胃肠模拟消化制备菜籽粕蛋白抗氧化肽液的方法
【专利摘要】本发明胃肠模拟消化制备菜籽粕蛋白抗氧化肽液的方法，属于食品加工技术和蛋白利用【技术领域】。采用的制备工艺以菜籽榨油副产物高变性蛋白菜籽粕为原料，经粉碎、过筛等常规预处理后，采用模拟胃肠消化技术，由含胃蛋白酶、胰蛋白酶构建双酶模拟胃肠消化体系，沸水浴、调节pH法集成2次离心手段制备菜籽粕蛋白抗氧化肽液。本发明的制备方法采用双酶酶解反应体系，极大地提高菜籽粕蛋白水解效率，充分利用原料；模拟胃肠消化过程，未进行常规酶解的不断添加NaOH维持反应在最适pH进行，反应过程更加绿色，同时，由于模拟最完美的人体胃肠消化手段，在潜在食品安全方面，较微生物发酵更有优势。
【专利说明】胃肠模拟消化制备菜籽粕蛋白抗氧化肽液的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品加工技术和蛋白利用【技术领域】，具体涉及利用胃肠模拟消化制备 菜籽柏蛋白抗氧化肽液的方法。
【背景技术】
[0002] 菜籽柏，是油菜籽榨油后的副产物，菜籽柏中粗蛋白含量一般在32%以上，粗纤维 含量在12%以下，其氨基酸组成丰富营养平衡，与豆柏相比存在明显的价格优势，由于高温 压榨制油引起蛋白高度变性，目前主要作为畜禽蛋白饲料开发，是一类极具开发潜力的植 物蛋白资源。
[0003] 多肽是氨基酸以肽键连接而成的化合物，通常分子量在200Da到IOOOODa之间，也 是蛋白质分解的中间体，能透过半透膜，不能被三氯乙酸及硫酸铵等沉淀。主要制取方法是 通过蛋白酶直接酶解蛋白或微生物发酵产生蛋白酶而间接酶解获得各种多肽。针对高度变 性蛋白原料，菜籽柏而言，现有的生产工艺、方法依照设计流程主要可分为两类： (1)将菜籽柏粉碎，采用蛋白酶水解处理，最后进行喷雾干燥获得多肽粉。例如：中国 专利CN103431154A，CN102676621B中，直接以菜籽柏或者菜籽分离蛋白质为原料，通过中 性蛋白酶或碱性蛋白酶法水解，获得降血压菜籽肽。
[0004] (2)首先对菜籽柏原料进行预处理或接种微生物培养液，接着进行酶解反应获得 多肽产品。例如：CN103436581A，CN101654696B中，采用湿法球磨（250-400r/min)联合纤 维素酶（5-10μ g)预处理l-3h，接着中性蛋白酶酶解，得到粗制多肽溶液；另外有将菜籽柏 粉与营养液混合制备液态发酵培养基，微生物接入液态发酵培养基发酵，固液分离，得到菜 籽肽的粗提液。
[0005] 长期以来，以传统的蛋白酶解（中性蛋白酶或碱性蛋白酶）或微生物发酵法为核心 的制备方法在菜籽柏多肽的工业生产实践中发挥了很大的作用。但是这两类方法如蛋白酶 解法，存在单一酶酶解效率较低，一般难以高于30%，且为维持最适合酶解pH，酶解过程中 需不断添加碱液维持PH相对恒定，酶解产物中存在大量的钠盐，由于从多肽中脱除钠盐， 最典型的为NaCl，不利于高血压人群使用，使得原本以辅助降血压为活性的产品，难以市场 化定位。另外，微生物发酵法，主要采用放射毛霉、宇佐美曲霉、枯草芽孢杆菌、乳酸菌或产 朊假丝酵母等，属于间接酶解蛋白技术，一方面产品的稳定难以达到功能性产品要求，多数 以饲料产品开发为主，另一方面微生物发酵，从发酵液中分离多肽能耗高，废液量大，产物 复杂，且存在安全性隐患。
[0006] 随着对环境保护，生产监控及产品稳定性等日趋规范及对蛋白资源利用水平要求 认识的不断重新定义和逐步提高，以上两个方面的主要不足使得上述两类工艺、方法在工 业生产中的应用前景不佳，将被逐步被新的技术和理念所替代。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于克服现有技术中由于单酶酶解效率不高，酶解反应中不断调节 pH而大量使用NaOH调整，酶解产物活性和多肽分子量关联特征不够清晰等问题，提供一种 基于模拟人体胃肠消化体系，构建极为安全的菜籽柏多肽制备方法。
[0008] 本发明的技术工艺与科学原理如下： 目前的菜籽制油加工工艺，使得成为副产物的菜籽柏含有32%以上高度变性蛋白，多 肽增值化利用成为其极有前途的方向，基于高效安全的胃肠消化模式，采用胃蛋白酶、胰蛋 白酶双酶模拟胃肠消化体系，制备具有抗氧化特性且分子量分布明确的菜籽柏多肽；本发 明中的胃液消化体系和十二指肠液消化体系是模拟人体消化原理所构筑的双酶分步反应 体系，模拟胃消化结束时未进行灭酶处理，直接进行模拟十二指肠液消化，有利于充分酶解 消化反应；此外，消化结束时，进行沸水浴终止反应，离心获取上清液后，调节PH去除大分 子蛋白，进行二次离心，获得精制的菜籽柏抗氧化肽液。双酶作用位点更多，使得酶解效率 更高，沸水浴和PH调节，2次离心有效去除少量未被酶解的大分子蛋白，使得所制备的多肽 含量更高。
[0009] 本发明的技术构思是创新性地采用双酶模拟胃肠消化技术，提高酶解效率，采用 沸水浴变性和PH等电点沉淀蛋白技术，高效安全的酶解手段和简单可行的多肽纯化精制 工艺集成创新，因此本发明中的方法较传统方法更适合于大规模开发菜籽柏蛋白抗氧化肽 液。
[0010] 本发明胃肠模拟消化制备菜籽柏蛋白抗氧化肽液的方法，按照下述步骤进行： (1)取榨油后的副产物高蛋白变性菜籽柏，粉碎，用φ 200 X 50mm标准检验筛过筛，获 得粗蛋白质量百分含量为38%菜籽柏蛋白原料。
[0011] (2)构建模拟胃肠消化体系： 其中所述的模拟胃液组成成分如下：称取〇. 20g NaCl，0. 32g胃蛋白酶，7 mL蒸馏水， 0· 7 mL 3mol/L盐酸，盐酸调pH至1. 2±0· 1，蒸馈水定容至100 mL。
[0012] 其中所述的模拟十二指肠液组成成分如下：称取0. 70g磷酸二氢钾溶于25 mL蒸 馏水中，振荡使之完全溶解，加入19 mL 0.2mol/L NaOH和40 mL蒸馏水，加入LOg胰蛋白 酶，用0· 2mol/L NaOH调pH至6. 4±0· 1，蒸馈水定容至100 mL。
[0013] (3)在100 mL锥形瓶中加入25 mL模拟胃液，37°C恒温水浴5min。加入一定质量 的菜籽柏1-4%，迅速涡旋震荡并快速置于37°C水浴，搅拌酶解4h。然后加入37°C恒温水浴 5min的模拟十二指肠液35mL，调节pH至6. 4, 37°C恒温条件下酶解lh。
[0014] (4)沸水浴10 min终止反应；4500r/min离心lOmin，取上清液调节pH至4. 2， 4500r/min离心30min去除大分子蛋白，获得菜籽柏蛋白抗氧化肽液。
[0015] 其中步骤（1)中的菜籽柏原料是指菜籽榨油副产物高蛋白变性菜籽柏，且蛋白含 量 38%。
[0016] 其中步骤（3)中模拟胃液和模拟十二指肠液消化反应前都进行了 37°C恒温水浴 5min预热处理。
[0017] 其中步骤（3)中模拟胃液消化4h后，未进行胃蛋白酶灭酶处理，直接进行模拟 十二指肠液消化Ih。
[0018] 其中步骤（4)进行了沸水浴和调节pH两种方法结合变性法和等电法沉淀蛋白，集 成2次离心法脱除大分子蛋白。
[0019] 其中步骤（4)中所得的菜籽柏蛋白抗氧化肽中含有2608Da、16%Da、211Da分子量 的多肽。
[0020] 本发明的有益效果如下： (1) 本发明的制备方法采用胃蛋白酶、胰蛋白酶双酶酶解反应体系，极大地提高菜籽柏 蛋白水解效率，充分利用原料，使得废弃液原料蛋白将更少。
[0021] (2)本发明的制备方法中模拟胃肠消化过程，未进行常规酶解的不断添加 NaOH维 持反应在最适PH进行，反应过程更加绿色，另外，由于模拟最完美的人体胃肠消化手段，在 潜在食品安全方面，较微生物发酵更有优势。
[0022] (3)本发明的制备方法中沸水浴变性去蛋白和pH等电点沉淀蛋白技术，结合2次 离心分离手段，使得所制备的多肽含量更高，精制过程更加低碳节能。
【专利附图】
【附图说明】
[0023] 图1是胃肠模拟消化制备菜籽柏蛋白抗氧化肽液的工艺的流程图。
[0024] 图2是标准分子量蛋白和多肽对照品色谱图（A)，其中1号峰67000Da ;2号峰 12500Da ;3号峰204Da ;菜籽柏抗氧化肽液多肽分子量分布色谱图（B)，1号峰2608Da ;2号 峰 1695Da ;3 号峰 211Da。
[0025] 图3是游离氨基酸标准品（A)分析测试色谱图，菜籽柏原料（B)和抗氧化肽液（C) 中游离氨基酸测试色谱图。
【具体实施方式】
[0026] 本发明采用液相色谱法、氨基酸分析仪、DPPH清除率、OH (羟自由基）清除率分别 测定多肽液中肽分子量分布、游离氨基酸组成及含量、DPPH清除能力和OH (羟自由基)清除 能力。
[0027] (1)肤分子量分布 色谱柱：TSKgel-G2000 SWxl(7. 8mmX 30cm，Tosoh);流动相：0· lmol/L Na2S04+0. Imol/ L磷酸缓冲液（pH6. 7);柱温30°C ;检测波长：220 nm ;流速：0. 5 mL/min ;进样量：10 μ L。 1260型安捷伦液相色谱仪(安捷伦科技贸易公司） (2) 游离氨基酸组成及含量 通过全自动氨基酸分析仪测定游离氨基酸组分和含量。吸取不同消化时间的酶解液 0· I mL于L 5 mL离心管中，加入0· 9 mL 1%的磺基水杨酸，沉淀2h，10000rpm/min离心 15min，取上清液，用0. 22 μ m微膜(水膜)过滤至样品瓶中，供上机测定，德国Sykam-433D全 自动氨基酸分析仪（SYKAM公司）。
[0028] (3) DPPH 清除能力 2 11^0--!1溶液(在95%乙醇中的浓度为0.1臟〇1/1)与2 1^样品溶液混合。混合物 在室温下避光静置30min，用VIS-7220N型可见分光光度计在517nm处测定吸光度。使用蒸 馏水代替样品作为对照。j/W·
【权利要求】
1. 胃肠模拟消化制备菜籽柏蛋白抗氧化肽液的方法，其特征在于按照下述步骤进行： (1) 取榨油后的副产物高蛋白变性菜籽柏，粉碎，用标准检验筛过筛，获得粗蛋白质量 百分含量为38%菜籽柏蛋白原料； (2) 构建模拟胃肠消化体系： (3) 在锥形瓶中加入模拟胃液，37°C恒温水浴5min ;加入占模拟胃液质量比为1-4%的 菜籽柏，迅速涡旋震荡并快速置于37°C水浴，搅拌酶解4h ;然后加入37°C恒温水浴5min的 模拟十二指肠液，其中模拟胃液与模拟十二指肠液的体积比为5 ;7 ;调节pH至6. 4, 37°C恒 温条件下酶解lh ; (4) 沸水浴10 min终止反应；4500r/min离心lOmin，取上清液调节pH至4. 2,4500r/ min离心30min去除大分子蛋白，获得菜籽柏蛋白抗氧化肽液。
2. 根据权利要求1所述的胃肠模拟消化制备菜籽柏蛋白抗氧化肽液的方法，其特征在 于其中所述的模拟胃液组成成分如下：称取〇. 20g NaCl，0. 32g胃蛋白酶，7 mL蒸馏水，0. 7 mL 3mol/L盐酸，盐酸调pH至1. 2±0· 1，蒸馈水定容至100 mL ; 其中所述的模拟十二指肠液组成成分如下：称取〇. 70g磷酸二氢钾溶于25 mL蒸馏水 中，振荡使之完全溶解，加入19 mL 0. 2mol/L NaOH和40 mL蒸馏水，加入l.Og胰蛋白酶， 用 0· 2mol/L NaOH 调 pH 至 6. 4±0· 1，蒸馈水定容至 100 mL。
3. 根据权利要求1所述的胃肠模拟消化制备菜籽柏蛋白抗氧化肽液的方法，其特征在 于其中步骤（1)中的菜籽柏原料是指菜籽榨油副产物高蛋白变性菜籽柏，且蛋白含量38%。
4. 根据权利要求1所述的胃肠模拟消化制备菜籽柏蛋白抗氧化肽液的方法，其特征在 于其中步骤（3)中模拟胃液和模拟十二指肠液消化反应前都进行了 37°C恒温水浴5min预 热处理。
5. 根据权利要求1所述的胃肠模拟消化制备菜籽柏蛋白抗氧化肽液的方法，其特征在 于其中步骤（3)中模拟胃液消化4h后，未进行胃蛋白酶灭酶处理，直接进行模拟十二指肠 液消化lh。
6. 根据权利要求1所述的胃肠模拟消化制备菜籽柏蛋白抗氧化肽液的方法，其特征在 于其中步骤（4)进行了沸水浴和调节pH两种方法结合变性法和等电法沉淀蛋白，集成2次 离心法脱除大分子蛋白。
7. 根据权利要求1所述的胃肠模拟消化制备菜籽柏蛋白抗氧化肽液的方法，其特征在 于其中步骤（4)中所得的菜籽柏蛋白抗氧化肽中含有2608Da、16%Da、211Da分子量的多 肽。
【文档编号】C12P21/06GK104263786SQ201410455199
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月9日 优先权日:2014年9月9日
【发明者】周存山, 马海乐, 余筱洁, 杨华, 杨欢, 秦晓佩, 胡佳丽 申请人:江苏大学