一株在低pH值下产丁二酸工程菌株及其发酵生产丁二酸的方法
【专利摘要】本发明公开了一株能在低pH值下产丁二酸基因工程菌菌株，其分类命名为大肠埃希氏菌BA601（EscherichiacoliBA601），其保藏号编号为CCTCCNO：M2014210。本发明还公开了该菌在产丁二酸的方法。本发明以缺乏乳酸脱氢酶(LDH)基因，丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因活性和磷酸转移酶系统的ptsG自发突变的大肠杆菌AFP111为出发菌株，过量表达其耐酸基因gadBC。这种通过分子生物学及微生物驯化手段，使原先不能在低pH(pH5.6)条件下生长并发酵产酸的大肠杆菌AFP111能够高效利用葡萄糖产丁二酸的方法未见公开，而这种应用将大大推进丁二酸产业的进步和发展。
CCTCC NO：M2014210
2014.05.18
【专利说明】一株在低pH值下产丁二酸工程菌株及其发酵生产丁二酸 的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程【技术领域】，涉及一株产丁二酸基因工程菌及其发酵生产丁二 酸的方法，具体是一株在低pH值下产丁二酸重组菌株及利用该菌株发酵生产丁二酸的方 法。
[0002]
【背景技术】 丁二酸（succinic acid)又称琥拍酸，被广泛应用于医药、农药、染料、香料、油漆、食品 和塑料等行业，作为C4平台化合物，可用于合成1，4_ 丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯等有机 化学品以及聚丁二酸丁二醇酯（PBS)类生物可降解材料，被美国能源部认为是未来12种 最有价值的生物炼制产品之一。此外，丁二酸还用于生产药物、抗生素、氨基酸及维生素等 利于人类健康中间体。
[0003] 丁二酸的生产方法主要包括化学合成法和微生物发酵法，利用微生物发酵法转 化可再生资源，由于原料来源广泛且价格低廉，污染小，环境友好，且在发酵过程中可以吸 收固定C02，能有效缓解温室效应，开辟了温室气体二氧化碳利用的新途径，今年来成为研 究的热点。丁二酸的生产菌株主要集中在、 Actinobaci 11 us succinogenes^ Mannheimia 重组谷氛酸棒杆菌-口 重组大肠杆菌。其中利用野生菌株生产丁二酸虽然获得了较高的产物浓度，但培养过程培 养基成本较高，且甲酸、乙酸等副产物积累较多，阻碍了其工业化进程。而重组大肠杆菌由 于遗传背景清楚、易操作、易调控、培养基要求简单和生长迅速等优点，近年来被广泛用于 研究以获得产丁二酸优秀菌株。
[0004] 现有产丁二酸重组大肠杆菌的构建思路主要包括失活副产物生成途径的关键酶 (如丙酮酸甲酸裂解酶与乳酸脱氢酶)、增强丁二酸合成途径中酶(如磷酸烯醇式丙酮酸羧 化酶）的活性以及外源导入可以引导合成丁二酸的酶(如丙酮酸羧化酶）提高其对葡萄糖的 利用率以及生产速率。其中，凡cWi NZN111由于同时失活了丙酮酸甲酸裂解酶与乳酸脱 氢酶，NADH不能及时再生为NAD+，引起胞内辅酶NAD(H)的不平衡（NADH/NAD+比例超过2)， 最终导致厌氧条件下菌株不能利用葡萄糖。其自发突变株凡cWi AFP111由于突变了葡 萄糖专性转运系统中的基因，降低了在EMP途径中NADH的产生速率，恢复了 NAD(H) 平衡，使得菌株在厌氧条件下能够利用葡萄糖，且产物主要为丁二酸，在有氧厌氧两阶段发 酵培养AFP111过程中，丁二酸质量收率达到96%，生产强度为1. 21 g rV1。
[0005] 利用生物技术生产丁二酸过程中60-70%的成本是用在将最终发酵产生的丁二酸 盐分离得到游离丁二酸的纯化阶段，这也是整个过程中耗费成本最多的阶段。为了降低生 产成本，最可行的方法是发酵过程中不用或用少量的碱滴定中和而使游离丁二酸成为主要 产物。但是至今为止用于丁二酸生产的细菌都不能在低pH值有效的生长并产丁二酸。然 而能有效维持胞内pH的原核微生物则可用于在低pH值下发酵生产丁二酸。
[0006] 大肠杆菌广泛应用于工业，但目前大多数大肠杆菌由于不能在耐受低pH值，从而 不能在低pH值下发酵生产丁二酸。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供了一株在pH值下产丁二酸大肠杆菌菌株，并利用该菌株 厌氧发酵生产丁二酸，达到菌株的方法简单方便，得到的菌株发酵方法简单可行，易于工业 化，产酸能力强的目的，从而大大降低生产成本，提高经济效益。
[0008] 为实现本发明目的，本发明采用以下技术方案： 一、本发明提供一株产丁二酸基因工程菌菌株，其分类命名为大肠埃希氏菌BA601 (万scAericAia BA601)，其保藏号编号为 CCTCC NO :M2014210。
[0009] 二、本发明所述的大肠埃希氏菌co/i)BA601的构建方法，其特征在 于以缺乏乳酸脱氢酶（LDH)基因，丙酮酸甲酸裂解酶（PFL)基因活性且磷酸转移酶系统的 染色体发生自发突变的大肠杆菌为出发菌株，利用过表达谷氨酸脱羧酶、γ -氨基丁 酸反向转运蛋白基因后，经连续驯化培养，得到能够在低pH值下高产丁二酸大肠埃希氏菌 BA601 ； 进一步地，所述的具体步骤如下： (1) 利用CaCl2法制备缺乏乳酸脱氢酶基因，丙酮酸甲酸裂解酶基因活性和磷酸转移 酶系统的/7^6染色体发生自发突变的凡感受态菌株； (2) 纯化扩增出包含其耐酸原件gat/系统的谷氨酸（Glumate)脱羧酶（GadB)、谷氨 酸-Y -氨基丁酸（GABA)反向转运蛋白（GadC)基因的质粒； (3) 将步骤（2)所述的质粒利用热击法导入步骤（1)得到的感受态菌株，获得阳性转 化子； (4) 利用步骤（3)的阳性转化子表达耐酸基因得到一株能在低pH值下发酵产 丁二酸的大肠埃希氏菌 BA600 co/iBA600)。
[0010] (5 )大肠埃希氏菌BA600经连续驯化培养后，利用低pH值的固体培养基平板，筛选 得到可以快速生长的突变株，再经过厌氧摇瓶发酵筛选获得可以在低pH值条件下高效产 丁二酸的菌株为目标菌株大肠埃希氏菌BA601 co/i BA601)。
[0011] 三、利用本发明所述的大肠埃希氏菌BA601发酵生产丁二酸的方法，其特征在于 采用两阶段发酵方式，有氧阶段提高生物量，厌氧阶段发酵产酸。
[0012] 进一步地，具体步骤如下： 将大肠埃希氏菌BA601按1%(ν/ν)接种量接种入有氧阶段发酵培养基中有氧培养，有 氧培养菌体至0D_= 3时，按接种量10%转接至含有厌氧阶段发酵培养基的血清瓶中，充 C022 min，并在 37 °C，200 r/min 厌氧发酵 48 h。
[0013] 或者将大肠埃希氏菌BA601按10%的接种量将种子液接入装有1. 5 L发酵培养 基的3 L发酵罐中，37 °C有氧培养至菌体生长达到稳定期，37 °C、200 r/min以0. 5 L/min 的速率持续通入C02，进行厌氧发酵，优选的，其中有氧阶段发酵培养基维持在pH 5. 6。
[0014] 进一步地，所述的厌氧阶段发酵培养基是维持在pH 5. 6。
[0015] 本发明的有益效果在于：本发明以缺乏乳酸脱氢酶（LDH)基因，丙酮酸甲酸裂解 酶（PFL)基因活性和磷酸转移酶系统的自发突变的大肠杆菌AFP111为出发菌株， 过量表达其耐酸基因这种通过分子生物学及微生物驯化手段，使原先不能在低 pH (pH5. 6)条件下生长并发酵产酸的大肠杆菌AFP111能够高效利用葡萄糖产丁二酸的方 法未见公开，而这种应用将大大推进丁二酸产业的进步和发展。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1大肠杆菌中耐酸基因 ^300^的耐酸途径。
[0017] 图2 PCR产物凝胶电泳鉴定图。
[0018] 图3质粒pMD19-T-辟单酶切、双酶切电泳鉴定图。
[0019] 图4大肠埃希氏菌C&cAericAia co/i) BA601在pH 5. 6时产丁二酸结果。
[0020] 本发明的微生物分类命名为大肠埃希氏菌BA601 (fccAericAia coB BA601)，其 保藏日期为2014年5月18日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称为CCTCC，保 藏地址为中国.武汉.武汉大学，其保藏号编号为CCTCC N0:M2014210。
【具体实施方式】
[0021] 下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。
[0022] 本发明所述的质粒用pMD19_T的来源是：购自Takara公司 本发明所述的出发菌株么cWi AFP111的感受态菌株的来源有两处： (1) Applied and environmental microbiology, 2001, 67(1): 148-154. 申请人:首 先通过查阅到该生物材料的上述文献出处，并联系了发表人系美国芝加哥大学的David P. Clark教授，并邮件请求其赠与该生物材料，并免费获得了该生物材料；且 申请人:保证从本 申请日起二十年内向公众发放该生物材料。
[0023] (2)该生物材料还在中国专利（申请号CN 96198547,申请日1996. 10. 31，授权日 为2003年1月1日，授权
【发明者】姜岷, 陈吴方, 吴明科, 马江锋, 刘嵘明, 陈可泉, 韦萍, 欧阳平凯 申请人:南京工业大学