表达mage3的疟原虫减毒子孢子构建方法及其应用和抗肺癌疫苗的制作方法
【专利摘要】一种表达MAGE3的疟原虫减毒子孢子构建方法及其应用和抗肺癌疫苗，所述表达MAGE3的疟原虫减毒子孢子构建方法，包括如下步骤：步骤一、构建基因敲除质粒PL0007-UIS+MAGE3和PL0007-UIS+MAGE3-gfp，步骤二、基因敲除伯氏疟原虫，获得表达MAGE3的重组遗传减毒子孢子。本发明选择能诱导很强CD4+/CD8+T反应的载体是设计有效肿瘤疫苗的关键。现有疫苗大多采用减毒病毒为载体，但效果并不是很理想。本发明提出了以疟原虫遗传减毒子孢子作为载体设计肺癌疫苗的新思路。本发明中探讨TLR2在表达MAGE3的重组遗传减毒子孢子抗肺癌中的作用和机制，可为今后设计有效的肺癌等亚单位疫苗提供重要的理论依据。本发明中重组遗传减毒子孢子的思路对于设计诱导CD4+/CD8+T反应的有效结核杆菌和HIV疫苗同样具有重要的借鉴意义。
【专利说明】表达MAGE3的拒原虫减毒子孢子构建方法及其应用和抗肺癌疫苗
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物疫苗领域，特别涉及表达MAGE3的疟原虫减毒子孢子构建方法及其应用和抗肺癌疫苗。
【背景技术】
[0002]肺癌在世界范围内所有癌症中的死亡率是最高的，其中非小细胞癌占85%。大部分非小细胞癌在诊断出时已经是中晚期，5年生存率小于5%。传统的肺癌治疗手段主要为手术、化疗和放疗，这些方案对于早期肺癌的治疗具有比较理想的疗效。然而，大多数的肺癌患者发现时已经进入了中晚期，常规治疗后的复发率较高，预后很差，迫切需要发展新的治疗手段，以增强常规治疗的效果。虽然分子靶向治疗，如VEGF中和抗体bevacizumab、络氨酸激酶抑制剂sunitinib和EGFR抑制剂erlotinlb等,在其他肿瘤的治疗中取得了一定的效果，但是对于肺癌而言效果并不理想。近年来兴起的免疫疗法则主要通过增强机体的免疫应答抗肿瘤，具有敏感性、特异性强的特点，被认为最有希望的肺癌治疗策略。
[0003]肿瘤疫苗不但能预防肿瘤的发生，而且还可以用于肿瘤的治疗，是重要的免疫治疗策略之一。大量的研究证实，CD4/CD8+T细胞免疫应答机体的免疫系统监视和抑制肿瘤的最主要效应机制，因此是设计有效肿瘤疫苗的重要依据。虽然，某些肿瘤疫苗(如糖基化MUCl多肽脂质体疫苗、前列腺酸性磷酸酶DC疫苗、治疗肾脏肿瘤的热休克蛋白复合物疫苗和治疗黑色素瘤的表达GM-CSF重组溶瘤单纯疱疹病毒疫苗)均取得了一定的效果，但是目前尚无较理想的抗肺癌疫苗。究其原因，可能与机体的免疫耐受抑制肿瘤疫苗诱导强烈的CD4/CD8+T细胞免疫应答有关。鉴于遗传减毒子孢子可克服机体免疫耐受，并成功诱导疟原虫特异性CD8+/CD4+T细胞反应，本项目以遗传减毒子孢子为载体，构建含主要肺癌相关抗原MAGE3的重组遗传减毒子孢子疫苗，观察能否发挥预防和治疗肺癌的作用，并进一步探讨相关机制，这可为设计有效的肺癌等肿瘤疫苗提供新思路。
[0004]国内外研究现状及发展动态分析:CD4/CD8+T细胞免疫应答:机体免疫监视和肿瘤免疫逃避或抑制的核心
[0005]自从20世纪50年代起，Burnet和Thomas提出的肿瘤免疫监视假说得到了越来越多的证据支持。研究证实，与野生小鼠相比，IFN-Y R+、介导IFN-Y R信号的关键转录因子STATl+或RAG+(缺乏T、B和NK细胞)小鼠更容易自发肿瘤，或在致癌物质诱导下产生肿瘤(Nature，2001)。人体肿瘤的研究同样发现，免疫缺陷的HIV患者的肺癌发生率、以及器官移植后使用免疫抑制剂患者的肿瘤发生率是正常的3倍左右(Clin Infect Dis,2007&JAMA, 2006)。这些均说明机体的免疫系统对肿瘤的发生发挥重要的监视和清除作用。即使在肿瘤发生后，机体的免疫系统仍然能抑制肿瘤细胞的增殖和迁移，使肿瘤在相当长的时间内处于休眠状态(dormancy)。研究发现,小剂量的致癌剂MCA能诱导小鼠产生肿瘤细胞，但通常处于隐匿状态，不会形成明显的肿瘤；然而，在用抗体耗竭IFN-Y后，肿瘤就会很快形成(Nature，2007)。同样，没有肿瘤发生迹象的器官移植给供体后，供体器官在使用免疫抑制剂后不久却出现了肿瘤(N.Engl.J.Med，2003)。虽然固有免疫在监视肿瘤发生过程中也发挥了一定作用，但⑶4/⑶8+T细胞免疫应答却是机体的免疫系统监视和抑制肿瘤的最主要效应机制。最近的研究发现，多倍体肿瘤细胞的持续“内质网应急”引起的Calreticulin在细胞表面的大量暴露可活化CD4/CD8+T细胞，并参与多倍体肿瘤细胞的监视和清除；然而，更多的证据表明，抗肿瘤的适应性免疫应答是肿瘤相关抗原所特异的。
[0006]为了逃避或抑制机体免疫应答，肿瘤细胞已经发展了多种策略。一方面，肿瘤细胞可以通过下调细胞表面的MHC I和II类分子、上调抗凋亡分子(Bcl-XL，FLIP)或表达细胞毒性T细胞的抑制分子(H)-L1，FasL)等方式抑制肿瘤抗原特异性⑶8+T和⑶4+T细胞的活化和逃避免疫攻击；另一方面，则可通过分泌TGF-β、IL-10、VGEF和IDO等抑制⑶8+Τ和⑶4+Τ细胞的活化，或通过募集抑制性T细胞(⑶4+⑶25+Foxp3+T)和髓源抑制性细胞(MDSCs)抑制肿瘤抗原特异性⑶8+T和⑶4+T细胞的活化。因此，肿瘤抗原特异性⑶8+T和CD4+T细胞不但是机体免疫监视肿瘤的主要效应机制，而且也是肿瘤的免疫逃避或抑制的核心。
[0007]现有肺癌疫苗设计及其存在的问题:鉴于对机体免疫监视肿瘤和肿瘤的免疫逃避或抑制的机制认识，目前的免疫治疗策略主要包括:(I)设计肿瘤疫苗诱导强烈的肿瘤抗原特异性T细胞免疫应答；(2)体外扩增肿瘤特异性T细胞，并进行过继治疗；(3)阻断肿瘤诱导的T细胞免疫抑制分子，如ro-Ll、CTLA-4和Treg。其中，由于肿瘤疫苗不但能预防肿瘤的发生，而且还可以用于肿瘤的治疗，因此引起了我们的关注。
[0008]目前已经进行尝试的肿瘤疫苗形式主要包括肿瘤相关抗原多肽疫苗、DNA核酸疫苗、DC疫苗、肿瘤灭活疫苗和溶瘤病毒肿瘤疫苗等，旨在诱导肿瘤特异性的CD4/CD8+T细胞免疫应答。其中比较成功的有糖基化MUCl多肽脂质体疫苗、获得美国FDA批准的前列腺酸性磷酸酶DC疫苗(Provenge)、获得俄罗斯批准的治疗肾脏肿瘤的热休克蛋白复合物疫苗(Oncophage)、以及进入临床III期的用于治疗黑色素瘤的表达GM-CSF重组溶瘤单纯疱疹病毒疫苗(Oncovex)等。然而，对于肺癌而言，目前尚无成功运用于临床的预防性或治疗性疫苗。
[0009]特异性肿瘤相关抗原和高效诱导T细胞免疫应答的递送系统(佐剂效应)的选择是设计成功肿瘤疫苗的关键。迄今为止，已经鉴定的肺癌相关肿瘤抗原主要有MUC1、CT (Cancer testis)抗原 Melanoma-associated antigens (MAGE)或 NY-ESO-l、以及新近发现的糖蛋白Glypican-3 (GPC3)。其中MAGE-A3在大部分肺癌细胞细胞中高表达而在正常细胞中不表达；是治疗非小细胞癌的理想靶点，也是设计肺癌疫苗的主要候选抗原。目前已经尝试的肺癌疫苗递送系统主要有DC和病毒载体，包括AdVhMAGE3/DC疫苗，即将含有MAGE3的重组腺病毒AdVhMAGE3，或重组慢病毒LenthMAGE3转染DC进行免疫(Cancer Research,1999),或采取priming-boosting策略加强免疫(Cancer Research, 2001)。虽然上述策略能诱导产生一定的MAGE3特异CD4/CD8+T细胞反应，但是不能有效预防肺癌的生长，效果并不理想。
[0010]减毒子孢子有望为肺癌等肿瘤疫苗的设计提供新载体:与抗肿瘤和抗病毒感染相一致，机体也是通过诱导T细胞免疫应答清除胞内寄生的原虫，如利什曼原虫、弓形虫、锥虫和疟原虫。于是，近年来科学家们开始尝试采用寄生原虫作为载体诱导强烈的抗肿瘤免疫。研究报道，利用枯氏锥虫为载体，通过遗传操纵技术成功构建了能表达黑色素瘤抗原的重组减毒枯氏锥虫，免疫后能有效地诱导特异的CD8+T和CD4+T细胞反应，不但能预防黑色素瘤，而且能一定程度上治疗黑色素瘤。然而，枯氏锥虫感染主要活化特异性的CD4+T细胞反应，而CD8+T细胞反应相对较弱，这对于主要依赖CD8+T细胞的抗肿瘤免疫机制而言并不是理想的载体。
[0011]疟疾是世界上危害最为严重的三大传染病之一，其病原体是疟原虫。疟原虫是由按蚊叮咬传播的，其生活史包括在蚊体内的发育(蚊期)、以及在人体肝细胞内的发育(肝期/红外期)和在红细胞内的发育(红内期)。疫苗是防治疟疾疫苗的最理想手段。根据作用时期不同，疟疾疫苗主要有红外期和红内期两种。迄今为止，遗传减毒子孢子疫苗是目前最有效的疟疾红外期疫苗。遗传减毒子孢子是一种经遗传操纵特异敲除疟原虫肝期发育相关基因(如Fabff、UIS3或nS4)的子孢子(Nature，2005)，具备特异入侵肝细胞的能力，但不能在肝细胞内进一步发育。遗传减毒子孢子免疫后，能在入侵肝细胞的为数非常少，但却诱导肝脏产生持久、强烈的抗子孢子表面主要蛋白环子孢子蛋白(Circumsporozoitesprotein, CSP)⑶8+/⑶4+T细胞反应，有效地抵御子孢子的感染和清除感染肝细胞的疟原虫；另外，遗传减毒子孢子不会引起疟原虫的潜在感染，安全性好。因此，遗传减毒子孢子疫苗是唯一的、既有效又安全的红外期疟疾疫苗，并已被批准进入了临床试验[。
[0012]与现有的病毒载体和DC肺癌疫苗不同，少量(1000个)的遗传减毒子孢子就能诱导很强的CD8+/CD4+T细胞反应，提示遗传减毒子孢子可克服了机体的免疫耐受机制，可为有效肿瘤疫苗的设计提供新的更有效的载体；而遗传减毒子孢子能有效地诱导机体的⑶8+/⑶4+T细胞反应，所以尤其适合用于肺癌疫苗的设计。
【发明内容】
[0013]为解决上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种表达MAGE3的疟原虫减毒子孢子的构建方法，本发明的另一个目的在于提供一种利用该方法构建的表达MAGE3的痕原虫减毒子孢子抗肺癌疫苗。
[0014]为达到上述目的，本发明的技术方案为:
[0015]一种表达MAGE3的疟原虫减毒子孢子的构建方法，包括如下步骤:
[0016]步骤一、构建基因敲除质粒PL0007-UIS+MAGE3 和 PL0007_UIS+MAGE3-gfp
[0017]首先分别以伯氏疟原虫DNA、PL0001质粒和LLC的cDNA为模板扩增出伯氏疟原虫UIS基因的5'和3' UIS、3, pbdhfr以及MAGE3 ;然后采用重叠PCR在体外连接5' UIS、MAGE3和3 ' pbdhfr,并通过无缝连接将3 ^ UIS和Y UIS-MAGE3-3 ' pbdhfr分别克隆至PL0007质粒的3 ^和Y端，常规进行转化、阳性克隆挑选和双酶切鉴定，构建重组质粒PL0007-UIS+MAGE3 ;另外，为了方便观察构建的重组遗传减毒子孢子能正确地表达MAGE3，按同上方法，构建重组质粒PL0007-UIS+MAGE3+GFP ；
[0018]步骤二、基因敲除伯氏疟原虫，获得表达MAGE3的重组遗传减毒子孢子
[0019]将基因敲除质粒PL0007-UIS+MAGE3和PL0007_UIS+MAGE3_gfp线性化后，采用电转方式转染伯氏疟原虫裂殖子，加乙胺嘧啶进行筛选，并进行克隆；结果发现，挑选2个疟原虫克隆无论在红内期还是子孢子时期均能高表达GFP，提示表达MAGE3的重组减毒子孢子构建成功。
[0020]上述所述表达MAGE3的痕原虫减毒子孢子在治疗肺癌方面的应用。
[0021]利用上述表达MAGE3的疟原虫减毒子孢子制备的抗肺癌疫苗。
[0022]相对于现有技术，本发明的有益效果为:本发明提出了一种表达MAGE3的疟原虫减毒子孢子的构建方法，并利用该疟原虫减毒子孢子提供了一种抗肺癌疫苗，(I)本发明方法选择能诱导很强CD4+/CD8+T反应的载体是设计有效肿瘤疫苗的关键。现有疫苗大多采用减毒病毒为载体，但效果并不是很理想。本发明提出了以疟原虫遗传减毒子孢子作为载体设计肺癌疫苗的新思路。(2)本发明中探讨TLR2在表达MAGE3的重组遗传减毒子孢子抗肺癌中的作用和机制，可为今后设计有效的肺癌等亚单位疫苗提供重要的理论依据。(3)本发明中重组遗传减毒子孢子的思路对于设计诱导⑶4+/⑶8+T反应的有效结核杆菌和HIV疫苗同样具有重要的借鉴意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1.为表达MAGE3和MAGE3+GFP的重组减毒子孢子的构建。其中，A，用于构建表达MAGE3的重组减毒子孢子的质粒图谱；B，用于构建表达MAGE3+GFP的重组减毒子孢子的质粒图谱；C&D，酶切鉴定表达MAGE3和MAGE3+GFP减毒子孢子的重组质粒；E，红内期和子孢子时期发绿色荧光的MAGE3+GFP的重组减毒子孢子。
[0024]图2.为重组减毒子孢子疫苗PL0007-UIS+MAGE3免疫小鼠抵御肺癌细胞的攻击。
[0025]其中，A，LLC攻击PBS、PL0007-UIS或PL0007-UIS+MAGE3免疫小鼠的肿瘤生长情况 B，LLC 攻击 PBS、PL0007-UIS 或 PL0007-UIS+MAGE3 免疫小鼠生活率。
[0026]图3.为TLR2识别子孢子及其在减毒子孢子疫苗诱导保护性免疫中的作用。
[0027]其中，A，NF-KB报告基因试验发现，减毒子孢子裂解产物(SPZ)只能活化TLR2。M, medium ;Control,正常蚊唾液腺裂解产物；LTA、LPS > poly (I:C)、Flagel I in、GdQ 和 CpG分别为 TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR9 的激动剂；B，TLR2/2、TLR2/1 和 TLR6/2 均能识别减毒子孢子裂解产物C，TLR2-/-和MyD88-/_小鼠促进红外期疟原虫的发育，表现为肝脏虫荷增加；D，遗传减毒子孢子PL0007-UIS免疫后，TLR2-/-小鼠抵御子孢子攻击能力明显下降，表现为肝脏虫荷增加。
【具体实施方式】
[0028]下面结合附图及【具体实施方式】对本发明方案做进一步详细描述:
[0029]如图1所示:表达MAGE3的重组遗传减毒子孢子(PL0007-UIS+MAGE3和PL0007-UIS+MAGE3-gfp)的构建
[0030](I)构建基因敲除质粒 PL0007-UIS+MAGE3 和 PL0007_UIS+MAGE3-gfp
[0031]首先分别以伯氏疟原虫DNA、PL0001质粒和LLC的cDNA为模板扩增出伯氏疟原虫UIS基因的5'和3' UIS、3, pbdhfr以及MAGE3 ;然后采用重叠PCR在体外连接5' UIS、MAGE3和3 ' pbdhfr,并通过无缝连接将3 ^ UIS和Y UIS-MAGE3-3 ' pbdhfr分别克隆至PL0007质粒的Y和Y端，常规进行转化、阳性克隆挑选和双酶切鉴定，构建重组质粒PL0007-UIS+MAGE3。另外，为了方便观察构建的重组遗传减毒子孢子能正确地表达MAGE3，同上方法，我们还构建了重组质粒PL0007-UIS+MAGE3+GFP。
[0032](2)基因敲除伯氏疟原虫，获得表达MAGE3的重组遗传减毒子孢子
[0033]将上述质粒线性化后，采用电转方式转染伯氏疟原虫裂殖子，加乙胺嘧啶进行筛选，并进行克隆。结果发现，挑选2个疟原虫克隆无论在红内期还是子孢子时期均能高表达GFP，提示我们成功构建了表达MAGE3的重组减毒子孢子。
[0034]如图2所示，(I)观察PL0007-UIS+MAGE3重组遗传减毒子孢子的抗子孢子攻击和抗肿瘤能力
[0035]①重组遗传减毒子孢子末次免疫后14d，定量PCR检测肝脏虫荷以及吉氏染色检测小鼠外周血中原虫，判断重组遗传减毒子孢子疫苗的抗疟原虫感染能力
[0036]②重组遗传减毒子孢子末次免疫后14d，接种小鼠肺癌细胞株，观察肿瘤增殖情况，判断重组遗传减毒子孢子抵御肺癌细胞攻击能力
[0037]③小鼠接种肺癌细胞株后5d进行重组遗传减毒子孢子免疫，观察肿瘤增殖情况，判断重组遗传减毒子孢子抑制肺癌细胞生长能力
[0038](2)探讨PL0007-UIS+MAGE3重组遗传减毒子孢子的抗子孢子攻击和抗肿瘤的效应机制
[0039]①重组遗传减毒子孢子末次免疫后14d，流式检测肝脏、脾脏中的疟原虫特异、MAGE3特异的CD4/CD8+T细胞频率及其分泌IFN- Y能力
[0040]②重组遗传减毒子孢子末次免疫后14d，ELISA检测血清中抗CSP和MAGE3的抗体滴度
[0041]③重组遗传减毒子孢子分别免疫CD4-/-、CD8-/_、B cell-/-小鼠后,观察其抗痕原虫感染、以及预防和治疗肺癌能力
[0042](3)探讨PL0007-UIS+MAGE3重组遗传减毒子孢子抗疟原虫和肺癌的载体效应机制
[0043]①重组遗传减毒子孢子免疫TLR2-/-小鼠14d后,观察其抗痕原虫感染和抵御肺癌细胞攻击能力
[0044]②重组遗传减毒子孢子免疫TLR2-/-小鼠14d后，观察其对⑶4/⑶8+T细胞反应和抗体产生的影响
[0045]③重组遗传减毒子孢子免疫TLR2-/-小鼠14d后，观察其对DC和Treg活化及其功能影响。
[0046]试验例1、
[0047]子孢子的纯化:感染PL0007-UIS或PL0007-UIS+MAGE3后17d，收集300只雌斯氏按蚊(如果要分离纯化减毒子孢子，则需要用10，OOOrd剂量60CO室温照射减毒)，乙醚麻醉后研磨蚊组织，RPMI1640培养基重悬后离心去除蚊组织。离心富集上清中子孢子,取Iml子孢子重悬液加入到用泛影葡胺配制的下、上层密度梯度离心液上面。16，OOOrpm离心后，从双层梯离心液界面吸取富含子孢子层，离心洗涤后计数。
[0048]定量RT-PCR检测肝脏疟原虫负荷:子孢子攻击免疫小鼠后42h，分离小鼠肝脏，用TRIzol提取总RNA ；DNase I处理后，逆转录获得cDNA ;用小鼠GAPDH和18srRNA质粒绘制标准曲线；以感染疟原虫小鼠的肝脏cDNA为模板，构建TaqMan RT-PCR反应体系，20 μ I体系中，cDNAly 1，上下游引物各 I μ 1，探针 0.5μ I, Premix Ex Taq (2 X) 10 μ 1，Η206.5μ I。扩增条件:95°C 2min, ；95°C 15s,60°C 20s,40个循环；根据18srRNA/GAPDH比值确定各样本18sRNA相对含量。
[0049]皮下种植LLC:取4周龄SPF级雌性C57/BL。将细胞浓度调整为2 X 107/mL的细胞悬液，按0.2mL/鼠的量分别接种于4周龄SPF级雌性C57BL小鼠前肢腋下，接种细胞数目为4X106/鼠。接种LLC细胞后，观察每只小鼠皮下肿瘤生长情况。接种肿瘤细胞1d后，每隔2d用游标卡尺测量肿瘤的最大直径a及横径b (单位为毫米mm)，计算肿瘤大小。
[0050]流式检测抗原特异⑶4+/⑶8+T细胞频率:分离肝脾淋巴细胞，用Iml RPMI1640完全培养基重悬I X 106肝脏或脾脏淋巴细胞，加入10 μ g/ml BFA和10 μ g/ml的⑶4+/⑶8+T细胞表位肽进行培养；4h后收集细胞，加入含0.3μ I PE标记ant1-mouse ^4^)8的5(^1抗体稀释液，避光4°C孵育20min ;洗涤两次，加入0.5ml新鲜配制的固定和破膜工作液重悬，避光4°C孵育30min ;离心洗涤后，加入0.3μ I APC标记ant1-mouse IFNi/管，避光4°C孵育至少30min。加入200 μ I的FACS染色缓冲液重悬沉淀，进行FACS检测。
[0051]混合淋巴实验检测DC活化CD4+T细胞能力:取5X104的纯化免疫的C57/BL小鼠脾脏或肝脏DC与2 X 105纯化的BALB/c⑶4+T细胞共培养3d后，加入3H标记的胸苷共孵育，8h后收集细胞检测闪烁率，并收集培养上清，采用ELISA试剂盒检测分泌的IFN- Y。Treg细胞抑制CD4+T功能试验:同前制备肝脏和脾脏淋巴细胞单细胞悬液，首先根据阴性分选原理，利用CD4+T细胞分离试剂盒(Miltenyi B1tec, 130-090-860)获得CD4+T细胞，然后，在 PE-anti_CD25 标记 CD4+T 细胞后，用 ant1-PE microbeads (Miltenyi B1tec,130-048-801)阳性分选获得 Treg 细胞(具体方法参照 Miltenyi B1tec, http://www.miltenyib1tec.com/)。取 2 X 104CD4+CD25+Treg 与 I X 105CFSE 标记的 CD4+CD25-T 在 96孔板中共培养，并加入5X 104ant1-CD3/anti_CD28mAb-包被磁珠(Invitrogen)活化CD4+T细胞，3d后流式检测CD4+T细胞表面CFSE的荧光强度，观察其增殖能力，并收集上清，ELISA检测 IL-2 和 IFN- Y。
[0052]试验例2、重组遗传减毒子孢子疫苗的抗子孢子攻击
[0053]以正常未免疫C57/BL小鼠为对照，设立伯氏疟原虫(P.bANKA)遗传减毒子孢子(PL0007-UIS)和表达MAGE3的重组遗传减毒子孢子(PL0007-UIS+MAGE3)实验组，每组10只小鼠。尾静脉注射1X103PL0007-UIS和PL0007-UIS+MAGE3，隔两周分别免疫三次。三次免疫后2周，用I X 104野生株P.bANKA子孢子尾静脉注射，攻击上述三组C57/BL小鼠。42h后，各组分离5只小鼠的肝脏，采用定量RT-PCR检测P.bANKA的18srRNA，比较三组小鼠的肝脏疟原虫负荷；另外，吉氏染色检测每组剩余的5只小鼠红内期疟原虫的出现时间和原虫血症。根据肝脏虫荷和原虫血症判断PL0007-UIS+MAGE3是否仍具备诱导小鼠产生完全保护性免疫的能力。
[0054]试验例3、重组遗传减毒子孢子抵御肺癌细胞攻击能力
[0055]同上进行PL0007-UIS或PL0007-UIS+MAGE3的分离、纯化和免疫，末次免疫后14d，以5 X 104数量的小鼠肺癌细胞株细胞LLC (表达MAGE3)腋下接种，观察成瘤情况，每隔三d测量一次肿瘤大小，并记录荷瘤小鼠生存时间。与PBS免疫组小鼠阴性对照组的肿瘤生长速率和小鼠存活率相比，判断PL0007-UIS或PL0007-UIS+MAGE3免疫C57/BL小鼠抵御肺癌细胞株LLC的攻击能力。
[0056]试验例4、重组遗传减毒子孢子治疗肺癌能力
[0057]首先用I X 106小鼠肺癌细胞株细胞LLC (表达MAGE3)通过腋下接种三组C57/BL小鼠(n = 10)，5d后分别免疫PBS、PL0007-UIS或PL0007-UIS+MAGE3，每隔5d再免疫两次，比较三组小鼠肿瘤生长速率和存活率，探讨PL0007-UIS和PL0007-UIS+MAGE3是否具有治疗肺癌的能力。
[0058]探讨PL0007-UIS+MAGE3重组遗传减毒子孢子抗子孢子攻击和抗肿瘤的效应机制
[0059](I)重组遗传减毒子孢子活化CSP和MAGE3特异性⑶4/⑶8+T情况
[0060]同上进行PL0007-UIS或PL0007-UIS+MAGE3的分离、纯化和免疫，末次免疫后14d，分离肝、脾淋巴细胞。为了检测CSP特异的⑶4/⑶8+T细胞，加入主要的⑶8+T表位肽(SYIPSAEKI)和CD4+T细胞表位肽(KQIRDSITEEWS)刺激后，采用流式检测产生IFN-Y的CSP特异CD4/CD8+T细胞频率；在不清楚小鼠MAGE3的CD4/CD8+T细胞表位肽序列的情况下，则直接加入小鼠MAGE3蛋白分别与肝、脾淋巴细胞进行充分孵育，促进抗原的递呈和再次活化已致敏的⑶4/⑶8+T，同上采用流式技术检测产生IFN- Y的MAGE3特异⑶4/⑶8+T细胞频率。
[0061](2)重组遗传减毒子孢子诱导CSP和MAGE3抗体的产生
[0062]同上进行PL0007-UIS或PL0007-UIS+MAGE3的分离、纯化和免疫，末次免疫后14d，分离各组小鼠的血清，采用ELISA方法检测血清中抗CSP和MAGE3的抗体滴度
[0063](3)⑶4+、⑶8+T和B cell在重组遗传减毒子抱子抗肺癌和子抱子中的作用
[0064]同上进行PL0007-UIS+MAGE3的分离和纯化，常规尾静脉注射PL0007-UIS+MAGE3免疫野生、CD4-/-、CD8-/-或B cell-/-(yMT) C57/BL小鼠进行免疫(η = 12)，末次免疫后14d，每组小鼠在分为两组，分别用野生子孢子和5X104LLC进行攻击。子孢子攻击组同上检测肝脏虫荷和原虫血症，肺癌攻击组则测量肿瘤大小和荷瘤小鼠生存时间，探讨CD4+、CD8+T和B cell在PL0007-UIS+MAGE3免疫小鼠抵御肺癌细胞和子孢子攻击中的作用。
[0065]探讨PL0007-UIS+MAGE3重组遗传减毒子孢子抗疟原虫和肿瘤的载体效应机制
[0066](I) TLR2对重组遗传减毒子孢子抵御子孢子和肺癌细胞攻击能力的影响
[0067]同上进行PL0007-UIS+MAGE3的分离和纯化，常规尾静脉注射PL0007-UIS+MAGE3免疫野生和TLR2-/-C57/BL小鼠进行免疫(η = 12)，末次免疫后14d，每组小鼠在分为两组，分别用野生子孢子和5X 14LLC进行攻击。子孢子攻击组同上检测肝脏虫荷和原虫血症，肺癌攻击组则测量肿瘤大小和荷瘤小鼠生存时间，探讨TLR2在PL0007-UIS+MAGE3免疫小鼠抵御肺癌细胞和子孢子攻击中的作用。
[0068](2) TLR2对重组遗传减毒子孢子诱导⑶4/⑶8+T细胞反应和抗体产生的影响
[0069]同上进行PL0007-UIS+MAGE3的分离和纯化，常规尾静脉注射PL0007-UIS+MAGE3免疫野生和TLR2-/-C57/BL小鼠进行免疫(η = 12)，末次免疫后14d，分离肝、脾淋巴细胞，同时收集血清。同上采用流式检测肝和脾中产生IFN-Y的CSP特异⑶4/⑶8+T细胞频率，以及产生IFN- Y的MAGE3特异CD4/CD8+T细胞频率；同前检测血清中的抗CSP和MAGE3的抗体滴度；探讨TLR2对PL0007-UIS+MAGE3诱导⑶4/⑶8+T细胞反应和抗体产生中的作用。
[0070](3) TLR2缺失对重组遗传减毒子孢子免疫小鼠DC和Treg活化及其功能影响
[0071]同上进行PL0007-UIS+MAGE3的分离和纯化，常规尾静脉注射PL0007-UIS+MAGE3免疫野生和TLR2-/-C57/BL小鼠进行免疫(η = 12)，单次免疫后2、4和6d，分离肝、脾淋巴细胞。流式比较DC表面⑶80、⑶86和MHC II水平，判断对DC成熟的影响；为检测DC活化CD4+T细胞能力，则采用磁珠分离免疫后C57BL/6小鼠肝、脾DC，以及正常BALB/c小鼠脾脏CD4+T 细胞(具体方法参照 Miltenyi B1tec, http://www.miltenyib1tec.com/),米用混合淋巴实验检测DC活化⑶4+T细胞能力。
[0072]同上进行PL0007-UIS+MAGE3的分离和纯化，常规尾静脉注射PL0007-UIS+MAGE3免疫野生和TLR2-/-C57/BL小鼠进行免疫(η = 12)，单次免疫后2、4和6d，分离肝、脾淋巴细胞。流式检测细胞表面的⑶4和⑶25标记以及胞内Foxp3，比较两组小鼠肝脾的Treg频率；为了检测Treg功能，则采用磁珠分离免疫小鼠的Treg和正常小鼠CD4+T细胞，共培养后同前检测⑶4+T细胞的增殖及其分泌IFN-Y能力，比较四组小鼠来源的Treg对⑶4+T细胞功能的抑制能力。
[0073]本发明的工作原理为:①成功构建表达MAGE3的重组减毒子孢子
[0074]首先分别以伯氏疟原虫DNA、PL0001质粒和LLC的cDNA为模板扩增出伯氏疟原虫UIS基因的5'和3' UIS、3, pbdhfr以及MAGE3 ;然后采用重叠PCR在体外连接5' UIS、MAGE3和3 ' pbdhfr,并通过无缝连接将3 ^ UIS和U UIS-MAGE3-3 ' pbdhfr分别克隆至PL0007质粒的Y和Y端，常规进行转化、阳性克隆挑选和双酶切鉴定，构建重组质粒PL0007-UIS+MAGE3(图1A&C)。另外，为了方便观察构建的重组遗传减毒子孢子能正确地表达MAGE3，同上方法，我们还构建了重组质粒PL0007-UIS+MAGE3+GFP(图1B&D)。最后，将上述质粒线性化后，采用电转方式转染伯氏疟原虫裂殖子，加乙胺嘧啶进行筛选，并进行克隆。结果发现，挑选2个疟原虫克隆无论在红内期还是子孢子时期均能高表达GFP，提示我们成功构建了表达MAGE3的重组减毒子孢子。
[0075]②表达MAGE3的重组减毒子孢子疫苗能有效抑制肺癌的生长
[0076]疟原虫感染按蚊后17d，常规进行野生和遗传减毒唾液腺子孢子的分离纯化。然后，用PBS、遗传减毒子孢子PL0007-UIS或PL0007-UIS+MAGE3通过尾静脉注射免疫C57/BL小鼠，末次免疫后14d，腋下接种小鼠肿瘤细胞株LLC进行攻击。每隔2?3d测量肿瘤大小，以及小鼠的存活率。结果发现，与PBS免疫组相比，PL0007-UIS免疫小鼠具有轻微抵御肿瘤细胞攻击的能力，但不影响小鼠的存活率(P > 0.05);而PL0007-UIS+MAGE3免疫小鼠则能完全抵御LLC的攻击，所有小鼠存活。
[0077]③TLR2信号在遗传减毒子孢子疫苗抗疟原虫中的作用
[0078]利用NF-κ B报告基因检测平台，对减毒子孢子活化TLRs (Toll-like receptors)进行了系统的筛查，结果发现减毒子孢子只能活化TLR2的同源二聚体TLR2/2，以及异源二聚体TLR2/1和TLR2/6 (图3A&B)，体内试验发现TLR2信号(TLR2和MyD88)能促进红外期疟原虫的发育，进一步证实TLR2在识别减毒子孢子中的重要作用(图3C)。进一步研究发现，与野生小鼠相比，遗传减毒子孢子免疫后的TLR2-/-小鼠抑制肝期疟原虫的发育受到明显的限制，提示TLR2在遗传减毒子孢子诱导小鼠产生抗疟原虫保护性免疫中的重要作用(图3D)。
[0079](I)免疫治疗具有敏感性、特异性强的特点，是目前肺癌常规治疗手段的重要补充，联合使用有望改善肺癌的预后，降低复发率；而肿瘤疫苗具有预防和治疗的双重特点，是肿瘤免疫治疗的重要策略。本项目瞄准这一重要领域，具有重要的科学意义。
[0080](2)本发明的前期研究发现，表达MAGE3的重组遗传减毒子孢子确实能有效地抵御肺癌细胞的攻击，但是机制不清楚。有意思的是，课题组在探讨遗传减毒子孢子保护性免疫机制中还发现TLR2参与识别减毒子孢子，并在其诱导小鼠保护性免疫中发挥重要作用。鉴此，本项目推测TLR2信号可能在重组遗传减毒子孢子有效地抵御肺癌细胞的攻击中发挥重要作用，并进一步探讨其机制，是在前期研究基础上的深入，这在理论上是可行的。
[0081]以上所述，仅为本发明的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
【权利要求】
1.一种表达MAGE3的疟原虫减毒子孢子的构建方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤一、构建基因敲除质粒 PL0007-UIS+MAGE3 和 PL0007_UIS+MAGE3-gfp 首先分别以伯氏疟原虫DNA、PLOOOl质粒和LLC的cDNA为模板扩增出伯氏疟原虫UIS基因的5'和3' UIS、3, pbdhfr以及MAGE3 ;然后采用重叠PCR在体外连接5' UIS、MAGE3和3 ' pbdhfr,并通过无缝连接将3 ^ UIS和Y UIS-MAGE3-3 ' pbdhfr分别克隆至PL0007质粒的3 ^和Y端，常规进行转化、阳性克隆挑选和双酶切鉴定，构建重组质粒PL0007-UIS+MAGE3 ;另外，为了方便观察构建的重组遗传减毒子孢子能正确地表达MAGE3，按同上方法，构建重组质粒PL0007-UIS+MAGE3+GFP ； 步骤二、基因敲除伯氏疟原虫，获得表达MAGE3的重组遗传减毒子孢子将基因敲除质粒PL0007-UIS+MAGE3和PL0007_UIS+MAGE3-gfp线性化后，采用电转方式转染伯氏疟原虫裂殖子，加乙胺嘧啶进行筛选，并进行克隆；结果发现，挑选2个疟原虫克隆无论在红内期还是子孢子时期均能高表达GFP，提示表达MAGE3的重组减毒子孢子构建成功。
2.权利要求1所述表达MAGE3的疟原虫减毒子孢子在治疗肺癌方面的应用。
3.利用权利要求1所述表达MAGE3的疟原虫减毒子孢子制备的抗肺癌疫苗。
【文档编号】C12N1/11GK104232677SQ201410417625
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年8月25日 优先权日:2014年8月25日
【发明者】戴纪刚, 刘权兴, 徐文岳, 邓旭锋 申请人:戴纪刚, 刘权兴