一种捕食线虫性真菌的培养方法
【专利摘要】本发明属于微生物学领域，提出一种捕食线虫性真菌的培养方法，包括步骤：1)在无菌条件下，将生长在玉米粉琼脂培养基上的少孢节丛孢菌接种于沙氏葡萄糖肉汤培养基中，于22～26℃恒温培养箱中培养6-7天；2)将培养后的沙氏葡萄糖肉汤培养基连同培养物混于玉米粒或大麦粒批量培养基中，于22～26℃恒温培养箱中进一步培养。本发明根据对捕食线虫性真菌少孢节丛孢菌分生孢子的批量培养及所用培养基的性状分析后，采用沙氏葡萄糖肉汤培养基结合玉米粒或大麦粒批量培养基的双步培养方法，对少孢节丛孢菌分生孢子进行批量培养，确定了捕食性真菌的最适培养基和培养方法及培养时间，为今后进行少孢节丛孢菌分生孢子的大批量培养奠定了基础。CGMCC No. 80582013.08.16
【专利说明】一种捕食线虫性真菌的培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物学领域，具体涉及一种捕食线虫真菌的培养方法。
【背景技术】
[0002] 大多数捕食性真菌属于半知菌纲，是自然界非常珍贵的生物资源，到目前已发现 140余种，在土壤、动物粪便、苔藓及植物根部附近及动物残体上都有广泛的分布。此类真菌 的营养方式为多样性，但大多属于兼性腐生菌 [1]。
[0003] 在家畜线虫病的生物控制中，很重要的一个方面就是利用存在于自然界的捕食线 虫性真菌对线虫感染进行控制，这种生物控制方法目前已引起各国生物学家多年来极大的 关注。但其应用首先需要解决的前提条件是对捕食线虫性真菌的孢子进行大批量的培养。
[0004]关于捕食线虫性真菌的实验室培养方法，主要包括在玉米粉琼脂培养基（CMA)，水 琼脂培养基（WA)或马铃薯琼脂培养基（PDA)等培养基中进行培养。而在批量培养方面，国 外最早是将少孢节丛孢菌从CMA中转接到大麦粒培养基中培养3周，用于临床家畜线虫病 防治研究[2];国内最早报道的方法主要是首先将少孢节丛孢菌（A.oligospora)在CMA中培 养1周之后，再转接到玉米粒中培养3周[3]。
[0005] 综合现有资料来看，虽然有关捕食性真菌的批量培养方法很多，但是究竟哪一种 方法最适合，还需要通过试验研究进行验证。
[0006] 参考文献
[0007] 1.满达.捕食线虫性真菌一少孢节丛孢菌超微结构与生化组分的研究[D].呼和 浩特：内蒙古农业大学，2004 :2_6
[0008] 2.GronvoldJ,ffolstrupJ1LarsenM,etal.BiologicalcontrolofOstertagia ostertagibyfeedingselectednematode-trappingfungitocalves[J].Journalof Helminthology, 1993, 67(I):31-36
[0009] 3.杨莲茹，考桂兰，杨晓野，等.少孢节丛孢菌孢子批量培养及通过动物消化道 的试验[J].中国兽医科技，2004, 34(1) :50-53
【发明内容】
[0010] 针对本领域存在的问题，本发明的目的是提出一种捕食线虫性真菌的培养方法。
[0011] 实现本发明目的的技术方案为：
[0012] 一种捕食线虫性真菌的培养方法，包括步骤：
[0013] 1)在无菌条件下，将生长在玉米粉琼脂培养基上的少孢节丛孢菌接种于沙氏葡萄 糖肉汤培养基中，于22?26°C恒温培养箱中培养6?7天；
[0014] 2)将步骤1)培养后的沙氏葡萄糖肉汤培养基混合物接种于玉米粒或大麦粒批量 培养基中，于22?26°C恒温培养箱中培养。
[0015] 其中，所述步骤1)中所述玉米粉琼脂培养基的制备方法为：按照玉米粉40g加入 IOOOmL蒸馏水的比例，称取玉米粉，加入蒸馏水中加热煮沸，待溶液沸腾后，用微火持续煮 沸lh，期间不断进行搅拌，最后用蒸馏水将溶液补足至lOOOmL，用450目纱网过滤，将滤液 用蒸馏水稀释100倍，调节PH值至6. 0?6. 2,最后加入2 %琼脂粉，于121°C条件下高压灭 菌20min之后，于4°C放置备用。
[0016] 其中，所述沙氏葡萄糖肉汤培养基的制备方法为：按照IOg沙氏葡萄糖肉汤培养 基、0.Ig琼脂粉、200mL蒸馏水的比例，称取沙氏葡萄糖肉汤培养基和琼脂粉，加入蒸馏水， 将溶液加热至沸腾时立即取出，使溶质充分溶解，于121°C条件下高压灭菌15min，放置备 用。
[0017] 优选地，所述步骤1)中，玉米粉琼脂培养基与沙氏葡萄糖肉汤培养基体积比为 0· 1?0· 2cm3 :10?20mL，于25°C下lOOr/min的恒温摇床中培养7d。
[0018] 其中，所述步骤2)中，将已培养好的少孢节丛孢菌沙氏葡萄糖肉汤培养基混合物 倒入玉米粒或大麦粒批量培养基中，沙氏葡萄糖肉汤培养基混合物的体积与玉米粒或大麦 粒批量培养基质量比例为Iml:9?llg，最后分别将沙氏葡萄糖肉汤培养基混合物与玉米 粒或大麦粒搅拌均匀，于25°C恒温培养箱中培养。
[0019] 为了评价培养的结果，优选地，所述步骤2)培养后，用孢子洗脱液少量多次地洗 脱分生孢子，最后再用洗脱液将分生孢子悬液均定容到10mL，混匀后用白细胞计数板计数， 得出每克批量培养基所含分生孢子的数量。
[0020] 其中，所述孢子洗脱液制备方法为：吸取2mL吐温-80,加入IOOOmL蒸馏水中，于 121°C条件下高压灭菌20min后，放于室温下备用。
[0021] 本发明的有益效果在于：
[0022] 本发明根据国内外捕食线虫性真菌少孢节丛孢菌（A.oligospora)分生孢子的批 量培养方法并对所用培养基的性状进行分析后，采用沙氏葡萄糖肉汤培养基结合玉米粒或 大麦粒批量培养基的双步培养方法，对少孢节丛孢菌（A.oligospora)分生孢子进行批量 培养，并分别在培养至第3周、4周和5周时对分生孢子进行计数及形态学观察，确定了菌株 最适培养基和培养时间，为今后进行捕食性真菌孢子的大批量培养奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0023] 图1为捕食线虫性真菌-少孢节丛孢菌在玉米粒上的培养结果照片。
[0024] 图2为捕食线虫性真菌-少孢节丛孢菌在大麦粒上的培养结果照片。
【具体实施方式】
[0025] 现以以下实施例来说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中使用的手 段，如无特别说明，均使用本领域常规的手段。
[0026] 本发明涉及的捕食线虫性真菌少孢节丛孢菌（ArthrobotrysoligosporaCIMl) 菌株，该菌株的保藏号为=CGMCCNo. 8058,保藏日期：2013年8月16日。
[0027] 所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101，电话： (010)64807355。
[0028] 实施例中，生化培养箱SP-02型，购自湖北黄石恒丰医疗有限公司；立式压力蒸 汽灭菌器LDZX-50FBS型，购自上海申安医疗器械厂；超净工作台，购自哈尔滨东联仪器有 限公司；BX51TF-0LYMPUS显微镜，购自日本奥林巴斯公司；NHWY-2102C摇床，购自常州诺 基仪器有限公司；血细胞计数器，购自上海求精生化试剂仪器有限公司；移液器，购自美国 Thermo公司。
[0029] 吐温-80、琼脂粉和沙氏葡萄糖肉汤培养基，购自北京化学试剂公司；新鲜玉米 粉、玉米粒和大麦粒，购自集贸市场。
[0030] 实施例1 :
[0031] 〇.4g/L玉米粉琼脂培养基（CMA)制备：称取40g用筛网过滤后的玉米粉，加入 IOOOmL蒸馏水中进行加热煮沸。待溶液沸腾后，用微火持续煮沸lh，期间不断进行搅拌，最 后用蒸馏水将溶液补足至IOOOmL,用450目纱网过滤。取IOmL滤液于三角瓶中，加入990mL 蒸馏水，调节pH值至6. 0?6. 2,最后加入20g琼脂粉，于121°C条件下高压灭菌20min之 后，在无菌条件下倒入直径为90_的灭菌培养皿中，于4°C放置备用。
[0032] 玉米粒和大麦粒批量培养基制备：将玉米粒和大麦粒用自来水清洗干净，于烘箱 内烘干，分别装于250mL三角瓶内，每种培养基12瓶，每瓶70g，每瓶加70mL蒸馏水，于 121°C条件下，高压灭菌20min备用。
[0033] 单步培养法：
[0034] 即在玉米粒培养基或大麦粒培养基批量培养。步骤如下：在无菌条件下，将少孢节 丛孢菌接种于玉米粉琼脂培养基中，于25°C恒温培养箱中培养IOd以上，后将长满菌丝和 分生孢子的玉米粉琼脂培养基切成长和宽均为5mm、高5mm的小块，将玉米粒和大麦粒批量 培养基分别取出3瓶、每瓶培养基重量140g，首先用灭菌后的大号镊子将玉米粒和大麦粒 搅拌松散，再于每瓶中放入20块长有菌丝的琼脂块，最后用镊子分别将琼脂块与玉米粒或 大麦粒培养基搅拌均勻，于25 °C恒温培养箱中培养。
[0035] 孢子洗脱液制备：吸取2mL吐温-80加入IOOOmL蒸馏水中，加热使油状吐温-80 与蒸馏水混匀后，然后分装于500mL玻璃瓶中，于121°C条件下高压灭菌20min后，放于室温 下备用。
[0036] 分生孢子的洗脱与计数：将玉米粒和大麦粒培养基分别于第3周、第4周和第5周 时，在无菌条件下每瓶取出3g带有菌落的培养基，用制备好的孢子洗脱液少量多次地洗脱 分生孢子，最后再用洗脱液将分生孢子悬液均定容到10mL，混匀后用白细胞计数板计数，得 出每克培养基所含分生孢子的数量。
[0037] 实施例2.
[0038] 玉米粒和大麦粒培养基、孢子洗脱液制备方法同实施例1。
[0039] 沙氏葡萄糖肉汤培养基制备：分别称取IOg沙氏葡萄糖肉汤培养基和0.Ig琼脂 粉，加入装有200mL蒸馏水的三角瓶中，将溶液加热至沸腾时立即取出，使溶质充分溶解， 分装入50mL三角瓶中，每瓶15mL，于121°C条件下高压灭菌15min，放置备用。
[0040] 双步培养法：
[0041] 即液体培养基加固体培养基两阶段方式培养。步骤如下：取出6瓶事先已制备 好的沙氏葡萄糖肉汤培养基，在无菌条件下将少孢节丛孢菌CM琼脂培养基，平均切为 5X5X5mm的6 ±夬，每个三角瓶中放1 ±夬，于lOOr/min的恒温摇床中，25°C条件下培养7d。 另各取制备好的玉米粒和大麦粒批量培养基各3瓶，每瓶内培养基质量140g，用灭菌后的 大号镊子先将玉米粒和大麦粒搅拌松散，然后将6瓶已培养好的少孢节丛孢菌沙氏葡萄糖 肉汤培养基混合物，分别倒入玉米粒和大麦粒批量培养基中，最后分别将沙氏葡萄糖肉汤 培养基混合物与玉米粒或大麦粒搅拌均匀，于25°C恒温培养箱中培养。培养效果参见图1 和图2。
[0042] 分生孢子的洗脱与计数：将玉米粒和大麦粒培养基分别于第3周、第4周和第5周 时，在无菌条件下每瓶取出3g带有菌落的培养基，用制备好的孢子洗脱液少量多次地洗脱 分生孢子，最后再用洗脱液将分生孢子悬液均定容到10mL，混匀后用白细胞计数板计数，得 出每克培养基所含分生孢子的数量。
[0043] 结果比较：少孢节丛孢菌分生孢子批量培养结果
[0044] 单步培养法：将在玉米粉琼脂培养基中培养的少孢节丛孢菌（A.oligospora CIMl)分别转接到玉米粒或大麦粒固体批量培养基上进行培养，培养结果见表1。由表中数 据可知，在玉米粒批量培养基中，第3周时分生孢子的数量为3. 0XIO6个/g，至第5周时为 3.IXIO6个/g;在大麦粒批量培养基中，第3周时分生孢子的数量为2. 7XIO6个/g，至第 5周时为2. 8XIO6个/g;经SAS软件分析发现，第3周、第4周和第5周时每克玉米粒培养 基与每克大麦粒培养基所含分生孢子数量相比差异均不显著（P> 0.1);就单一培养基而 言，第3周、第4周和第5周时每克培养基所含分生孢子数相比差异也不显著（P> 0.1)。
[0045] 双步培养法：将在玉米粒琼脂培养基中培养的少孢节丛孢菌菌首先在沙氏葡萄糖 肉汤培养基中培养1周，之后再分别转接到玉米粒和大麦粒固体批量培养基上进行培养， 培养结果见表2。由表中数据可知，在玉米粒批量培养基中，第3周时分生孢子的数量为 3. 5XIO6个/g，至第5周时为3. 6XIO6个/g;在大麦粒批量培养基中，第3周时分生孢子 的数量为3. 6XIO6个/g，至第5周时为3. 5XIO6个/g;经SAS软件分析发现，第3周、第 4周和第5周时每克玉米粒培养基和每克大麦粒培养基所含分生孢子数量相比差异均不显 著（P> 〇. 1);就某一种培养基来说，第3周、第4周和第5周时每克培养基所含分生孢子 数量相比差异也不显著（P> 〇. 1)。
[0046] 但同一种培养基在两种不同的培养模式（单步培养和双步培养）下，在第3周、第 4周和第5周时每克培养基所含分生孢子数量相比差异均极显著（P< 0.01)。
[0047] 表1少孢节丛孢菌分生孢子单步培养法培养结果
【权利要求】
1. 一种捕食线虫性真菌的培养方法，其特征在于，包括步骤： 1) 在无菌条件下，将生长在玉米粉琼脂培养基上的少孢节丛孢菌接种于沙氏葡萄糖肉 汤培养基中，于22?26°C恒温培养箱中培养6-7天； 2) 将步骤1)培养后的沙氏葡萄糖肉汤培养基连同培养物接种于玉米粒或大麦粒批量 培养基中，于22?26°C恒温培养箱中培养。
2. 根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤1)中玉米粉琼脂培养基 的制备方法为：按照玉米粉40g加入lOOOmL蒸馏水的比例称取玉米粉，加入蒸馏水中加热 煮沸，待溶液沸腾后，用微火持续煮沸lh，期间不断进行搅拌，最后用蒸馏水将溶液补足至 lOOOmL，用450目纱网过滤，将滤液用蒸馏水稀释100倍，调节pH值至6. 0?6. 2,最后加入 2(%琼脂粉，于1211：条件下高压灭菌2〇1^11之后，于41：放置备用。
3. 根据权利要求1所述培养方法，其特征在于，所述步骤1)中的沙氏葡萄糖肉汤培养 基的制备方法为：按照l〇g沙氏葡萄糖肉汤培养基、〇. lg琼脂粉、200mL蒸馏水的比例，称取 沙氏葡萄糖肉汤培养基和琼脂粉，加入蒸馏水，将溶液加热至沸腾时立即取出，使溶质充分 溶解，于121°C条件下高压灭菌15min，放置备用。
4. 根据权利要求1-3任一所述培养方法，其特征在于，所述步骤1)中，玉米粉琼脂培养 基与沙氏葡萄糖肉汤培养基体积比为〇. 1?〇. 2cm3 :10?20mL，于25°C下，100r/min的恒 温摇床中培养7d。
5. 根据权利要求4所述培养方法，其特征在于，所述步骤2)中，将已培养好的少孢节 丛孢菌沙氏葡萄糖肉汤培养基混合物，倒入玉米粒或大麦粒批量培养基中，沙氏葡萄糖肉 汤培养基的体积与玉米粒或大麦粒批量培养基质量比例为lml :9?llg，最后分别将沙氏 葡萄糖肉汤培养基混合物与玉米粒或大麦粒批量培养基搅拌均匀，于25°C恒温培养箱中培 养。
6. 根据权利要求1?3任一所述制备方法，其特征在于，所述步骤2)培养后，用孢子洗 脱液少量多次地洗脱分生孢子，最后再用洗脱液将分生孢子悬液均定容到10mL，混匀后用 白细胞计数板计数，得出每克培养基所含分生孢子的数量。
7. 根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述孢子洗脱液制备方法为：吸取2mL 吐温-80,加入lOOOmL蒸馈水中，于121°C条件下，高压灭菌20min后，放于室温下备用。
【文档编号】C12N1/14GK104263657SQ201410471011
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月16日 优先权日:2014年9月16日
【发明者】杨晓野, 王瑞, 杨莲茹, 张伟 申请人:内蒙古农业大学