表达重组艾塞那肽的基因及其载体的制作方法
【专利摘要】本发明提供表达重组艾塞那肽的基因及其载体，以多基因串联的方式构建本发明所述的基因，其适于在表达载体中高效率稳定地表达重组艾塞那肽融合蛋白。
【专利说明】表达重组艾塞那肽的基因及其载体
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药工程【技术领域】，具体涉及一种表达重组艾塞那肽的基因及其 载体。
[0002] 本发明还涉及重组艾塞那肽的制备方法。
【背景技术】
[0003] 艾塞那肽（Exendin-4,降血糖药）是首个在美国获准上市用于治疗II型糖尿病的 肠促胰岛素分泌肽，是一个由39个氨基酸组成的多肽，能有效地控制II型糖尿病患者的血 糖。Exendin-4的作用机制包括促胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌、增加 β细胞质量、减 缓胃排空和抑制食欲等。艾塞那肽可以通过化学合成或基因重组的方法获得。
[0004] 目前，重组艾塞那肽的生产方法集中在采用单个艾塞那肽基因或单个融合蛋白基 因进行表达，属于单基因表达，所得融合蛋白经纯化、水解等工艺步骤后，获得重组艾塞那 肽。但对于艾塞那肽而言这种表达方式往往表达率低，造成艾塞那肽产量和纯度偏低，产业 化受到很大影响。所以，提高艾塞那肽表达率，对促进艾塞那肽产业化效率有重大意义。
[0005] 刘延杰等（生物技术，2011年，21(5))报道的利用艾塞那肽在大肠杆菌中的串联 表达，但由于文献采用的仅仅是艾塞那肽基因多拷贝重复，表达出的是一整条含有多个艾 塞那肽分子的蛋白链，该链经肠激酶水解得到分子量4773道尔顿的艾塞那肽分子，比分子 量4187道尔顿的天然艾塞那肽分子增加了 5个氨基酸，即在艾塞那肽分子的C端留存了肠 激酶位点（DDDDK)不能除去，因而其得到的不是真实的艾塞那肽，而是艾塞那肽的类似物。 事实上，这种串联设计方式所具有的缺陷是现有生物技术无法解决的。
[0006] 杨利军等报道的一种小肽的多顺反子串联表达方法（中国生物工程杂志，，2006 年，26(11))，在目的基因5'端设计SD序列和起始密码ATG，在目的基因3'端设计终止密 码，在每一顺反子前设计合适限制性DNA酶切位点使目的基因以三拷贝串联方式排列，每 一拷贝都有独立的起始密码和终止密码。顺反子之间有设计的SD序列，然后利用pet系列 表达载体对多顺反子串联基因进行表达，使表达产率有提高，但这种表达缺点是表达产物 的N端仍保留有蛋氨酸无法去掉，不能得到完全真实的目标蛋白。而且，因为表达的是细菌 外源蛋白，所以表达产物往往以包涵体形式存在，给后续纯化带来困难。
[0007] 金明飞等报道了一种基因串联原核高效表达胸腺肽α 1(中国生物工程杂志， 2007,27(1))的方法，通过人工合成含有SD序列、胸腺肽α?基因、纯化标签和酶切位点 的DNA序列作为构建元件，利用同尾酶将其依次克隆到pET-32a中，得到含有1?8个不 同重复数目的各自含SD序列基因的串联表达载体，表达蛋白经纯化后、酶切出多个胸腺肽 α 1。这种表达方式不但在每个串联的基因中不含有伴体蛋白分子，而且在将串联基因与 pet_32a质粒重组时，去掉了 pet_32a质粒中的硫氧还蛋白基因，所以表达出的是胸腺肽 α 1的串联体，而非融合蛋白。对于细菌来说，这种纯粹的外源多肽或蛋白，要么以分泌蛋白 形式分泌到胞外，要么以包涵体形式存在于胞内；如果以可溶的形式存在于胞内，就极易被 胞内的水解酶大量降解，造成表达率极低。事实上，对于艾塞那肽来说，在我们的一个实施 例中，以这种思路来设计，并没有表达成功。
【发明内容】
[0008] 本发明的一个目的是提供表达重组艾塞那肽的基因，以多基因串联的方式构建本 发明所述的基因，其适于在表达载体中高效率稳定地表达重组艾塞那肽融合蛋白。
[0009] 本发明的另一个目的是提供含有本发明表达重组艾塞那肽基因的表达载体，所述 表达载体优选为质粒载体。
[0010] 本发明也提供包含所述表达载体的宿主，所述宿主优选为大肠杆菌。
[0011] 本发明还提供一种重组艾塞那肽的制备方法，包括构建本发明所述的表达重组艾 塞那肽的基因，将所述基因转入表达载体，用所述表达载体转化宿主，培养所述转化的宿主 获得重组艾塞那肽融合蛋白，分离并纯化获得的融合蛋白。
[0012] 根据本发明的一方面，构建表达重组艾塞那肽的基因，一种表达重组艾塞那肽融 合蛋白的基因，具有由下述表达兀件串联组成的表达序列：
[0013] (M- Η- B- C一 D- E- F) - (L- S- Μ- Η- B- C一 D- E- F)n
[0014] 其中Μ为起始密码子；Η为编码his标签的核苷酸序列；B为编码伴体蛋白的核苷 酸序列；C为编码连接肽的核苷酸序列；D为编码肠激酶识别位点的核苷酸序列；E为编码 艾塞那肽的核苷酸序列；L为两个相邻融合蛋白基因之间的间隔核苷酸序列；S为SD序列； η为正整数；F为终止密码子；
[0015] 所述基因所表达的融合蛋白的特征为：每一个融合蛋白分子由一个起始氨基酸、 一个his标签、一个伴体蛋白分子、一个连接肽、一个肠激酶位点和一个艾塞那肽分子组 成。
[0016] 将上述基因串联后与质粒重组后，形成串联表达载体，表达载体转化到宿主细胞 中，通过发酵或细胞培养，产生融合蛋白。融合蛋白经层析、水解等工艺步骤，可纯化出高纯 度艾塞那肽，与天然艾塞那肽具有完全相同的氨基酸序列。
[0017] 在本发明中，融合蛋白是可溶性表达，而非包涵体表达。表达的融合蛋白位于细胞 内，并不分泌到细胞外。
[0018] 在已报道的艾塞那肽表达设计中，往往采用单个艾塞那肽基因或单个融合蛋白基 因进行表达。但艾塞那肽不同于其它多肽，对于艾塞那肽来说，这种单个基因的表达方式往 往表达率很低。本发明的设计是考虑到现有许多市售质粒都有一个强力启动子，在强力启 动子的作用下，基因的转录速度极快，能以极快的速度产生大量的mRNA分子，但是，由于翻 译速度跟不上，造成部分细胞内mRNA分子被降解，浪费细胞内资源，使得蛋白表达效率低 下，目标蛋白产量很少。因而，本发明将多个融合蛋白基因进行串联，串联后的多个基因受 同一启动子调控，转录出的mRNA具有多个核糖体结合位点和起始密码子，可以同时结合多 个核糖体并同时进行多个融合蛋白分子的翻译，使得融合蛋白的表达效率得到显著提高。
[0019] 在本发明中，表达出的融合蛋白分子由起始氨基酸即蛋氨酸、his标签、伴体蛋白、 连接肽、肠激酶位点、艾塞那肽6个部分组成。虽然设计了多个融合蛋白基因进行串联表 达，但每一个基因表达出的融合蛋白分子的氨基酸序列是完全相同的。
[0020] 本发明中伴体蛋白（或称分子伴侣、或分子伴侣蛋白）可以帮助艾塞那肽正确折 叠。更且，由于采用的伴体蛋白为细菌的一些自身蛋白，在翻译后的蛋白修饰中，细菌不会 将这种融合蛋白视为外源蛋白而酶解之，所以，可有效地减少艾塞那肽在细胞内降解，维持 艾塞那肽结构稳定。优选的伴体蛋白为细菌硫氧还蛋白（TRX)
[0021] 本发明中设计了 his标签作为纯化标签，his标签是由4?10个组氨酸构成一段 序列，可以与金属离子，如镍离子或锌离子有高亲和力，所以利用金属离子亲和层析可有效 对融合蛋白进行纯化。
[0022] 本发明设计了肠激酶识别位点，即天冬氨酸一天冬氨酸一天冬氨酸一天冬氨酸一 赖氨酸，即DDDDK五个氨基酸，肠激酶的高度专一性水解能力可保证艾塞那肽N端正确性， 使重组艾塞那肽与天然艾塞那肽具有完全相同的氨基酸序列。
[0023] 本发明中的连接肽是由多个甘氨酸和丝氨酸交替相连构成，优选的氨基酸数为 5?10个，其意义在于可以让伴体蛋白更有效地促进艾塞那肽折叠以及使肠激酶位点更好 地暴露。
[0024] 在本发明中，由于转录出的mRNA在翻译时，可以让一个以上的核糖体同时结合到 mRNA分子上，为了让相邻核糖体有充分的间隔，所以设计了 L序列作为间隔序列，以减少相 互之间的干扰。L序列的设计是利用了 pet22b质粒中T7启动子和乳糖操纵子之后，SD序 列之前的一段序列，该序列为TCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTT。
[0025] 在本发明中，串联了多个融合表达基因，除第一融合蛋白基因外，后续的每个融合 蛋白基因前面都设计有SD序列。在本发明中，SD序列为AAGAAGGAGA，SD序列可以有多个 选择，但本发明中的SD序列中的AAGGAG是最强的核糖体结合位点，有利于多个核糖体与 mRNA的结合。SD序列是细菌mRNA起始密码子AUG上游5?10个碱基左右处的一段富含 嘌呤的碱基序列，它能与细菌16SrRNA3'端识别，帮助从起始AUG处开始翻译，它是1974年 由J. Shine和L. Dalgarno发现的，故此而命名。由于市售表达载体都设计有SD序列，故在 本发明中，第一个融合蛋白基因前面没有特别设计SD序列，而是直接利用质粒的SD序列。 这是因为考虑到多数载体的多克隆位点设计在SD序列之后，因而这种设计思路更利于串 联基因与表达载体的重组工作。
[0026] 每个融合蛋白基因都有自己的起始密码子ATG，因而在多个核糖体同时结合到 mRNA后，可同时分别独立进行多个融合蛋白分子的翻译，提高融合蛋白的表达效率。
[0027] 本发明将多个融合蛋白基因进行串联，串联后的多个基因受同一启动子调控，转 录出的mRNA具有多个核糖体结合位点和起始密码子，可以同时结合多个核糖体并同时进 行多个融合蛋白分子的翻译，使得融合蛋白的可溶性表达效率得到显著提高。融合蛋白经 层析、水解等工艺步骤，可纯化出高纯度艾塞那肽，与天然艾塞那肽氨基酸序列完全相同。
【具体实施方式】
[0028] 以下结合实施例对本发明重组艾塞那肽的制备方法进行详细描述。所用的所有实 验试剂和仪器设备，如无特别说明均为普通市售。
[0029] 设计多个融合蛋白基因进行串联表达，串联后的多个基因受同一启动子调控，其 串联表达方案设计为：
[0030] (M- Η- B- C一 D- E- F) - (L- S- Μ- Η- B- C一 D- E- F)n
[0031] 其中Μ为起始密码子ATG，Η为编码his标签（例如his标签）的核酸序列；B为编 码伴体蛋白的核酸序列；C为编码连接肽的核酸序列；D为编码肠激酶识别位点（即DDDDK) 的核酸序列；E为编码艾塞那肽的核酸序列；L为两个相邻融合蛋白基因之间的间隔核酸序 列；S为SD序列；η为正整数。F为终止密码子。
[0032] 在上述串联序列两端引入相应的粘性末端，全部序列可以通过人工合成的方式获 得，众多基因公司从事该类服务。
[0033] 合成后上述串联基因与质粒进行重组，重组质粒可通过市售获得。将重组后的质 粒转化到感受态细胞中，通过细胞培养、发酵和诱导表达，通过电泳等技术手段，可以检查 融合蛋白表达率。
[0034] 所表达的融合蛋白的特征为：每一个融合蛋白分子由一个起始氨基酸（即蛋氨 酸）、一个his标签、一个伴体蛋白分子、一个连接肽、一个肠激酶位点、一个艾塞那肽分子6 个部分组成。
[0035] 因为设计融合蛋白是可溶性表达，且所表达的融合蛋白位于细胞内。所以，通过离 心处理，收集细胞，通过将细胞破碎使融合蛋白从细胞中释放出来，再经澄清处理，得到含 融合蛋白澄清液体。
[0036] 采用金属离子亲和层析，超滤、肠激酶水解、去除伴体蛋白、反相层析、去除有机溶 剂等工艺步骤，可纯化出高纯度艾塞那肽，与天然艾塞那肽具有完全相同的氨基酸序列。
[0037] 将多个融合蛋白基因进行串联，串联后的多个基因受同一启动子调控，转录出的 mRNA具有多个核糖体结合位点和起始密码子，可以同时结合多个核糖体并同时进行多个融 合蛋白分子的翻译，使得融合蛋白的可溶性表达效率得到显著提高。融合蛋白经层析、水解 等工艺步骤，可纯化出高纯度艾塞那肽，与天然艾塞那肽氨基酸序列完全相同。
[0038] pet系列质粒、大肠杆菌BL21 (DE3)购自MERCK公司，基因合成及质粒的测序委托 生工生物工程（上海）有限公司合成，T4DNA连接酶、DNA限制性内切酶Nde I和Xho I购 自生工生物工程（上海）有限公司，胶回收试剂购自宝生物工程（大连）有限公司。
[0039] 【实施例1】-个融合蛋白某因串联表汰载体的构建
[0040] 1、设计方案
[0041] 本实施例设计方案为下式：
[0042] (M- Η- B- C一 D- E- F) - (L- S- Μ- Η- B- C一 D- E- F)
[0043] 其中Μ为起始密码子ATG，H为编码his标签（6个组氨酸组成）的核酸序列；Β为 编码伴体蛋白（硫氧还蛋白，TRX)的核酸序列；C为编码连接肽（5肽，GSGSG)的核酸序列； D为编码肠激酶识别位点（DDDDK)的核酸序列；E为编码艾塞那肽的核酸序列；L为两个相 邻融合蛋白基因之间的间隔核酸序列；S为SD序列；F为终止密码子。
[0044] 2、方法
[0045] (1)融合蛋白串联表达基因
[0046] 人工合成如上述方案所示的两个融合蛋白基因全序列；在序列中含Ndel和Xho I 酶切位点（分别为CATATG和CTCGAG)作为粘性末端，每个基因都含有自己的起始密码子和 终止密码子，两个基因之间有间隔序列，第二个基因含有自己的SD序列，而第一个基因则 利用质粒所带的SD序列。序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0047] (2)重组质粒的构建
[0048] 将合成的上述序列的基因用Nde I和Xho I双酶切后，回收DNA片段，然后与经 Nde I和Xho I双酶切的pet_22b(+)质粒连接，构建出两个融合蛋白串联表达质粒。
[0049] (3)将上述融合表达质粒转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中，以氨苄青霉素为选择标 记，筛选出转化子并进行酶切鉴定。
[0050] (4)将重组质粒测序，结果表明所构建的表达载体正确。
[0051] (5)保存菌种，建立种子库，获得生产重组艾塞那肽的工程菌。
[0052] 【实施例2】三个融合蛋白某闵串联表汰载体的构律
[0053] 1、设计方案
[0054] 本实施例设计方案为下式：
[0055] (M- Η- B- C一 D- E- F) - (L- S- Μ- Η- B- C一 D- E- F)2
[0056] 其中Μ为起始密码子ATG，H为编码his标签（8个组氨酸组成）的核酸序列；B为 编码伴体蛋白（硫氧还蛋白，TRX)的核酸序列；C为编码连接肽（10肽，GSGSGSGSGS)的核 酸序列；D为编码肠激酶识别位点（DDDDK)的核酸序列；E为编码艾塞那肽的核酸序列；L为 两个相邻融合蛋白基因之间的间隔核酸序列；S为SD序列；F为终止密码子。序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0057] 2、方法
[0058] (1)融合蛋白串联表达基因
[0059] 人工合成如上述方案所示的三个融合蛋白基因全序列；在序列中含Ndel和Xho I 酶切位点（分别为CATATG和CTCGAG)作为粘性末端，每个基因都含有自己的起始密码子和 终止密码子，两个相邻基因之间有间隔序列，第2、第3个基因含有自己的SD序列，而第一个 基因则利用质粒所带的SD序列。序列如SEQ ID N0. 2所示。
[0060] (2)重组质粒的构建
[0061] 将合成的上述序列的基因用Nde I和Xho I双酶切后，回收DNA片段，然后与经 Nde I和Xho I双酶切的pet-22b(+)质粒连接，构建出3个融合蛋白的串联表达质粒。
[0062] (3)将上述融合表达质粒转化到大肠杆菌大肠杆菌BL21 (DE3)中，以氨苄青霉素 为选择标记，筛选出转化子并进行酶切鉴定。
[0063] (4)将重组质粒测序，结果表明所构建的表达载体正确。
[0064] (5)保存菌种，建立种子库，获得生产重组艾塞那肽的工程菌。
[0065] 【实施例3】四个融合蛋白某闵串联表汰载体的构律
[0066] 1、设计方案
[0067] 本实施例设计方案为下式：
[0068] (M- Η- B- C一 D- E- F)- (L- S- Μ- Η- B- C一 D- E- F)3
[0069] 其中Μ为起始密码子ATG，H为编码his标签（8个组氨酸组成）的核酸序列；B为 编码伴体蛋白（硫氧还蛋白，TRX)的核酸序列；C为编码连接肽（10肽，GSGSGSGSGS)的核 酸序列；D为编码肠激酶识别位点（DDDDK)的核酸序列；E为编码艾塞那肽的核酸序列；L为 两个相邻融合蛋白基因之间的间隔核酸序列；S为SD序列；F为终止密码子。
[0070] 2、方法
[0071] (1)融合蛋白串联表达基因
[0072] 人工合成如上述方案所示的四个融合蛋白基因全序列；在序列中含Ndel和Xho I 酶切位点（分别为CATATG和CTCGAG)作为粘性末端，每个基因都含有自己的起始密码子和 终止密码子，两个相邻基因之间有间隔序列，第2、第3、第4个基因含有自己的SD序列，而 第一个基因则利用质粒所带的SD序列。序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0073] (2)重组质粒的构建
[0074] 将合成的上述序列的基因用Nde I和Xho I双酶切后，回收DNA片段，然后与经 Nde I和Xho I双酶切的pet-22b(+)质粒连接，构建出4个融合蛋白的串联表达质粒。 [0075] (3)将上述融合表达质粒转化到大肠杆菌大肠杆菌BL21 (DE3)中，以氨苄青霉素 为选择标记，筛选出转化子并进行酶切鉴定。
[0076] (4)将重组质粒测序，结果表明所构建的表达载体正确。
[0077] (5)保存菌种，建立种子库，获得生产重组艾塞那肽的工程菌。
[0078] 【实施例4】单个融合蛋白某闵表汰载体的构律（非串联表汰）
[0079] 1、设计方案
[0080] 本实施例设计方案为下式：
[0081] (Μ-Η-B-C-D-E-F)
[0082] 其中Μ为起始密码子ATG，H为编码his标签（6个组氨酸组成）的核酸序列；B为 编码伴体蛋白（硫氧还蛋白，TRX)的核酸序列；C为编码连接肽（5肽，GSGSG)的核酸序列； D为编码肠激酶识别位点（DDDDK)的核酸序列；E为编码艾塞那肽的核酸序列；L为两个相 邻融合蛋白基因之间的间隔核酸序列；S为SD序列；F为终止密码子。
[0083] 2、方法
[0084] (1)融合蛋白基因
[0085] 人工合成如上述方案所示的融合蛋白基因全序列；在序列中含Ndel和Xho I酶切 位点（分别为CATATG和CTCGAG)作为粘性末端。序列如SEQ ID N0. 4所示。
[0086] (2)重组质粒的构建
[0087] 将合成的上述序列的基因用Nde I和Xho I双酶切后，回收DNA片段，然后与经 Nde I和Xho I双酶切的pet_22b(+)质粒连接，构建出单个融合蛋白表达质粒。
[0088] (3)将上述融合表达质粒转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中，以氨苄青霉素为选择标 记，筛选出转化子并进行酶切鉴定。
[0089] (4)将重组质粒测序，结果表明所构建的表达载体正确。
[0090] (5)保存菌种，建立种子库，获得生产重组艾塞那肽的工程菌。
[0091] 【实施例5】两个t塞那狀某闵串联，毎个某闵有自己的SD序列，t塞那狀某闵没 有和伴体蛋白某闵融合
[0092] 1、设计方案
[0093] 本实施例设计方案为下式：
[0094] (M- Η- C一 D- E- F)- (L- S- Μ- Η- C一 D- E- F)
[0095] 其中Μ为起始密码子ATG，H为编码his标签（6个组氨酸组成）的核酸序列；C为 编码连接肽（5肽，GSGSG)的核酸序列；D为编码肠激酶识别位点（DDDDK)的核酸序列；E为 编码艾塞那肽的核酸序列；L为两个相邻融合蛋白基因之间的间隔核酸序列；S为SD序列； F为终止密码子。
[0096] 2、方法
[0097] (1)融合蛋白串联表达基因
[0098] 人工合成如上述方案所示的两个融合蛋白基因全序列；在序列中含Ndel和Xho I 酶切位点（分别为CATATG和CTCGAG)作为粘性末端，每个基因都含有自己的起始密码子和 终止密码子，两个基因之间有间隔序列，第二个基因含有自己的SD序列，而第一个基因则 利用质粒所带的SD序列。序列如SEQ ID NO. 5所示。
[0099] (2)重组质粒的构建
[0100] 将合成的上述序列的基因用Nde I和Xho I双酶切后，回收DNA片段，然后与经 Nde I和Xho I双酶切的pet_22b(+)质粒连接，构建出两个融合蛋白串联表达质粒。
[0101] (3)将上述融合表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，以氨苄青霉素为选择标 记，筛选出转化子并进行酶切鉴定。
[0102] (4)将重组质粒测序，结果表明所构建的表达载体正确。
[0103] (5)保存菌种，建立种子库，获得生产重组艾塞那肽的工程菌。
[0104] 【实施例6】不同基因设计方案表达效果比较
[0105]
【权利要求】
1. 一种表达重组艾塞那肽融合蛋白的基因，具有由下述表达元件串联组成的表达序 列： (M- Η- B- C一 D- E- F) - (L- S- Μ- Η- B- C一 D- E- F) n 其中Μ为起始密码子；Η为编码his标签的核苷酸序列；B为编码伴体蛋白的核苷酸序 列；C为编码连接肽的核苷酸序列；D为编码肠激酶识别位点的核苷酸序列；E为编码艾塞 那肽的核苷酸序列；L为两个相邻融合蛋白基因之间的间隔核苷酸序列；S为SD序列；η为 正整数；F为终止密码子； 所述基因所表达的融合蛋白的特征为：每一个融合蛋白分子由一个起始氨基酸、一个 his标签、一个伴体蛋白分子、一个连接肽、一个肠激酶位点和一个艾塞那肽分子组成。
2. 权利要求1所述表达重组艾塞那肽融合蛋白的基因，其特征在于，所述表达序列中： Μ为ATG ;H为编码6?10个组氨酸的核苷酸序列；B为编码细菌硫氧还蛋白的核苷酸序列； C为编码5?10个甘氨酸和丝氨酸交替相连的核苷酸序列；D为编码DDDDK的核苷酸序列； η为1-3的正整数。
3. 权利要求1所述的表达重组艾塞那肽融合蛋白的基因，其具有SEQ ID NO. 1?3所 述的核苷酸序列。
4. 含有权利要求1所述的表达重组艾塞那肽融合蛋白的基因的表达载体。
5. 权利要求4所述的表达载体，其特征在于所述表达载体为质粒载体。
6. 权利要求5所述的表达载体，其特征在于所述质粒载体为pet-22b(+)质粒。
7. 含有权利要求1所述的表达重组艾塞那肽融合蛋白的基因的宿主。
8. 权利要求7所述的宿主，其特征在于所述宿主为大肠杆菌BL21 (DE3)。
9. 一种表达重组艾塞那肽融合蛋白的工程菌，其为由含有权利要求1所述的表达重组 艾塞那肽融合蛋白的基因的质粒载体转化的大肠杆菌。
10. -种制备重组艾塞那肽的方法，包括下述步骤： 1) 构建权利要求1所述的表达重组艾塞那肽融合蛋白的基因； 2) 将上述基因与质粒重组，形成串联表达载体； 3) 将所述表达载体转化到宿主细胞中，通过发酵或细胞培养，产生融合蛋白； 4) 分离并纯化获得的融合蛋白，获得重组艾塞那肽。
【文档编号】C12N15/62GK104232666SQ201410440406
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月1日 优先权日:2014年9月1日
【发明者】蒋为民, 高琰, 柴向东, 桂春华, 邓哲, 罗娟, 胡文娟, 吴春燕 申请人:江苏海王生物制药有限公司