埃博拉五重荧光pcr快速超敏检测试剂盒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了在单个PCR反应容器中五重检测核酸提取液中靶核酸的实时PCR方法，用于同时检测是否存在埃博拉-扎伊尔型（EBO-Zaire)、埃博拉-苏丹型（EBO-Sudan)、埃博拉-本迪布焦型（EBO-Bundibugyo)、埃博拉-塔伊森林型（EBO-Taiforest)和埃博拉-莱斯顿型(EBO-Restor)等埃博拉病毒亚型。该方法能有效避免假阴性和假阳性结果的产生，对于埃博拉病毒检测来说是非常有实际意义的。本发明还提供了用于实施上述方法的检测试剂盒及其应用等。
【专利说明】埃博拉五重荧光PCR快速超敏检测试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于核酸检测【技术领域】，具体而言，本发明涉及能同时对多型埃博拉病 毒进行快速检测的多重实时PCR方法，能够快速、灵敏且一步完成对埃博拉-扎伊尔型 (EBO-Zaire)、埃博拉-苏丹型（EBO-Sudan)、埃博拉-本迪布焦型（EBO-Bundibugyo)、埃博 拉-塔伊森林型（EBO-Taiforest)和埃博拉-莱斯顿型（EBO-Restor)等五种致病病原体 的检测。另外，本发明还涉及上述PCR方法中所涉及的试剂，如互不相干绕的引物、探针等， 以及用于上述方法的检测试剂盒和相应检测试剂盒的制备应用等。
【背景技术】
[0002] 埃博拉病毒（Ebola virus)是一种严重威胁人类生命的病毒，其生物安全等级为 4级（而艾滋病和SARS仅为3级）。埃博拉病毒主要通过患者的血液和排泄物传播，临床 主要表现为急性起病发热、肌痛出血皮疹和肝肾功能损害，死亡率高达50%至90%。该病 毒自1976年首次于扎伊尔发现后，几十年间在多个西非国家陆续爆发感染，传播区域不断 扩大并北移。尤其是，2014年发生在西非国家几内亚、利比里亚和塞拉利昂的疫情已经造成 数千人死亡，至本发明完成之日还没有得到有效控制。
[0003] 埃博拉病毒潜伏期通常为2至21天，目前还没有有效的药物和疫苗治疗和预 防该病毒的感染。埃博拉病毒已经发现有埃博拉-扎伊尔型（EBO-Zaire)、埃博拉-苏 丹型（EBO-Sudan)、埃博拉-本迪布焦型（EBO-Bundibugyo)、埃博拉-塔伊森林型 (EBO-Taiforest，也称科特迪瓦型）和埃博拉-莱斯顿型（EBO-Restor)等亚型。不同亚型 具有不同的特性，其中埃博拉-扎伊尔型和埃博拉-苏丹型对人类和非人类灵长动物的致 病性和致死率均很高；埃博拉-莱斯顿型虽然对人类不致病，但对非人类灵长动物却具有 致死性作用，仍旧是必须严防的病毒亚型。
[0004] 由于感染埃博拉病毒的患者血液中会产生病毒特异性抗体，其中IgM在发病后 2?9天出现，持续存在到发病后1?6个月；而IgG在发病后6?18天出现，如果患者幸 存，甚至可以持续存在到发病后2年以上，所以目前建立的检测埃博拉病毒的方法多为基 于检测患者血液中抗体（尤其是IgG)的ELISA方法。
[0005] 近来也有报道利用聚合酶链反应（PCR)来检测病毒的技术，尤其可以利用多重实 时PCR来检测，例如中国专利CN101624629A公开了（在单个PCR反应容器中）多重检测样 品中靶核酸的实时PCR方法，可以同时用于检测HBV、HCV和HIV等三种靶核酸，然而如何设 计互不干扰并且保持检测特异性（假阳性和假阴性的排除）的引物对和探针，则没有理论 上指引，只能依赖于专业人员的经验来设计。
[0006] 部分出于研究危险性的原因，部分出于防范信息落入生物恐怖分子手中的原 因，埃博拉病毒的遗传背景（包括完整的基因组序列等）并没有完全向公众公开，尤 其是埃博拉-扎伊尔型（EBO-Zaire)、埃博拉-苏丹型（EBO-Sudan)、埃博拉-本迪布 焦型（EBO-Bundibugyo)、埃博拉-塔伊森林型（EBO-Taiforest)和埃博拉-莱斯顿型 (EBO-Restor)这五种病毒亚型之间的病毒基因组的同源性，使得要设计出针对这些病毒亚 型的五重互不干扰的特异性引物对和探针，尤为困难。
[0007] 由于本发明人所在的课题组在设计多重实时PCR检测方面有着独到之处，受有关 方面委托，经过艰苦的努力并且凭借了一些运气，针对这五种病毒亚型，设计出了互相干扰 程度在实时PCR检测中可接受的引物对和探针，使得同时检测获得的曲线都能清晰分辨 (曲线相互分离），并使得检测灵敏度达到了超敏级，可以在不使用内对照的情况下，有效 抑制假阴性结果，更可以在实践中有效防止会引起不必要恐慌的假阳性结果。
【发明内容】
[0008] 本发明的要解决的问题在于提供新的五重实时PCR检测方法，用于五重检测样品 中是否存在埃博拉-扎伊尔型（EBO-Zaire)、埃博拉-苏丹型（EBO-Sudan)、埃博拉-本迪 布焦型（EBO-Bundibugyo)、埃博拉-塔伊森林型（EBO-Taiforest)和埃博拉-莱斯顿型 (EBO-Restor)。另外，本发明还涉及提供上述方法的检测试剂盒和应用等。
[0009] 具体而言，在第一方面，本发明提供了在单个PCR反应容器中五重检测核酸提 取液中靶核酸的实时PCR方法，所述靶核酸来自埃博拉-扎伊尔型（EBO-Zaire)、埃博 拉 -苏丹型（EBO-Sudan)、埃博拉-本迪布焦型（EBO-Bundibugyo)、埃博拉-塔伊森林型 (EBO-Taiforest)和埃博拉-莱斯顿型（EBO-Restor)，其包括，
[0010] (1)在所述单个PCR反应容器中混合核酸提取液、DNA聚合酶、dNTP、靶核酸引物对 和靶核酸探针，其中所述探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团 的荧光检测波长互不相同，其中，
【权利要求】
1. 在单个PCR反应容器中五重检测核酸提取液中靶核酸的实时PCR方法，所述靶 核酸来自埃博拉-扎伊尔型（EBO-Zaire)、埃博拉-苏丹型（EBO-Sudan)、埃博拉-本迪 布焦型（EBO-Bundibugyo)、埃博拉-塔伊森林型（EBO-Taiforest)和埃博拉-莱斯顿型 (EBO-Restor)，其包括： (1) 在所述单个PCR反应容器中混合核酸提取液、DNA聚合酶、逆转录酶、RNA保护剂、 dNTP、靶核酸引物对和靶核酸探针，其中所述探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探 针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同，其中， 靶核酸引物对包括
(2) 进行PCR反应，并实时检测不同波长的荧光；和， (3) 根据荧光检测结果判断是否有靶核酸存在于核酸提取液中。
2. 权利要求1所述的方法，其是非诊断方法。
3. 权利要求1所述的方法，其中各种探针标记有不同的荧光基团，优选荧光基团是 FAM、VIC、NED、Texas Red 和 CY5。
4. 权利要求1所述的方法，其中PCR反应的每个循环的条件为94°C 10秒、55°C 15秒 以及65°C 45秒。
5. 权利要求1所述的方法，其中每种靶核酸探针在在所述单个PCR反应容器中的浓度 大于5pmol/ml，优选为6?12pmol/ml，更优选为7?10pmol/ml，最优选为8pmol/ml。
6. 权利要求2所述的方法，其中核酸提取液是对样品采用磁珠提取法提取的。
7. 用于在单个PCR反应容器中五重检测核酸提取液中靶核酸的实时PCR方法的检测试 剂盒，其包括DNA聚合酶、逆转录酶、RNA保护剂、dNTP、靶核酸引物对和靶核酸探针，其中所 述探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相 同，其中， 靶核酸引物对包括
8. 权利要求7所述的试剂盒，其中各种探针标记有不同的荧光基团，优选荧光基团是 FAM、VIC、NED、Texas Red 和 CY5。
9. 权利要求7所述的试剂盒，其还包括磁珠提取法所需试剂。
10. 权利要求7?9之任一所述的试剂盒在制备用于在单个PCR反应容器中五重检测 核酸提取液中靶核酸的实时PCR方法的检测试剂产品（优选是用于权利要求1-6之任一所 述的方法的检测试剂产品）中的应用。
11. 互不干扰实时PCR的核酸混合物，其是引物或探针的混合物，所述引物或探针选自
【文档编号】C12Q1/70GK104212914SQ201410458684
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月11日 优先权日:2014年9月11日
【发明者】刘劲林, 郭志武, 陈红干, 张必新, 王川, 李振勇 申请人:苏州华益美生物科技有限公司