柑桔黄脉病毒的实时荧光定量rt-pcr 检测试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明涉及生物检测【技术领域】，具体涉及一种利用实时荧光定量RT-PCR法对柑桔黄脉病毒（CYVCV）进行检测的引物、试剂盒及检测方法等。本发明针对柑桔黄脉病毒（CYVCV）的实时荧光定量RT-PCR法检测用引物序列如SEQIDNO：1-2所示。本发明的试剂盒和引物，具有特异性强、灵敏度高、重复性好的优点，本发明的实时荧光定量PCR检测灵敏度比常规RT-PCR检测提高了100倍，可用于柑桔黄脉病毒（CYVCV）的田间早期快速诊断及定量检测。
【专利说明】柑桔黄脉病毒的实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒及检测 方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物检测【技术领域】，具体涉及一种针对柑桔黄脉病毒的实时荧光定量 RT-PCR检测用引物、试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] 柑梧黄脉病（Citrus yellow vein clearing disease, CYVCD)，也称梓檬黄脉病 (Yellow vein clearing of Lemon)，是由柑桔黄脉病毒（Citrus yellow vein clearing virus，CYVCV)引起的。该病是Βον?(1989)在巴基斯坦调查发现后命名的，Loconsole等 (201 2)通过深度测序技术，获得了柑桔黄脉病毒的全基因组，该病毒由7529个（GenBank Accession No. JX04〇635)核苷酸的正义RNA链组成，它是威胁柠檬生产的重要病害之一。 主要症状表现为叶片侧脉及侧脉附近脉明、黄化，对光看更为明显，叶背可见侧脉处水浸 状，部分叶片皱缩、反卷或船形叶，嫩叶症状表现明显，到老叶症状也不消失。主要导致光合 作用降低、树势减弱、减产20 %左右。柠檬黄脉病目前主要发生在印度、巴基斯坦、土耳其等 国家。
[0003] 到目前为止，世界上对该病害的研究较少，大都停留在生物学特性研究方面，近年 在我国云南瑞丽、重庆、江西、四川安岳等地柠檬上也发生类似症状，是我国柑桔上的新发 病害。本人近几年研究结果表明该病害具有嫁接传染性，对所有柠檬、酸橙品种都具有嫁接 传染性并具典型症状，对甜橙、宽皮柑桔也具有侵染性，但症状不明显；能侵染辣椒和豇豆； 柑桔黄脉病最适宜发病温度为18?24°C,柑桔黄脉病病毒微粒为13?15X400?lOOOnrn 联合丝状，通过热处理结合茎尖嫁接脱毒方法能有效脱除该病毒。这些研究结果与国外研 究报道的相关结果相同。
[0004] 柑桔黄脉病毒对我国柑桔，尤其是柠檬的生产造成了极其严重的损失。目前还缺 乏对该病有效的防治方法，使用无病毒苗木是防治柑桔黄脉病唯一有效的方法。为保证种 苗安全，必须对采穗母树和砧木进行定期监测，并及时清除田间病树，因此要求具备快速、 灵敏的检测技术体系。
[0005] 当前在检测CYVCV时主要采用指示植物鉴定的方法，该方法的检测周期较长，无 法满足生长上大量、快速检测的需要。近年来，发明人创建的RT-PCR检测体系虽可对 CYVCV进行快速检测，但无法对植株中CYVCV的含量进行定量分析，并且在植株发病早期， 当病毒含量较低时可能无法对该病进行有效检测。为此，需要建立更为灵敏的实时RT-PCR 检测体系。目前还没有运用实时RT-PCR检测CYVCV的报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于解决现有技术中存在的不足，提供一种利用实时荧光定量 RT-PCR法对柑桔黄脉病毒（CYVCV)进行检测的引物、试剂盒及检测方法等，可用于柑梧黄 脉病毒（CYVCV)的田间早期快速诊断及定量检测。
[0007] 本发明首先公开了一种针对柑桔黄脉病毒（CYVCV)的实时荧光定量RT-PCR法检 测用引物，所述引物组成如下：
[0008] CYVCV 上游 j丨物 YSS-F TCCAACTCACAAACGCAefG SBQID jffi: 1 CYVCV F游丨物 YSS-R ATGGGCTCTTGGTTTTCCTT SEQ ID NO： 2
[0009] 上述针对柑桔黄脉病毒（CYVCV)的实时荧光定量RT-PCR检测用引物具体包括 CYVCV上下游引物，用于扩增柑桔黄脉病毒（CYVCV)。
[0010] 本发明第二方面公开了一种柑桔黄脉病毒（CYVCV)实时荧光定量RT-PCR检测试 剂盒，所述试剂盒的基本原理是利用一对靶多核苷酸的特异性引物，在本试剂盒PCR扩增 反应液中，通过荧光定量PCR扩增仪实现靶核苷酸的循环扩增，从而达到快速、定量检测多 核苷酸的目的。
[0011] 进一步的，所述试剂盒包括柑桔黄脉病毒PCR扩增反应液，所述PCR扩增反应液中 含有前述的引物，所述PCR扩增反应液能和该对引物的靶序列结合，产生高度灵敏、特异性 高的检测信号。
[0012] 较优的，所述柑桔黄脉病毒PCR扩增反应液中还含有GoTaq qPCR Master Mix和 H20〇
[0013] 所述PCR扩增反应液中，引物、GoTaq qPCR Master Mix&H20均为常见组分，其含 量亦为常规。
[0014] 较优的，所述柑桔黄脉病毒PCR扩增反应液的组成中，CYVCV上游引物（YSS-F)、 CYVCV下游引物（YSS-R)的终浓度分别为50?500nM/L和50?500nM/L。
[0015] 更优的，所述柑桔黄脉病毒PCR扩增反应液的组成中，CYVCV上游引物（YSS-F)、 CYVCV下游引物（YSS-R)的终浓度分别为200nM/L和200nM/L。
[0016] 较优的，所述柑結黄脉病毒PCR扩增反应液包括：
[0017] 柑桔黄脉病毒上游引物：10uM、0. 5μ L ;
[0018] 柑桔黄脉病毒下游引物：10uM、0. 4μ L ;
[0019] GoTaq qPCR Master Mix ：10ug/ul>12. 5μ 1 ；
[0020] CXR Refernce Dye(Promega) ：30uM>0. 25 μ L ；
[0021] ddH20 ：6. 25 μ L〇
[0022] -般地，GoTaq qPCR Master Mix和CXR Refernce Dye均可经市售途径购买获得。
[0023] 较优的，所述实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒中还包括阴性对照品（DEPC-H20)、 阳性对照品中的至少一种。
[0024] 本发明所述阳性对照品包括含有SEQ ID N0 :3所示CYVCV目的扩增片段的质粒。 [0025] 并且，CYVCV目的扩增片段的序列为：
[0026] 5，-TCCAACTCACAAACCCAGTGCCCCGAACTCTCTCATGTCTACCAACGACAACAAGGGCMACAACC ACTTCACCCGACACCTCCGGGCCCTAACGACACGACCCCGAAACCTATCCCCGTGCCCACTCCCTCAGCTACACCCA CAGCTGCAGGTAAGGAAAACCAAGAGCCCAT-3， （SEQID N0:3)。
[0027] 较优的，本发明柑桔黄脉病毒（CYVCV)实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒所采用的 PCR检测体系如下：
[0028]柑桔黄脉病毒PCR扩增反应液 20 μ L
[0029]待测品 5μ?
[0030]反应总体系为 25 μ L。
[0031] PCR扩增反应液可自行配置，也可直接以市售的不含引物的通用pcR扩增反应液 加入引物及染料配置获得。
[0032]较优的，本发明试剂盒的PCR检测体系中，所述待测品为样本核酸提取液反转录 产物、阳性对照品或阴性对照品（DEPC-H20)。
[0033] 本发明的阳性对照品中，CYVCV质粒可以单独包装。
[0034]进一步的，所述试剂盒还包括反转录体系，所述反转录体系中包括柑桔黄脉病毒 下游引物。
[0035]所述反转录体系中，引物、dNTPs、RT buffer、腿sin、RTase以及H20均为常见组 分，其含量亦为常规。
[0036]较优的，所述反转录体系中，柑桔黄脉病毒下游引物的终浓度为50?500nM/L，更 优为 200nM/L。
[0037] 较优的，所述反转录体系包括：
[0038] 柑拈货脉炳?下爵f幽：IOuM . ft lfiT > 侧TPs : ?_ηΜ、〇.4μ?； buffer 1μ[, 蹄细玖 _jjL 0.125μ?: 0.125|0L; ^H20 0.75μ]_。
[0039]反转录体系可自行配置，也可直接以市售的不含引物的通用反转录体系加入引物 配置获得。
[0040]本发明样本核酸提取液的制备方法可参考现有病毒RNA提取技术，具体可采用下 述方法具体制备：选取15?30mg样本，装于无菌印pend〇rf管，加入液氮研磨。加入RNAiso PluslmL，盖紧离心管盖，涡旋，室温静置 5min ;12〇〇〇g ye离心5min，上清液转至新的 l.5mL的离心^中；加入2〇〇llL氯仿，振荡混勻，室温静置 5min，12〇〇〇g4O离心15min ;上 清液转至的离心管中，加入0. 5?1倍RNAiso Plus体积量的异丙醇，室温静置lOmin， l2〇OOg4°C离心10min ;用与RNAiso Plus等量的75%乙醇清洗沉淀，7500g 4Γ离心5min， 弃上清保留沉淀，放在通风橱干燥Smin，溶解于30-50 μ LDEPC处理水中，即获得样本核酸 提取液。
[0041]反转录产物可通过如下方法获得：ddH20 0.75pL，100mM dNTP0.4uL，5XRT buffer 1 μ L，（40U/ μ L) RNAsin 抑制剂 0. 125 μ L，RT 酶（200U/ μ L) 0. 125 μ L，10uM YSS-R 0· 1 μ L。运行程序：42°C 20min，94O lmin。
[0042]制备本发明所述样本核酸提取液的样本来自表现CYVCV典型症状的叶片。
[0043]本发明试剂盒的PCR扩增程序为：95°c预变性2min。95Γ变性10s，退火和延伸合 并为一步即：60°C 30s，40个循环；60°C时采集荧光。反应体系为25ul。 口
[0044]选用仪器为BioRad iQ型实时PCR仪。荧光通道检测选择通道1(最大激发波长 497nm，最大发射波长520nm)。
[0045]使用前述引物或试剂盒对柑桔黄脉病毒进行实时突光定量RT-PCR检测的方法， 包括以下步骤： ' '
[0046] 1)制备植物样本核酸提取液；
[0047] 2)加入反转录体系，制备植物样本核酸提取液反转录产物；
[0048] 3)加样：将柑桔黄脉病毒PCR反应液置于PCR管中,将植物样本核酸提取液反转 录产物、阳性对照品或阴性对照品分别加入装有检测液的不同PCR管，获得对应的样本反 应管、阳性反应管和阴性对照反应管；
[0049] 4) PCR扩增：反应管置于定量荧光PCR仪上，设置循环参数，进行PCR扩增；
[0050] 5) PCR反应结束后，检测PCR反应体系的焚光信号值，阈值设定原则以阈值线刚
[0051] 好超过DEPC-H20的最高点，荧光通道检测选择通道1(最大激发波长497nm，最大 发射波长520nm)。
[0052]较优的，步骤2)中，所述反转录体系中包括柑桔黄脉病毒下游引物。柑桔黄脉病 毒下游引物的终浓度为50?500nM/L,更优为200nM/L。
[0053] 较优的，所述反转录体系包括：
[0054] 柑桔黄脉病毒下游引物? lOuM、0.1亦； dNTPs . 100mM、0.4μ?； 5xS;T:"：bu&r Ιμ?, RNAsm 40U/(jL O.J25|jL;
[0055] RTasf 2001# 0.125|.iL； ddH20 0.75μ?〇
[0056] 较优的，步骤3)中，所述PCR扩增反应液中含有前述的引物，所述PCR扩增反应液 能和该对引物的靶序列结合,产生高度灵敏、特异性高的检测信号。
[0057] 较优的，所述柑桔黄脉病毒PCR扩增反应液中还含有GoTaq qPCR Master Mix和 H20。
[0058] 所述PCR扩增反应液中，引物、GoTaq qPCR Master Mix及％0均为常见组分，其含 量亦为常规。
[0059] 较优的，所述柑桔黄脉病毒PCR扩增反应液的组成中，CYVCV上游引物（YSS-F)、 CYVCV下游引物（YSS-R)的终浓度分别为50?500nM/L和50?500nM/L。
[0060] 更优的，所述柑桔黄脉病毒PCR扩增反应液的组成中，CYVCV上游引物（YSS-F)、 CYVCV下游引物（YSS-R)的终浓度分别为200nM/L和200nM/L。
[0061] 较优的，所述柑桔黄脉病毒PCR扩增反应液包括：
[0062] 柑桔黄脉病毒上游引物：10uM、0. 5μ L ;
[0063] 柑桔黄脉病毒下游引物：10uM、0. 4μ L ;
[0064] GoTaq qPCR Master Mix :10ug/ul、12. 5 μ 1 ;
[0065] CXR Refernce Dye(Promega) ：30uM>0. 25 μ L ；
[0066] ddH20 :6. 25 μ L。
[0067] 试剂盒质量控制：试剂盒各对照品须达到以下表1中的要求，否则实验视为无效。
[0068] 表1试剂盒质量标准
[0069]
【权利要求】
1. 一种针对柑桔黄脉病毒的实时荧光定量RT-PCR法检测用引物，其特征在于，所述引 物的组成为： 柑桔黄脉病毒上游引物的基因序列如SEQ ID NO :1所示； 柑桔黄脉病毒下游引物的基因序列如SEQ ID NO :2所示。
2. -种柑桔黄脉病毒实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括柑桔黄脉病毒PCR扩增反 应液，所述柑桔黄脉病毒PCR扩增反应液中含有权利要求1所述的引物。
3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述柑桔黄脉病毒PCR扩增反应液中， 柑桔黄脉病毒上游引物和下游引物的终浓度分别为50?500nM/L和50?500nM/L。
4. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述柑桔黄脉病毒PCR扩增反应液中还 含有 GoTaq qPCR Master Mix 和 H20。
5. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述柑桔黄脉病毒PCR扩增反应液包 括： 柑桔黄脉病毒上游引物：l〇mM、〇. 5 μ L ; 柑桔黄脉病毒下游引物：10mM、0. 4μ L ; GoTaq qPCR Master Mix :10ug/ul、12. 5μ I ; CXR Refernce Dye :30uM、0. 25 μ L ; ddH20 ：6. 25 μ L〇
6. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括反转录体系，所述 反转录体系中包括柑桔黄脉病毒下游引物。
7. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述反转录体系中，柑桔黄脉病毒下游 引物的终浓度为50?500nM/L。
8. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述反转录体系包括：
9. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括阴性对照品及阳 性对照品中的至少一种。
10. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品包括含有SEQ ID NO: 3所示目的扩增序列的柑桔黄脉病毒质粒；所述阴性对照为DEPC-H2O15
11. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒所采用的PCR检测体系如 下： 柑桔黄脉病毒PCR扩增反应液 20 μ L 待测品 5yL 反应总体系为 25 μ L。
12. 根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述待测品为样本核酸提取液反转 录产物、阳性对照品或阴性对照品。
13. -种使用如权利要求1所述的引物或权利要求2-9任一权利要求所述试剂盒对柑 桔黄脉病毒进行实时荧光定量RT-PCR检测的方法，步骤如下： 1) 制备植物样本核酸提取液； 2) 制备植物样本核酸提取液反转录产物； 3) 加样：将柑桔黄脉病毒PCR扩增反应液置于PCR管中，将植物样本核酸提取液反转 录产物、阳性对照品或阴性对照品分别加入装有检测液的不同PCR管，获得对应的样本反 应管、阳性反应管和阴性对照反应管； 4. PCR扩增：反应管置于定量荧光PCR仪上，设置循环参数，进行PCR扩增； 5. PCR反应结束后，检测PCR反应体系的荧光信号值，阈值设定原则以阈值线刚好超过 DEPC-H2O的最高点。
14. 根据权利要求1所述的引物或权利要求2-9任一权利要求所述试剂盒在制备柑桔 黄脉病毒检测试剂或诊断试剂中的应用。
【文档编号】C12Q1/70GK104232795SQ201410467902
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月15日 优先权日:2014年9月15日
【发明者】陈洪明, 周彦, 王雪峰, 李中安, 唐科志, 周常勇 申请人:中国农业科学院柑桔研究所