包含葡萄糖启动子的载体、宿主菌以及重组牛源胰蛋白酶的制备方法

包含葡萄糖启动子的载体、宿主菌以及重组牛源胰蛋白酶的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种在毕赤酵母中通过基因重组的手段异源表达牛源胰蛋白酶原基因的方法，该重组牛胰蛋白酶原通过采用新型启动子在毕赤酵母中表达并分泌到培养基中，酶原通过自激活、肠激酶或胰蛋白酶等处理可制备活性牛胰蛋白酶，由此制备的活性牛胰蛋白酶可用于生产重组人胰岛素及人胰岛素类似物。此方法可避免组成型启动子三磷酸甘油醛脱氢酶(GAP)启动子和诱导型启动子醇氧化酶(AOX1)启动子的缺点。
【专利说明】包含葡萄糖启动子的载体、宿主菌以及重组牛源胰蛋白酶 的制备方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种重组表达牛源胰蛋白酶的基因工程菌及其构建方法与应用。具体 地，涉及一种采用新型启动子启动牛源胰蛋白酶表达的基因工程菌的构建方法与应用。

【背景技术】
[0002] 胰蛋白酶（TRYPSIN，EC 3. 4. 21. 4)在脊椎动物中，作为消化酶而起作用。胰蛋白 酶是由胰腺分泌的一种内肽酶，最初分泌物为胰蛋白酶原，受肠激酶或胰蛋白酶的限制分 解成为活化胰蛋白酶，是肽链内切酶。主要作用于精氨酸或赖氨酸羧基端的肽键。它不仅起 消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活 化作用。是特异性最强的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少的工具。 其中牛胰脏来源的胰蛋白酶氨基酸残基223个，分子量为23. 3kDa，活性部位的丝氨酸残基 是不可缺少的丝氨酸蛋白酶。
[0003] 胰蛋白酶在临床上用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤、瘘管等所产生的 局部水肿、血肿及脓肿等。喷雾吸入，用于呼吸道疾病。也可用于治疗毒蛇咬伤。还常用于 动物细胞培养前对组织的处理。在基因工程领域，胰蛋白酶也获得了越来越广泛的应用，特 别在重组人胰岛素及人胰岛素类似物的生产过程中，胰蛋白酶为不可或缺的酶，其比活性 的高低及稳定性是影响胰岛素原活化收率的一个至关重要的参数。牛源胰蛋白酶作为切割 第三代胰岛素的有效工具酶被广泛研究。
[0004] 目前制备胰蛋白酶的方法主要有两类：一是提取自动物如猪、牛的胰脏，因其方法 相对简单，被广泛采用，但是该方法因不能完全除去其他蛋白质，且产品中的动物源病毒如 口蹄疫病毒、疯牛病病毒等不能完全除去，因此其应用存在一定的局限性及风险性；二是生 产重组胰蛋白酶，多以猪源性胰蛋白酶为多，牛源性几乎没有，仅见美国礼来和江苏万邦以 大肠杆菌表达的包涵体复性的牛胰蛋白酶和印度拜康以毕赤酵母发酵的杂合牛胰蛋白酶 的专利。
[0005] 本方法以酵母为宿主制备牛源胰蛋白酶，优势在于：酵母的真核表达系统所产生 的胰蛋白酶结构正确，产量较高，且是以分泌表达的方式存在于培养基中，培养基的成分有 利于胰蛋白酶的稳定性，且有利于纯化；本方法采用新型启动子通过加入葡萄糖诱导牛源 胰蛋白酶的表达，由于胰蛋白酶的表达具有毒性，此方法避免了组成型启动子三磷酸甘油 醛脱氢酶（GAP)启动子不需要诱导就可直接表达对细胞的伤害作用，也避免了醇氧化酶启 动子（A0X1)诱导需要甲醇，甲醇易燃易爆及对健康有害的缺点。


【发明内容】

[0006] 为克服现有技术表达表达牛源胰蛋白酶所用的GAP启动子和A0X1启动子的缺陷， 本发明涉及一种表达牛源胰蛋白酶的新型启动子，所述启动子为葡萄糖启动子。
[0007] 本发明的另一目的是提供一种酵母表达载体，所述酵母表达载体包括启动子及目 的基因，所述启动子为葡萄糖启动子，所述目的基因为编码牛胰蛋白酶的核苷酸序列，所述 葡萄糖启动子与所述目的基因构成一个表达盒，所述的表达盒可以通过体外构建或抗生素 浓度及遗传霉素浓度筛选多拷贝。
[0008] 本发明中，所述葡糖糖启动子，可以是选自PG1或PG6葡萄糖启动子，优选为PG6 葡萄糖启动子，所述PG6葡萄糖启动子具有SEQ ID NO. 1所述的部分或全部核苷酸序列，所 述编码牛胰蛋白酶的核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示，其编码的牛源胰蛋白酶的氨基酸序 列如SEQ ID N0. 3所示。
[0009] 为了在后续纯化牛源胰蛋白酶是更为简化，本发明中，在所述编码牛胰蛋白酶的 核苷酸序列的C端加入6个组氨酸作为纯化标签。
[0010] 本发明中，所述酵母表达载体为能够用以表达外源蛋白的穿梭载体，这些能够用 以表达外源蛋白的穿梭载体均含有表达外源蛋白所必需的元件，优选以pPIC9K、pPIC3. 5K、 pPICZ a A、pPICZ α B、pPICZ a C、pPICZA、pPICZB、pPICZC 或 pA0815 为基础改造的载体，所 述改造的酵母表达载体包含所述葡萄糖启动子和编码牛胰蛋白酶的核苷酸序列。
[0011] 进一步地，所述酵母表达载体为具有筛选标记的酵母表达载体，优选地，所述酵母 表达载体的筛选标记为zeocin、geneticin或his。
[0012] 本发明的另一目的，在于提供一种含有本发明所述酵母表达载体的宿主菌，其中 所述宿主为酵母菌，优选毕赤酵母，更优选为毕赤酵母GS115。含有本发明所述表达载体的 宿主菌，其可以是至少含有一种改造的酵母表达载体，如在一个宿主菌中，可以是只包括含 有一种筛选标记并含有编码牛源胰蛋白酶的基因，此时的宿主菌，为含有一种改造的酵母 表达载体；或者，在所述宿主菌中，也可以是包括两种筛选标记并含有编码牛源胰蛋白酶的 基因，此时的宿主菌，为含有两种改造的酵母表达载体。
[0013] 本发明的还一目的，在于提供一种制备重组牛胰蛋白酶的方法，所述方法包括： (1)以葡萄糖作为唯一碳源，诱导本发明用以所述宿主菌表达C端带有组氨酸标签的牛胰 蛋白酶原；（2)通过自激活、肠激酶或胰蛋白酶处理上述牛胰蛋白酶原，生成牛胰蛋白酶； (3)以镍柱亲和一步纯化法纯化所得牛胰蛋白酶，纯化中洗脱液通过梯度为20mM至250mM 的咪唑溶液洗脱目的蛋白。
[0014] 具体地，以酵母作为宿主并采用葡萄糖启动子制备重组牛胰蛋白酶的方法，该方 法包括：
[0015] 1、提供编码葡萄糖启动子的核苷酸序列；
[0016] 2、提供编码牛胰蛋白酶原的核苷酸序列；
[0017] 3、将上述启动子和目的基因构建成表达盒，代替其他启动子表达盒克隆到不同筛 选标记的酵母表达载体中；
[0018] 4、将上述载体转化至同一酵母宿主；
[0019] 5、诱导上述酵母宿主表达C端带有组氨酸标签（His tag)的牛胰蛋白酶原；
[0020] 6、通过自激活、肠激酶或胰蛋白酶处理上述牛胰蛋白酶原，生成牛胰蛋白酶；
[0021] 7、纯化上述牛胰蛋白酶。
[0022] 优选地，步骤1中所述的葡萄糖启动子的序列来源于毕赤酵母菌；
[0023] 步骤2中所述编码牛胰蛋白酶原的核苷酸序列可以根据所用宿主的密码子偏好 性来确定，以增加宿主的表达效率。该方法为本领域技术人员所公知的技术，具体地密码子 优化由基因合成公司确定（本专利中核苷酸序列由金唯智公司按毕赤酵母密码子偏好优 化并合成）。
[0024] 步骤3中的所述酵母表达载体框架可以为任意一种具有筛选标记的酵母表达载 体框架，优选地，所述酵母表达载体的筛选标记为zeocin、geneticin、his等。
[0025] 步骤4中的所述酵母宿主作为一种真核表达系统，能够直接表达构象正确的目的 蛋白，无需后续的变性和复性过程。因此本发明的方法对酵母宿主的种类没有任何限制，优 选的酵母菌株可为汉逊酵母、毕赤酵母、假丝酵母、光滑球拟酵母等，更优选的酵母菌株为 毕赤酵母。
[0026] 步骤5中的诱导酵母宿主表达蛋白的方法采用葡萄糖作为唯一碳源诱导目的蛋 白的表达。优选地，葡萄糖的诱导终浓度达到〇. 002g_10g/L，更优选的，葡萄糖的诱导终浓 度达到lg/L。
[0027] 步骤6中的自激活、肠激酶或胰蛋白酶切方法是本领域技术人员所公知的，
[0028] 步骤7中的纯化带有组氨酸标签的蛋白质的技术和方法是本领域技术人员所公 知的。本发明的纯化方法优选采用镍柱亲和一步纯化法进行，并通过梯度为20mM至250mM 的咪唑溶液来洗脱目的蛋白。
[0029] 步骤6中的所述酶切和步骤7中的所述纯化过程可以顺序进行，也可以同时进行。
[0030] 本发明制备牛胰蛋白酶的方法具有以下优点：
[0031] 1.采用新型启动子启动目的基因牛源胰蛋白酶的表达，避免组成型启动子不需要 诱导就可表达牛源胰蛋白酶进而对细胞具有毒性和醇氧化酶启动子利用甲醇诱导存在易 燃易爆并对健康有害的缺点。
[0032] 2、在酵母真核表达系统中进行重组表达，表达产物牛胰蛋白酶原无需经过变性和 复性，在直接酶切去除前肽后即可得到有活性的牛胰蛋白酶。
[0033] 3、表达生成C端带有组氨酸标签（His tag)的牛胰蛋白酶原，使得在后续的酶切 和亲和纯化过程中，能够使纯化产物（牛胰蛋白酶）保留在洗脱液中，纯化产物体积小，不 需后续浓缩步骤。
[0034] 4.纯化简单，利用his标签一步纯化即可得到产品。
[0035] 5.如根据酵母偏好密码子提供编码牛胰蛋白酶原的核苷酸序列，还可以进一步提 高表达量。
[0036] 6.如在诱导表达过程中使葡萄糖的终浓度达到lg/L，能够更高效的表达牛胰蛋 白酶原。

【专利附图】

【附图说明】
[0037] 图1 :重组BT的Western Blot检测图，图中A泳道为牛胰蛋白酶活化后纯化 SDS-PAGE，B泳道为培养液上清牛胰蛋白酶原纯化，经活化后牛胰蛋白酶分子量明显小于酶 原。
[0038] 图2 :重组BT的SDS-PAGE电泳检测图，A泳道为20度诱导分泌上清，B泳道为28 度诱导分泌上清，从WB图可以看出20度诱导较28度诱导可以获得更多的目标产物。

【具体实施方式】
[0039] 材料:
[0040] 菌株和质粒：克隆菌种Escherichia coli (T0P10)是基因工程常用菌种；巴斯德 毕赤酵母（Pichia pastoris)GS-115、KM-71、KM-71H、X-33、SMD-1168、SMD-1168-H ;质粒 pPIC9K、pPIC3. 5K、pPICZ a A、pPICZ α B、pPICZ a C、pPICZA、pPICZB、pPICZC、pA0815 购于 invitrogen 公司。
[0041] 酶和试剂：
[0042] 实施例中涉及分子生物学操作所用的限制性内切酶均购于NEB公司，所用的基因 扩增酶购自北京全式金公司，连接酶购自宝生物公司，相应的操作步骤完全按照相关的产 品说明书进行。
[0043] 琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自OMEGA公司、酵母DNA提取试剂盒购 自北京天根公司，相应的操作步骤完全按照相关的产品说明书进行。
[0044] 实施例中所涉及的编码牛胰蛋白酶原的核苷酸序列的合成、引物的合成和DNA的 测序由金唯智公司完成。
[0045] TAME 购于 sigma 公司。
[0046] Zeocin 购于 invitrogen 公司。
[0047] Anti-trypsin (Rabbit)购自 Abeam 公司。
[0048] Donkey anti Rabbit二抗购自北京博奥森公司
[0049] 培养基：
[0050] LB、YPD、MD、YPDS、BMGY、BMMY
[0051] 抗性培养基为相应培养基加相应抗生素或遗传霉素，如：Ampicillin、Zeocin、 G418。
[0052] 以上培养基是基因工程领域常用培养基，各培养基的配方可参见分子克隆第三版 下册附录2以及invitrogen公司的毕赤酵母操作手册（Multi-Copy Pichia Expression Kit)第 64 页-第 70 页；及 pPICZ a A、B and C 第 17-第 18 页。
[0053] 方法:
[0054] 聚合酶链反应，PCR产物纯化，基因和质粒的酶切、回收、连接和转化，以及大 肠杆菌转化子的筛选，鉴定，这些基因工程常规操作方法，可参见Sambrook J，Fristsh EF, Maniatis T. MolecularCloning ；A Laboiatory Manual 2nd ed.NY:Cold Spring Harbor Laboratory Piess, 1989, pp. 16-340。重组酵母表达载体质粒的线性化，酵母转 化，转化子的筛选、诱导表达以及表达鉴定，可参见invitrogen公司的毕赤酵母操作手册 (Multi-Copy Pichia Expression Kit)第 32 页-第 63 页。及pPICZ aA、B and C第 9-第 14页。
[0055] 实施例1巴斯德毕赤酵母基因组的提取及PG6启动子的扩增
[0056] 1.将Pichia pastoris X33划线到YPD固体培养基上，30°C培养2天后挑单菌落 接种到Yro液体培养基，培养1天后，按天根公司酵母基因组试剂盒说明书提取基因组。
[0057] 2.以步骤1中提取的基因组为模板，以设计的两条引物为上下游引物，扩增PG6启 动子。
[0058] PG6-F ：CGAAGATCTAGACCAGCAGTTTAACTACG(划线处为 BglII 限制性内切酶）
[0059] PG6-R :CCTGCCTTCGAACTTTTCTTTGGGCAAGGAAA (划线处为 BstBI 限制性内切酶）
[0060] PCR反应体系：
[0061]

【权利要求】
1. 一种酵母表达载体，所述酵母表达载体包括启动子及目的基因，所述启动子为葡萄 糖启动子，所述目的基因为编码牛胰蛋白酶的核苷酸序列。
2. 根据权利要求1所述的表达载体，其中所述启动子与所述目的基因构成一个表达 盒。
3. 根据权利要求1所述的酵母表达载体，其中所述葡萄糖启动子为PG6启动子。
4. 根据权利要求3所述的酵母表达载体，其中所述PG6启动子的核苷酸序列为SEQ ID No. 1的部分或全部核苷酸序列。
5. 根据权利要求1所述的酵母表达载体，所述编码牛胰蛋白酶的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
6. 根据权利要求5所述的酵母表达载体，其中所述编码牛胰蛋白酶的核苷酸序列进一 步在C端加入6个组氨酸作为纯化标签。
7. 根据权利要求1-6中任一权利要求所述的酵母表达载体，其中所述酵母表达载体 为能够用以表达外源蛋白的穿梭载体，这些酵母表达载体均含有表达外源蛋白所必需的元 件，优选以 PPIC9K、pPIC3. 5K、pPICZ a A、pPICZ α B、pPICZ a C、pPICZA、pPICZB、pPICZC 或 pA0815为基础改造的载体，所述改造的酵母表达载体包含所述葡萄糖启动子和编码牛胰蛋 白酶的核苷酸序列。
8. 根据权利要求7所述酵母表达载体，所述酵母表达载体为具有筛选标记的酵母表达 载体，优选地，所述酵母表达载体的筛选标记为zeocin、geneticin或his。
9. 含有权利要求1至8中任一权利要求所述的宿主菌。
10. 根据权利要求8所述的宿主菌，其中所述宿主为酵母菌，优选毕赤酵母，更优选为 毕赤酵母GS115,所述宿主包含至少一种所述表达载体。
11. 制备重组牛胰蛋白酶的方法，所述方法包括：（1)以葡萄糖作为唯一碳源，诱导权 利要求10所述宿主菌表达C端带有组氨酸标签的牛胰蛋白酶原；（2)通过自激活、肠激酶 或胰蛋白酶处理上述牛胰蛋白酶原，生成牛胰蛋白酶；（3)以镍柱亲和一步纯化法纯化所 得牛胰蛋白酶，纯化中洗脱液通过梯度为20mM至250mM的咪唑溶液洗脱目的蛋白。
12. 权利要求11所述方法，所述的葡萄糖终浓度为0. 002g-10g/L，优选的为lg/L ;诱 导温度<30°C，优选的为20°C。
13. 权利要求11所述方法，步骤（2)的酶切和步骤（3)的纯化过程可以顺序进行，也可 以同时进行。
【文档编号】C12R1/84GK104195165SQ201410440706
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月1日 优先权日:2014年9月1日
【发明者】王晓霞, 彭毅 申请人:北京爱必信生物技术有限公司