 Asnl03的N-糖基化天门冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，优选大于70%，尤其优选大于 80 %，特别优选大于90 %，最优选大于99 %，特别是100 %，并优选地具有如在权利要求4中 定义的根据式1、2、3、4、5、6、7或8的结构的聚糖。
26. 根据权利要求19至25之一的制剂，其特征在于，具有相应于SEQIDNO: 1的 Asn322的N-糖基化天门冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，优选大于70%，尤其优选大于 80 %，特别优选大于90 %，最优选大于99 %，特别是100 %，并优选地具有如在权利要求4中 定义的根据式1、2、3、4、5、6、7或8的结构的聚糖。
27. 根据权利要求19至26之一的制剂，其特征在于，具有相应于SEQIDNO: 1的 Asn432的N-糖基化天门冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，优选大于70%，尤其优选大于 80 %，特别优选大于90 %，最优选大于99 %，特别是100 %，并优选地具有如在权利要求4中 定义的根据式1、2、3、4、5、6、7或8的结构的聚糖。
28. 根据权利要求19至27之一的制剂，其特征在于，具有相应于SEQIDNO: 1的 Asn546的N-糖基化天门冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，优选大于70%，尤其优选大于 80 %，特别优选大于90 %，最优选大于99 %，特别是100 %，并优选地具有如在权利要求4中 定义的根据式1、2、3、4、5、6、7或8的结构的聚糖。
29. 根据权利要求19至28之一的制剂，其特征在于，具有相应于SEQIDNO: 1的 Asn690的N-糖基化天门冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，优选大于70%，尤其优选大于 80 %，特别优选大于90 %，最优选大于99 %，特别是100 %，并优选地具有如在权利要求4中 定义的根据式1、2、3、4、5、6、7或8的结构的聚糖。
30. 根据权利要求19至29之一的制剂，其特征在于，具有相应于SEQIDNO: 1的 Ser740的0-糖基化丝氨酸的ACE2多肽部分大于60 %，优选大于70 %，尤其优选大于80 %， 特别优选大于90 %，最优选大于99 %，特别是100 %。
31. 根据权利要求1至30之一的ACE2多肽或制剂，其具有基于从AngII(血管紧张素 II)至Angl-7(血管紧张素1-7)的转化的至少4/s，优选至少5/s，尤其优选至少6/s，特别 优选至少7/s，最优选至少7. 6/s的催化活性。
32. 用于制备优选地根据权利要求1至31之一的重组ACE2多肽或重组ACE2的制剂的 方法，其包含这样的步骤：将编码ACE2的多核苷酸，优选地没有跨膜结构域的编码ACE2的 多核苷酸引入真核细胞中；表达ACE2多肽并收集经表达的ACE2,尤其是二聚体形式的，其 中其中表达时优选Zn2+浓度至少为1. 5微摩尔。
33. 根据权利要求32的方法，其特征在于，所述编码ACE2的多核苷酸设计在载体上。
34. 根据权利要求32或33的方法，其特征在于，所述ACE2表达用标记、优选DHFR进行 筛选。
35. 根据权利要求34的方法，其特征在于，所述标记存在于载体上。
36. 根据权利要求35的方法，其特征在于，所述载体具有用于所表达的ACE2mRNA的 IRES0
37. 根据权利要求32至36之一的方法，其特征在于，所述真核细胞是CHO细胞。
38. 重组ACE2多肽或重组ACE2多肽的制剂，其通过前述权利要求的方法而获得。
39. 稳定地用编码ACE2的多核苷酸转染的真核细胞系，优选CHO细胞系，表达根据权利 要求1至31之一的ACE2。
40. 根据权利要求39的细胞，其具有至少IOpg/细胞/天，优选至少15pg/细胞/天， 尤其优选至少20pg/细胞/天的ACE2生产率。
41. 药物，其包含根据权利要求1至18之一、31或38的重组ACE2多肽或根据权利要 求19至31之一或38的制剂。
【文档编号】C12N15/85GK104450654SQ201410412672
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2008年6月12日 优先权日:2007年6月12日
【发明者】M·舒斯特, H·洛博内, E·扬奇克-哈瓦拉特, B·佩巴尔, S·斯兰内, B·瓦格内, R·维克 申请人:阿派隆生物制剂股份公司