一种快速检测常见缺失型α-地中海贫血的试剂盒及其使用方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速检测常见缺失型α-地中海贫血的试剂盒及其使用方法。所述试剂盒包括：一对可以同时扩增α-珠蛋白基因簇中Y1区段的特征序列y1和Y2区段的特征序列y2的引物，一对扩增α-珠蛋白基因簇中--SEA基因型的引物，一对扩增α-珠蛋白基因簇中α2基因的引物、一条特异性检测Y1区段的特征序列y1的荧光探针、一条特异性检测Y2区段的特征序列y2的荧光探针、一条特异性检测--SEA基因型扩增产物的荧光探针和一条特异性检测α2基因扩增产物的荧光探针。本发明所述试剂盒对α-地中海贫血珠蛋白基因缺失检测具有高度的灵敏性、稳定性、准确性以及较高的特异性。
【专利说明】-种快速检测常见缺失型α-地中海贫血的试剂盒及其使 用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学检测【技术领域】，具体涉及一种快速检测常见缺失型α -地中海贫 血的试剂盒及其使用方法。
【背景技术】
[0002] 地中海贫血（Mediterranean Anemia)，也称海洋性贫血（Thalassemia)、库勒 (Cooley)贫血、珠蛋白合成障碍性贫血，简称地贫。地中海贫血是最常见的单基因遗传疾 病之一，常见的地贫种类有α-地贫和β-地贫，分别由α-蛋白基因簇和β-珠蛋白基 因簇异常表达引起。在我国，广西、广东和海南是地中海贫血的高发省份，其中广西α-地 贫的发病率是15. 5%。中国人群中，缺失型α -地贫的基因型常见基因型为一SEA、-α 3 7 和-α4 2。目前检测缺失型地中海贫血的主要方法有Gap-PCR、高分辨溶解曲线（HRM， High-Resolution Melting) > MLPA(Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification Assay)、Southern blot分析法等。以上方法单独应用在地中海贫血基因型检测中各有优 缺点。
[0003] 同源基因定量技术是一种根据基因的同源性，采用共同的扩增引物对同源基因进 行扩增，最后采用荧光标记法或者探针法对基因的含量进行相对定量的方法。α -珠蛋白 基因簇（NG_000006. 1)由调控因子（HS-40)，α基因 （α 1和α 2)，ζ基因 （ζ 2)，假基因 (Ψ ζ 1，Ψ a 2andW α 1)和Θ组成，其排列顺序为：批40-42-屯41-屯〇2-屯〇1-α2-α1- Θ。〇-地中海贫血基因据其同源性，可划分为)(1，乂2，￥1，￥2,21和22区间，其 中-α 3_7 (也称为右侧缺失）的形成源于Ζ1和Ζ2之间的同源重组，而-α 4_2 (也称为左侧缺 失）则来源于XI和Χ2之间的同源重组，如图1所示，图1中，Υ1和Υ2同源。目前尚未见 有由同时扩增Υ1和Υ2的扩增引物构成的结合Taqman技术的快速检测常见缺失型α -地 中海贫血的试剂盒的相关报道。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种基于同源基因定量技术的快速检测常见缺 失型α-地中海贫血的试剂盒及其使用方法。采用该试剂盒可以相对定量检测α-珠蛋白 基因簇中α 1和α 2功能基因的拷贝数及拷贝数的变化。
[0005] 本发明所述的快速检测常见缺失型α -地中海贫血的试剂盒，包括扩增引物和荧 光探针，所述的扩增引物为：一对可以同时扩增α-珠蛋白基因簇中Υ1区段的特征序列 yl和Υ2区段的特征序列y2的引物Y1Y2-F和Y1Y2-R，一对扩增α -珠蛋白基因簇中一SEA 基因型的Gap-PCR引物SEA-F和SEA-R，以及一对扩增α -珠蛋白基因簇中α 2基因的引 物A2-F和A2-R ;所述的荧光探针为：一条特异性检测Υ1区段的特征序列yl的荧光探针 Yl-Prob，一条特异性检测Y2区段的特征序列y2的荧光探针Y2-Prob，一条特异性检测一SEA 基因型扩增产物的荧光探针SEA-Prob，以及一条特异性检测α 2基因扩增产物的荧光探针 A2-Prob ；
[0006] 其中：
[0007] 所述的可以同时扩增α -珠蛋白基因簇中Y1区段的特征序列yl和Y2区段的特 征序列y2的引物对中，
[0008] Y1Y2-F:5,-TGCACCCACTGGCACTC-3,；
[0009] Y1Y2-R:5,-AGGAAGGAAGGGGTGGACT-3,；
[0010] 所述的扩增α -珠蛋白基因簇中一SEA基因型的Gap-PCR引物对中，
[0011] SEA-F: 5，-AGAAGCTGAGTGATGGGTCC-3，；
[0012] SEA-R: 5 ' -TGGACTTAAGTGATCCTCCTGC-3 ' ；
[0013] 所述的扩增α -珠蛋白基因簇中α 2基因的引物对中，
[0014] A2-F: 5 ' -TCCTGGCTTCTGTGAGCAC-3 ' ；
[0015] A2-R: 5 ' -GCAGAGAGGTCCTTGGTCTG-3 ' ；
[0016] 所述的特异性检测Υ1区段的特征序列yl的荧光探针Yl-Prob为：
[0017] Yl-Prob: 5' -6-FAM-CACCTCCCACCCTTCCCCAGA-BHQ-1-3' ；
[0018] 所述的特异性检测Y2区段的特征序列y2的荧光探针Y2-Prob为：
[0019] Y2-Prob:5,-R0X-CTCCCACCCTCCCCCTCGCCA-BHQ-2-3,；
[0020] 所述的特异性检测一SEA基因型扩增产物的荧光探针SEA-Prob为：
[0021] SEA-Prob:5'-HEX-CTTCGCAGGAACTCGGTCGTCCC-BHQ-1-3' ；
[0022] 所述的特异性检测α 2基因扩增产物的荧光探针A2-Prob为：
[0023] A2-Prob: 5 ' -CY5-ACCTCCATTGTTGGCACATTCCGGGA-BHQ-2-3 '。
[0024] 本发明所述的荧光探针中，FAM指羧基荧光素，HEX指六氯-6-甲基荧光素，R0X指 羧基-X-罗丹明，CY5是指花青染料分子5, BHQ-1和BHQ-2是指荧光淬灭基团。
[0025] 上述技术方案中，所述 Y1 区段的序列为：5' -AGTCCACCCCTTCCTTCCTCACCCTGCAGGAGC TGGCCAGCCTCATCACCCCMCATCTCCCCACCTCCATTCTCCMCCACAGGGCCCTTGTCTCCTCTGTCCTTTCCCCTCC CCGAGCCMGCCTCCTCCCTCCTCCACCTCCTCCACCTMTACATATCCTTMGTCTCACCTCCTCCAGGMGCCCTCAGA CTMCCCTGGTCACCTTGAATGCCTCGTCCACACCTCCAGACTTCCTCAGGGCCTGTGATGAGGTCTGCACCTCTGTGTG TACTTGTGTGATGGTTAGAGGACTGCCTACCTCCCAGAGGAGGTTGAATGCTCCAGCCGGTTCCAGCTATTGCTTTGTTT ACCTGTTTMCCAGTATTTACCTAGCMGTCTTCCATCAGATAG-3';该 Y1 区段的特征序列 yl 为：5'-TGCA CCCACTGGCACTCCTGCACCTCCCACCCTTCCCCAGMGTCCACCCCTTCCTTCCT-3，。
[0026] 上述技术方案中，所述Y2区段的序列为：5' -AGTCCACCCCTTCCTTCCTCACCCCACATCC CCTCACCTACATTCTGCAACCACAGGGGCCTTCTCTCCCCTGTCCTTTCCCTACCCAGAGCCAAGTTTGTTTATCTG ITTACAACCAGTAITTACCTAGCAAGTCTTCCATCAGATAG-3' ；该 Y2 区段的特征序列 y2 为：5' -TGCA CCCACTGGCACTCCTGCACCTCCCACCCTCCCCCTCGCCAAGTCCACCCCTTCCTTCCT-3'。
[0027] 本发明所述的快速检测常见缺失型α -地中海贫血的试剂盒还包括一些现有试 剂盒中常规且必须的组分，如缓冲液、酶液、MgCl2和dNTP等，具体的，酶液即为DNA聚合酶， 具体可采用康为世纪所生产的GoldStar Taq DNA Polymerase,缓冲液为与GoldStar Taq DNA Polymerase配套的缓冲液。
[0028] 本发明还提供采用上述试剂盒进行快速检测常见缺失型α -地中海贫血的方法， 包括以下步骤：
[0029] 1)抽提样本基因组DNA，制备DNA模板；
[0030] 2)配制反应体系，具体为：
[0031] 取可以同时扩增α-珠蛋白基因簇中Y1区段的特征序列yl和Y2区段的特征序列 y2的引物Y1Y2-F和Y1Y2-R、扩增α -珠蛋白基因簇中一SEA基因型的Gap-PCR引物SEA-F 和SEA-R、扩增α-珠蛋白基因簇中α2基因的引物A2-F和A2-R;特异性检测Y1区段的特 征序列yl的荧光探针Yl-Prob、特异性检测Υ2区段的特征序列y2的荧光探针Y2-Prob、特 异性检测一 SEA基因型扩增产物的荧光探针SEA-Prob和特异性检测α 2基因扩增产物的荧 光探针A2-Prob ;以及PCR缓冲液、酶液、MgCl2、dNTP、水和DNA模板配制成反应体系；
[0032] 3)样本检测：分别将配制的反应体系进行PCR扩增，记录每个PCR反应管内的荧光 信号到达设定的域值时所经历的循环次数Cq(Cq值的大小可以反映所检测模板数的多少）；
[0033] 4)数据分析及结果判定：根据定量检测所获得的Cq值，以正常基因型（α α/ α α )样本为对照标本，按下述公式进行计算：
[0034] 待检样本的基因 ACq = Cq Y2_Cq Y1 ;
[0035] 待检样本的基因 Δ Δ Cq = Δ Cq_待检样本_ Δ Cq_正常样本；
[0036] 待检样本的Y1和Y2(这里用Y1和Y2)相对拷贝数比值R = 2、1 ;
[0037] 根据R的值结合下述表1进行结果判定：
[0038] 表 1 :
[0039]
【权利要求】
1. 一种快速检测常见缺失型α-地中海贫血的试剂盒，包括扩增引物和荧光探针，其 特征在于： 所述的扩增引物为：一对可以同时扩增α -珠蛋白基因簇中Υ1区段的特征序列yl和 Y2区段的特征序列y2的引物Y1Y2-F和Y1Y2-R，一对扩增α -珠蛋白基因簇中一SEA基因型 的Gap-PCR引物SEA-F和SEA-R，以及一对扩增α -珠蛋白基因簇中α 2基因的引物A2-F 和 A2-R ; 所述的荧光探针为：一条特异性检测Υ1区段的特征序列yl的荧光探针Yl-Prob，一条 特异性检测Y2区段的特征序列y2的荧光探针Y2-Prob，一条特异性检测一SEA基因型扩增 产物的荧光探针SEA-Prob，以及一条特异性检测α 2基因扩增产物的荧光探针A2-Prob ; 其中： 所述的可以同时扩增α -珠蛋白基因簇中Y1区段的特征序列yl和Y2区段的特征序 列y2的引物对中， Y1Y2-F:5' -TGCACCCACTGGCACTC-3' ； Y1Y2-R:5, -AGGAAGGAAGGGGTGGACT-3,； 所述的扩增α-珠蛋白基因簇中--SEA基因型的Gap-PCR引物对中， SEA-F:5' -AGAAGCTGAGTGATGGGTCC-3' ； SEA-R:5' -TGGACTTAAGTGATCCTCCTGC-3' ； 所述的扩增α-珠蛋白基因簇中α 2基因的引物对中， A2-F:5' -TCCTGGCTTCTGTGAGCAC-3' ； A2-R:5' -GCAGAGAGGTCCTTGGTCTG-3' ； 所述的特异性检测Y1区段的特征序列yl的荧光探针Yl-Prob为： Yl-Prob:5' -6-FAM-CACCTCCCACCCTTCCCCAGA-BHQ-1-3' ； 所述的特异性检测Y2区段的特征序列y2的荧光探针Y2-Prob为： Y2-Prob:5, -R0X-CTCCCACCCTCCCCCTCGCCA-BHQ-2-3,； 所述的特异性检测一SEA基因型扩增产物的荧光探针SEA-Prob为： SEA-Prob:5' -HEX-CTTCGCAGGAACTCGGTCGTCCC-BHQ-1-3' ； 所述的特异性检测α 2基因扩增产物的荧光探针A2_Prob为： A2-Prob:5 ' -CY5-ACCTCCATTGTTGGCACATTCCGGGA-BHQ-2-3 '。
2. 根据权利要求1所述的快速检测常见缺失型α-地中海贫血的试剂盒，其特征在 于： 所述Υ1区段的序列为： 5' -AGTCCACCCCTTCCTTCCTCACCCTGCAGGAGCTGGCCAGCCTCATCACCCCAACATCTCCCCACCTCC ATTCTCCAACCACAGGGCCCTTGTCTCCTCTGTCCTTTCCCCTCCCCGAGCCAAGCCTCCTCCCTCCTCCACCTCCT CCACCTAATACATATCCTTAAGTCTCACCTCCTCCAGGAAGCCCTCAGACTAACCCTGGTCACCTTGAATGCCTCGT CCACACCTCCAGACTTCCTCAGGGCCTGTGATGAGGTCTGCACCTCTGTGTGTACTTGTGTGATGGTTAGAGGACTG CCTACCTCCCAGAGGAGGTTGAATGCTCCAGCCGGTTCCAGCTATTGCTTTGTTTACCTGTTTAACCAGTATTTACC TAGCAAGTCTTCCATCAGATAG-3,； 所述Υ2区段的序列为： 5' -AGTCCACCCCTTCCTTCCTCACCCCACATCCCCTCACCTACATTCTGCAACCACAGGGGCCTTCTCTCC CCTGTCCTTTCCCTACCCAGAGCCAAGTTTGTTTATCTGTTTACAACCAGTATTTACCTAGCAAGTCTTCCATCAGA TAG-3，。
3. 根据权利要求1所述的快速检测常见缺失型α-地中海贫血的试剂盒，其特征在 于： 所述 Y1 区段的特征序列 yl 为：5'-TGCACCCACTGGCACTCCTGCACCTCCCACCCTTCCCCAGAAG TCCACCCCTTCCTTCCT-3' ； 所述 Y2 区段的特征序列 y2 为：5' -TGCACCCACTGGCACTCCTGCACCTCCCACCCTCCCCCTCGCC AAGTCCACCCCTTCCTTCCT-3'。
4. 根据权利要求1所述的快速检测常见缺失型a-地中海贫血的试剂盒，其特征在于： 所述的试剂盒还包括PCR缓冲液、酶液、MgCl 2和dNTP。
5. 采用权利要求1所述试剂盒进行快速检测常见缺失型a-地中海贫血的方法，包括 以下步骤： 1) 抽提样本基因组DNA，制备DNA模板； 2) 配制反应体系，具体为： 取可以同时扩增a -珠蛋白基因簇中Y1区段的特征序列yl和Y2区段的特征序列y2 的引物Y1Y2-F和Y1Y2-R、扩增a -珠蛋白基因簇中一SEA基因型的Gap-PCR引物SEA-F和 SEA-R、扩增α -珠蛋白基因簇中α 2基因的引物A2-F和A2-R ;特异性检测Y1区段的特征 序列yl的荧光探针Yl-Prob、特异性检测Υ2区段的特征序列y2的荧光探针Y2-Prob、特异 性检测一 SEA基因型扩增产物的荧光探针SEA-Prob和特异性检测α 2基因扩增产物的荧光 探针A2-Prob ;以及PCR缓冲液、酶液、MgCl2、dNTP、水和DNA模板配制成反应体系； 3) 样本检测：分别将配制的反应体系进行PCR扩增，记录每个PCR反应管内的荧光信 号到达设定的域值时所经历的循环次数Cq ; 4) 数据分析及结果判定：根据定量检测所获得的Cq值，以正常基因型样本为对照标 本，按下述公式进行计算： 待检样本的基因 Λ Cq = Cq Y2_Cq Y1 ; 待检样本的基因 Δ ACq= ACqj检样本样本； 待检样本的Yl和Y2相对拷贝数比值Κ=2^Α&1; 根据R的值结合下述表1中进行结果判定： 表1 :
其中，当R在0. 75?1. 26范围时，其结果匹配上表理论值中的"1";当R在1. 8?2. 6 范围时，其结果匹配上表理论值中的"2" ；当R在0. 33?0. 53范围时，其结果匹配上表理 论值中的"〇. 5";若R的计算结果不在上述定义的R值范围内时，应采用其他方法进行辅助 判断。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤3)中，PCR扩增条件为：95°C预变性 8?10分钟，然后95°C 15?30秒，60°C退火50?70秒，39?49个循环。
7. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：PCR扩增条件为：95°C预变性10分钟，然 后95°C 15秒，60°C退火60秒，40个循环。
【文档编号】C12Q1/68GK104141014SQ201410417598
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2014年8月22日 优先权日:2014年4月16日
【发明者】龙驹 申请人:龙驹