一种对香豆酸脱羧酶blpad及其编码基因和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种对香豆酸脱羧酶BLPAD及其编码基因和应用，所述对香豆酸脱羧酶BLPAD的氨基酸序列如SEQIDN0.1所示。本发明的对香豆酸脱羧酶BLPAD是从本实验室于堆肥中筛选得到的地衣芽孢杆菌CGMCC7172中克隆得到的新的对香豆酸脱羧酶，其最适温度为37°C，最适pH为6.0，具有良好的温度和pH稳定性，对多种有机溶剂有较好的耐受性，在进行两相体系转化对香豆酸及阿魏酸生产4-乙烯基酚类物质时，当底物浓度分别达到500mM时，摩尔转化率仍能分别达到97.02%和70.96%，最终产物4-乙烯基苯酚及4-乙烯基愈创木酚分别达到60.63g/L及58.30g/。因此其在生物法生产4-乙烯基酚类物质的工业化应用中具有良好的应用前景。
【专利说明】-种对香豆酸脱羧酶BLPAD及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及一种对香豆酸脱羧酶BLPAD及其编码基 因和应用。
【背景技术】
[0002] 4_乙烯基苯酚（4-vinylphenol)和4_乙烯基愈创木酚（4-vinylguaiacol)均为 酚酸类物质的4-乙烯基衍生物，具有挥发性，有独特的气味，嗅觉识别度较高。4-乙烯基苯 酚具有苯酚，药物和辛香风味，可用于食品添加剂及香精的配制，它作为一种单体可用于合 成聚4-乙烯基苯酚并可应用于光刻胶技术及合成树脂M等。4-乙烯基愈创木酚具有强烈 香辛料、丁香和发酵似香气，有炒花生气息，无色至淡稻草黄色油状液体，是决定多种食品 饮料以及酒类的主要香味成分，同时还是一种香水，香精以及医药等行业不可多得的高档 香料，其市场价格约为阿魏酸的20倍左右。4-乙烯基愈创木酚与4-乙烯基苯酚均为高附 加值产品。
[0003] 市场上的4-乙烯基苯酚与4-乙烯基愈创木酚多为化学法合成，需要较多的前体 物质，有些还需要较为剧烈的条件。这两种物质很大一部分用于香精，医药及食品工业，而 化学合成品用于这些方面有很大的不安全性，所以，寻找一条快速，高效生产这两种物质 的生物合成途径是很有必要的。目前已有利用一些菌株通过利用阿魏酸（Ferulic acid) 生成4-乙烯基愈创木酚的报道，如汉逊德巴氏酵母（Debaryomyces hansenii)，假丝酵母 (Genus Candida),香肠乳杆菌（Lactobacillus farciminus)，肠杆菌（Enterobacter)等， 其中4-乙烯基愈创木酚的市场价格约为底物阿魏酸（Ferulic acid)的40倍左右。也有报 道利用大肠杆菌表达外源的酚酸脱羧酶，再通过重组大肠杆菌全细胞或固定化细胞利用对 香豆酸（p-Coumaric acid)或阿魏酸分别来生产4-乙烯基苯酚和4-乙烯基愈创木酚。还 有通过代谢工程途径在大肠杆菌内共表达真核与原核基因由葡萄糖为原料生物合成4-乙 烯基苯酚。但底物对香豆酸和阿魏酸或产物4-乙烯基苯酚和4-乙烯基愈创木酚对大多数 菌株都有毒性，浓度过高会抑制菌株的生长或酚酸脱羧酶的活性，从而导致4-乙烯基酚类 物质产量的降低及生产效率低下，这对工业化大生产来说是极其不利的。为了解决这些问 题，我们使用了一个由水相和水不溶性有机溶剂组成的两相反应体系，在这个反应体系中， 4-乙烯基酚类物质会选择性的进入有机相而酚酸类物质和酶却会保留在水相中，从而减缓 酶的失活速度并提高产物的产量及回收率，提高转化率。因此，找到具有较好的有机溶剂耐 受性和催化效率，并能很好应用于两相反应体系的酚酸脱羧酶是很有必要的。
[0004] 酚酸脱羧酶是一类能够催化酚酸发生非氧化脱羧（Nonoxidative decarboxyl ation)反应的酶，这一途径对于菌株利用酚酸，解除酚酸对自身细胞的毒性有重要的作用， 已有报道发现多种菌株能利用酚酸类物质并有多篇文献对多种菌株的酚酸脱羧酶进行了 报道，且一些菌株，如枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)，植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum)，肠杆菌等的酚酸脱羧酶基因已经在大肠杆菌中超表达，并进行了一系列酶学 性质的研究，但未见有地衣芽孢杆菌酚酸脱羧酶的报道。另外，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)的酚酸脱羧酶PADl需要有辅酶因子FMN的存在才能发挥作用，且催化活性较 低。另一种来自真菌季也蒙假丝酵母（Candida guilliermondii)的酚酸脱羧酶CgPAD酶活 受一个内源因子的调节，该内源因子是一个硫醇类物质，在体外向反应体系中添加 DL-同 型半胱氨酸（DL-Homologous cysteine)时，该酶的比酶活增加了近5倍左右。
[0005] 酚酸脱羧酶的活性受底物和产物的影响很大，因为在自然界中，无论是酚酸还是 酚酸的代谢产物，对微生物来说都是有毒性的，而在反应体系中加入水不溶性有机溶剂可 以及时将产物萃取进入有机相，从而降低产物抑制作用，因此，找到具有较好的有机溶剂耐 受性和催化效率，并能很好应用于两相反应体系的酚酸脱羧酶是很有必要的。
【发明内容】
[0006] 发明目的：针对现在工业化生产4-乙烯基酚类物质均为化学法，在香精香料及医 药行业中应用的不安全性等问题，本发明的目的在于提供一种对香豆酸脱羧酶BLPAD，有较 好的热稳定性，且对有机溶剂有较高的耐受性，能很好的满足生物法工业化生产4-乙烯基 酚类物质的要求。本发明的另一目的是提供所述对香豆酸脱羧酶的编码基因。本发明还有 一目的是提供上述对香豆酸脱羧酶的应用。
[0007] 技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
[0008] -种对香豆酸脱羧酶BLPAD，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0009] 所述对香豆酸脱羧酶BLPAD的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0010] 含有所述的对香豆酸脱羧酶BLPAD的编码基因的表达体系。
[0011] 所述的表达体系在表达对香豆酸脱羧酶BLPAD中的应用。
[0012] 所述的对香豆酸脱羧酶BLPAD在催化对香豆酸及阿魏酸生产4-乙烯基酚类物质 中的应用。
[0013] 所述的应用，包括以下步骤：
[0014] 1)在反应容器中加入Na2HPO4-Citric acid缓冲液和底物，37°C恒温震荡水浴锅 中预热5min ;
[0015] 2)加入对香豆酸脱羧酶BLPAD，并立即加入预先用pH6. 0的Na2HPO4-Cit ric acid 缓冲液饱和并预热的有机溶剂，200rpm，37°C震荡反应6h，加入50 μ L50%三氯乙酸溶液终 止反应；
[0016] 3)转移反应体系至离心管，lOOOOrpm，IOmin离心分离水相及有机相，分离获得产 物4-乙烯基酚类物质。
[0017] 酶与底物的用量关系为每1 μ mol底物对应使用1 μ g的酶。
[0018] 所述的底物为对香豆酸，有机溶剂为甲苯。
[0019] 所述的底物为阿魏酸，有机溶剂为环己烷。
[0020] 有机溶剂与底物的用量关系为I: I (v/v)。
[0021] 本发明从地衣芽孢杆菌（Bacillus Iicheniformis) 7172中克隆获得对香豆酸脱 羧酶BLPAD基因，并实现了其在大肠杆菌（BL21)中的高效异源表达并研究了其酶学特性， 具有较好的热稳定性及有机溶剂耐受性，是一种工业化应用的优质酶源。
[0022] 有益效果：与现有技术相比，本发明的对香豆酸脱羧酶是一种从地衣芽孢杆菌 7172中克隆得到的新的对香豆酸脱羧酶，其最适温度为37°C，最适pH为6. 0,具有良好的温 度和pH稳定性，并且具有很好的有机溶剂耐受性，因此其在工业化应用中具有良好的应用 前景。另外用其生产的4-乙烯基酚类物质为天然产品，能安全应用于食品及香精香料等行 业，弥补了化学法生产的不足。
【专利附图】
【附图说明】
[0023] 图1是纯化得到的对香豆酸脱羧酶BLPAD的12 % SDS-PAGE电泳图；图中，M : Marker ;1 :细胞破碎后上清液；2 :细胞破碎后沉淀；3 :BLPAD
[0024] 图2是对香豆酸脱羧酶BLPAD最适pH测定结果图；
[0025] 图3是对香豆酸脱羧酶BLPAD pH耐受性测定结果图；
[0026] 图4是对香豆酸脱羧酶BLPAD最适温度测定结果图；
[0027] 图5是对香豆酸脱羧酶BLPAD温度耐受性测定结果图。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0029] 以下实施例所使用的材料和试剂如下：
[0030] 菌株及载体：地衣芽孢杆菌（Bacillus Iichenformis) 7172为本实验室从堆肥中 筛选获得的菌株（CN103255084A)，大肠杆菌（E. coli DH5a及E. coli BL21)及表达载体 pET28b+ 购自 Novagen 公司。
[0031] 酶类及其它生化试剂：限制性内切酶、DNA聚合酶、连接酶和dNTP购自TaKaRa公 司；对香豆酸、阿魏酸、4-乙烯基苯酚和4-乙烯基愈创木酚购自Sigm a公司；其它都为国 产试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。
[0032] LB 培养基：Peptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g，加蒸馈水至 lOOOmL，pH 自 然（约为7)。固体培养基在此基础上加2. 0% (w/v)琼脂。
[0033] 以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》 (第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
[0034] 实施例1基因的克隆
[0035] 地衣芽孢杆菌总基因组的提取：从长好的地衣芽孢杆菌7172 LB平板上挑取单 菌落接种于含3mL LB液体培养基的灭菌试管中，37°C，200rpm震荡培养至饱和状态。取 I. 2mL培养物12000rpm，离心5min，去上清；加入570 μ L无菌水（或TE buffer)，用吸管 反复吹打使之重悬。加入10%的SDS和IOyL 20mg/mL蛋白酶K，混匀，37°C温育Ih(可 加入3yL溶菌酶）；加入IOOyL 5mol/L NaCl，充分混匀，再加入80yL CTAB/NaCl溶液 (CTAB/NaCl溶液：称取2. 922g NaCl，加60mL蒸馏水于磁力搅拌器上搅拌溶解，待完全溶解 后加入5g CTAB，加热到65°C继续搅拌至完全溶解，蒸馏水定容至IOOmL)，混匀，于60°C温 育IOmin,上下颠倒混勻，12000rpm，离心5min ;将上清转移至新的2mL离心管中，加入等体 积（约800 μ L)的酚：氯仿：异戊醇=25 :24 :1混匀，12000rpm，离心5min，将上层溶液转 移至新的离心管中，重复之前的酚仿抽提步骤一次；加入五分之三体积的异丙醇，轻轻混合 直至0嫩沉淀下来，静止1〇111；[11，12000印111，离心10111；[11，去上清 ；沉淀用11]11^75(%乙醇洗漆， 12000rpm,离心5min,去上清，重悬于30 μ L的无菌水（或TE buffer)中，一20°C保存。
[0036] 以提取好的地衣芽孢杆菌总基因组稀释100倍为模板，采用以下引物对进行PCR 扩增获得基因序列，引物对序列为：
[0037] 上游引物：CATGCCATGGTTATGAATCAAGATGTAAAAGAGTTTGTAGG，
[0038] 下游引物：CCGCTCGAGTACCCGCTTTCCTGCCCTGATGT，
[0039] PCR 体系：10 X Pfu buffer 2. 5 μ L，dNTP (2. 5mM) 2 μ L，模板 1 μ L，上游引物 0.5 4 1^，下游引物0.5 4 1^，？包0嫩口〇171116四86(1(^/^1^)0.5 4 1^，（1(1!12018 4 1^。
[0040] PCR反应参数设置为：94°C预变性2min ;94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸 2min ;30cycles ;72°C lOmin。
[0041] PCR产物经I. O %的琼脂糖凝胶电泳检测。使用思普金公司快速PCR产物纯化试剂 盒回收纯化扩增得到的含有双酶切位点的blpad基因片段。将该基因片段与载体pET28b+ 进行连接，转入大肠杆菌E. coli DH5ci扩增，然后送南京思普金生物科技有限公司测序。 测序结果显示，该基因全长501bp，命名为对香豆酸脱羧酶BLPAD基因，DNA序列见SEQ ID NO. 2,所表达的对香豆酸脱羧酶BLPAD氨基酸序列见SEQ ID NO. 1，其阅读框包含166个氨 基酸。理论分子量为19. 521kDa，理论等电点（pi)为5. 02。
[0042] 实施例2对香豆酸脱羧酶BLPAD在大肠杆菌E. coli BL21中的表达及纯化
[0043] 将测序正确的阳性克隆DH5a接种于3mL LBK液体培养基中，37°C，200rpm过夜 培养。重组表达质粒pET28b+-blpad的小量提取使用北京全式金生物技术有限公司的质 粒小提试剂盒（EasyPure Plasmid MiniPrep Kit)进行提取。将提取好的重组表达质粒 pET28b+-blpad转入大肠杆菌E. coli BL21，涂布含有30ug/mL的卡那霉素的平板筛选阳性 克隆，挑取阳性克隆接种于含有3mL LBK液体培养基的试管中，37°C，200rpm过夜培养；将 过夜培养的菌液按1 :50接入含有50mL灭菌的LBK液体培养基中，37°C，200rpm培养至0D_ 为0. 6左右；加入IPTG至终浓度为0. 5mM，28°C，200rpm诱导表达；诱导表达10小时后，将 菌液lOOOOrpm，IOmin离心，去上清液；加入4mL Lysis buffer重新悬浮；利用超声破碎法 进行菌体破碎，功率200-300W，超声时间为8秒，间隔为8秒，重复100次，lOOOOrpm，离心 IOmin,取上清；将上清液装入透析袋中，4?下在Lysis buffer中透析24小时，其间更换 2-3次透析液。酶液的纯化参照Ni-NTA Agarose(Qiagen)的方法。将纯化得到的蛋白利 用SDS-PAGE进行检测。结果如图1所示，可见重组对香豆酸脱羧酶在大肠杆菌中得到了表 达，经Ni-NTA Agarose纯化后为一条带，分子量约为20kDa。
[0044] 实施例3对香豆酸脱羧酶BLPAD的活性分析
[0045] 对香豆酸脱羧酶酶活的测定方法：将不加酶的反应体系（900 μ L的反应液，包含 5mM的对香豆酸（PCA)、ρΗ6· 0的200mM Na2HPO4-Citric acid缓冲液）置于37°C恒温水浴 锅中预热5 min，加入经过适当稀释的100 μ L的纯化的对香豆酸脱羧酶BLPAD (约1-2 μ g， 实施例2制备）于反应液中，反应5min后，加入2mL甲醇终止反应，0. 22 μ m微孔滤膜过滤 后进行HPLC分析。一个酶活单位：每分钟产生1 μ mol 4-乙烯基苯酚（4-VP)所需的酶量。
[0046] 1)对香豆酸脱羧酶BLPAD的最适pH和pH稳定性的测定
[0047] 酶的最适pH测定：将实施例2纯化得到的酶液在37°C下，以PCA为底物，在37°C 下分别测量酶在Na2HPO4-Citric acid缓冲液pH4. 0-8. 0中反应的活力。结果如图2所示， 表明BLPAD的最适pH为6. 0。
[0048] pH的耐受性测定：将纯化好的酶液（实施例2制备）在不同的pH条件下（广泛缓 冲液pH3. 0-12. 0)室温°C保存1小时，然后在37°C及pH 6. 0下进行酶促反应，以未处理的 酶液作为对照。以PCA为底物，反应5min测定对香豆酸脱羧酶BLPAD的酶活。经pH5. 0-9. O 的缓冲液处理24h，酶活剩余80%以上，如图3所示。
[0049] 2)对香豆酸脱羧酶BLPAD的最适温度和热稳定性的测定
[0050] 酶的最适温度测定：以对香豆酸（PCA)为底物，pH6. 0的Na2HPO4-Citric acid缓 冲液，分别在10-60°C的条件下测活力。酶的热稳定性测定：将同样酶量的酶液置于设定的 温度中（35°C、45°C、55°C下）保温0_90min。以PCA为底物，在最适温度和pH下测它们的 剩余活力，以未处理的酶液作为对照。结果表明：BLPAD的最适最适温度为37°C (图4)，在 35°C下放置90min还能保持90%以上的活性（图5)。
[0051] 3)对香豆酸脱羧酶BLPAD的有机溶剂耐受性
[0052] 酶的有机溶剂耐受性测定：将纯化好的酶液（实施例2制备）在不同浓度的有机 溶剂（20%，30%，50% )中25°C，200rpm振摇12小时，将酶液稀释以去除有机溶剂影响后 在37°C及pH 6.0下进行酶促反应，以相同条件处理但未加有机溶剂的酶液作为对照。以 PCA为底物，反应5min测定对香豆酸脱羧酶BLPAD的酶活。经九种有机溶剂处理后，除正癸 烷外经其余有机溶剂处理后酶活均能保留90%以上，如表1所示。
[0053] 表1对香豆酸脱羧酶BLPAD的有机溶剂耐受性结果
[0054]
【权利要求】
1. 一种对香豆酸脱羧酶BLPAD，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. 权利要求1所述对香豆酸脱羧酶BLPAD的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2 所示。
3. 含有权利要求2所述的对香豆酸脱羧酶BLPAD的编码基因的表达体系。
4. 权利要求3所述的表达体系在表达对香豆酸脱羧酶BLPAD中的应用。
5. 权利要求1所述的对香豆酸脱羧酶BLPAD在转化对香豆酸及阿魏酸生产4-乙烯基 酚类物质中的应用。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤： 1) 在反应容器中加入Na2HPO4-Citric acid缓冲液和底物，37°C恒温震荡水浴锅中预 热 5min ; 2) 加入对香豆酸脱羧酶BLPAD，并立即加入预先用pH6. 0的Na2HPO4-Citric acid缓冲 液饱和并预热的有机溶剂，200rpm，37°C震荡反应6h，加入50 μ L 50%三氯乙酸溶液终止反 应； 3) 转移反应体系至离心管，lOOOOrpm，IOmin离心分离水相及有机相，分离获得产物 4-乙烯基酚类物质。
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，酶与底物的用量关系为每1 μ mol底物对 应使用1 μ g的酶。
8. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的底物为对香豆酸，有机溶剂为甲 苯。
9. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的底物为阿魏酸，有机溶剂为环己 烧。
10. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，有机溶剂与底物的体积用量关系为1:1。
【文档编号】C12N9/88GK104212786SQ201410426053
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年8月26日 优先权日:2014年8月26日
【发明者】丁少军, 胡宏飞 申请人:南京林业大学