一种在哺乳动物细胞系中敲除mir-505的方法
【专利摘要】本发明涉及一种在哺乳动物细胞系中敲除mir-505的方法，通过体外合成sgRNA的核苷酸单链，再经过处理得到插入片段，随后将sgRNA利用同源重组或T4连接插入到41824载体中或42230载体中，转化至大肠杆菌的感受态细胞，然后对载体进行菌落PCR检测和测序确认，得到表达载体，通过将PCR产物变性，再退火的方式形成异源杂交双链，利用T7E1酶切试验确定利用CRISPR-Cas9系统对mir-505基因的剪切效率。本发明为如何选择sgRNA表达载体提供参考。
【专利说明】一种在晡乳动物细胞系中敲除mi r-505的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因敲除方法领域，特别涉及一种在哺乳动物细胞系中敲除mir-505 的方法。
【背景技术】
[0002] 1987年，日本课题组在E. coli K12的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序 列，在之后的研究中发现这类间隔重复序列广泛存在于细菌和古生菌的基因组中，在2002 年，被科学家正式命名为规律成簇间隔短小回文重复序列（CRISPR)。
[0003] CRISPR发现是一种细菌和古生菌的一种免疫系统，它是由一列短小的保守重复序 列被具有相似大小的独特的DNA序列所间隔，一种独特的DNA序列叫做间隔区，这些间隔区 通常来源于噬菌体或质粒DNA。CRISPR列和Cas (CRISPR-associated)基因形成CRISPR-Cas 适应免疫系统[5_7]。CRISPR/Cas系统的功能是这样行使的：将入侵的核酸片段作为间隔区 合并入宿主基因组，随后将这些间隔区作为模板，产生小RNA分子（crRNA)，这些crRNA能够 和Cas蛋白结合成为效应复合物，它能够在下一轮的侵染中将外源核酸沉默掉。
[0004] Type II系统仅仅需要Cas9蛋白（以前称为Cas5或Csnl)就可以用于DNA干 扰。Type II系统进行靶基因的双链断裂的步骤：（i)pre-crRNA和tracrRNA从CRISPR位 点被转录下来；（ii) tracrRNA和pre-crRNA中的正向重复序列杂交形成双链，并与Cas9结 合，pre-crRNA通过RNase III和某未知核酸酶作用形成成熟的crRNA。该成熟的crRNA中 包含有短的间隔序列；（iii)成熟crRNA: tracrRNA杂交双链引导Cas9蛋白到靶DNA位点， DNA 祀点需含有 protospacer 和必需的 PAM(protospacer adjacent motif)，这一过程是通 过crRNA的间隔序列于protospacer DNA间形成杂化双链来完成；（iv)Cas9蛋白介导革巴位 DNA中PAM上游进行剪切，在protospacer中进行双链断裂（图1)。
[0005] CRISPR/Cas9系统已在最近一年中成为最炙手可热的基因编辑工具，用于小鼠，大 鼠，称猴等哺乳动物的基因敲除研究中。
[0006] 2010年，Verduci L等发现miR-505能通过作用于其靶标ASF/SF2(可变剪接因 子）发挥调控小鼠胚胎成纤维细胞的增殖和衰老/凋亡的作用，Karni R等发现在许多细 胞中转染ASF/SF2可以激活mTOR部分信号通路，但是ASF参与调控mTOR的具体方式还不 清楚。Yamamoto Y等在研究肿瘤多药抗性时，发现miR-505是一个新的肿瘤抑制miRNA，与 其呈现负相关的蛋白Akt3,与mTOR通路上的AKT属于同一基因家族。因此miR-505极有可 能通过调控mTOR信号通路发挥其生物学功能，而mTOR通路是目前分子生物学研究的热点， 它能整合细胞内和细胞间的信号，起到调控细胞代谢，生长，增殖和存活等过程的中心调控 者的作用，mTOR通路的改变与多种疾病相关。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题是提供一种在哺乳动物细胞系中敲除mir-505的方 法，本发明方法，为如何选择SgRNA表达载体提供参考。
[0008] 本发明的一种在哺乳动物细胞系中敲除mir-505的方法，包括：
[0009] (1)针对mir-505基因设计sgRNA，然后体外合成SgRNA的核苷酸单链，进行退火， 延伸为双链DNA片段，41824载体用AfI II进行酶切，得到41824线性载体，然后41824线 性载体和双链DNA片段利用同源重组的方法进行片段插入，然后转化至大肠杆菌的感受态 细胞DH5a，涂布到1 %氨苄抗性的琼脂糖LB平板至长出菌落，然后对单菌落进行PCR鉴 定，测序，得到sgRNA表达载体，其中SgRNA的核苷酸单链为：
[0010] sgRNA3-F: 5 ' -TTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGTAAATTGATGCACCCAG TG;(如 SEQ ID NO: 1)
[0011] sgRNA3-R: 5 ' -ACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACCACTGGGTGCATCAATTT AC ;(如 SEQ ID NO:2)
[0012] 或者体外合成sgRNA的核苷酸单链，退火为双链DNA片段，42230载体用Bbs I进 行酶切，得到42230线性载体，然后42230线性载体和双链DNA片段通过T4DNA连接酶连接 进行片段插入，然后转化至大肠杆菌的感受态细胞DH5 a，涂布到1 %氨苄抗性的琼脂糖LB 平板至长出菌落，测序，得到sgRNA/Cas9共表达载体；其中体外合成sgRNA的核苷酸单链 为：
[0013] sgRNA3-F:5' -CACCGTAAATTGATGCACCCAGTG-3' ；（SEQ ID N0:3)
[0014] sgRNA3-R:5' -AAACCACTGGGTGCATCAATTTAC-3' ；（SEQ ID N0:4)
[0015] sgRNA4-F:5, -CACCGCAGAAACATCAATACTTCC-3, ；（SEQ ID N0:5)
[0016] sgRNA4-R:5' -AAACGGAAGTATTGATGTTTCTGC-3' ；（SEQ ID N0:6)
[0017] (2)将上述表达载体转染哺乳动物细胞，孵育48_72h后，提取细胞基因组DNA，然 后利用PCR扩增出包含mir-505基因在内的片段，然后通过将PCR产物进行变性、退火的方 式形成异源杂交双链，通过T7E1酶切异源杂交双链，及2%琼脂糖凝胶电泳，得到各个细胞 群发生的剪切效率。
[0018] 所述步骤（1)中合成sgRNA的核苷酸单链进行退火，延伸，其中PCR体系：加 ddH20 IOul，GT Buffer，1.5ul，dNTP 1.5ul，正负单链（IOP) 1.5ul，BSA 0.2ul，taq 酶 Iul。PCR 程序：95°C 2min，（95°C 30sec，56°C 30sec，72°C lmin)5 个循环，72°C lOmin。
[0019] 所述步骤⑴中PCR鉴定，测序中PCR鉴定的引物为：41824-AflII-L : 5, TTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTT(如 SEQ ID NO:7) ,4 1 824-AfI I I-R ： 5' TTGTACAAGAAAGCTGGGTCT(如 SEQ ID N0:8);双向测序弓丨物为：41824-AflII-L: 5, TTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTT(如 SEQ ID NO:9) ,4 1824-AfI I I-R ： 5' TTGTACAAGAAAGCTGGGTCT(如 SEQ ID NO: 10)。
[0020] 所述步骤（1)中菌落 PCR 鉴定中 PCR 体系：加 ddH20 9. 3ul，GT Buffer I. 5ul， dNTP L 5ul，Primer (2P) L 5ul，BSA (λ 2ul，taq 酶 Iul，最后挑取单菌落作为模板；PCR 程 序：95°C 2min，（95°C 30sec，56°C 30sec，72°C lmin30sec)40 个循环，72°C 10min。
[0021] 得到阳性克隆候选，挑单菌落摇菌得到菌液，取Iml菌液和20ul IOP上下游引物 (上游引物，下游引物各10P)，进行双向测序。
[0022] 所述步骤（1)中退火为双链DNA ;体系：加 ddH20 8. 5ul，正负单链（10P)5ul，GT BufferL 5ul。程序：95°C 4min 后，室温放置 10min。
[0023] 所述步骤（1)单向中测序引物为：42230-BbsI-R :5'CGACTCGGTGCCACTTTT (如 SEQ ID NO: 11)，随机挑选单菌落摇菌得到菌液，取Iml菌液和20ul IOP下游引物，进行单向测 序。所述步骤（2)中哺乳动物细胞为HEK293A细胞。
[0024] 所述步骤（2)中孵育条件为37°C，5% CO2的培养箱中孵育。
[0025] 所述步骤⑵中用PCR扩增出包含mir-505基因在内的的片段：PCR体系：加 CldH2O 9. 5ul，2X hotstart MIX 12. 5ul，Primer(IOP) lul，Template 2ul;PCR 程序：94°C3min, (94°C 30sec，63.2°C 30sec，72°C lmin)35 个循环，72°C 5min。
[0026] 所述步骤（2)中扩增引物为：
[0027] mir-505-L:AGTGTCAGGCCTGCTATGTT;(如 SEQ ID N0:12)
[0028] mir-505-R:CTCCTGGCTTCTACTCCCTG。（如 SEQ ID N0:13)
[0029] 所述步骤⑵将PCR扩增得到的PCR产物利用试剂盒进行产物回收，定量， 取500ng产物进行变性退火形成异源杂交双链；反应体系：PCR产物500ng，T7ElBuffer I. lul，用ddH20补充体系至llul。反应程序：95°C lOmin，（95°C 30sec，共70个循环，每个 循环温度降1°C)，25°C lmin。得到异源杂交双链后，在上述体系中加入0. 5ul T7E1酶，37°C 反应30min，进行酶切。
[0030] 本发明建立一种在哺乳动物细胞系中敲除mir-505基因的方法。针对mir-505基 因设计不同的sgRNA，随后分别将SgRNA插入到SgRNA表达载体（质粒 ：Addgene 41824) 中，或为了提高sgRNA和Cas9蛋白的共传递，将所设计的sgRNA插入到sgRNA/Cas9共表达 载体（质粒=Addgene 42230)中，从而也达到靶点剪切的目的。并且通过对剪切效率的检 测，了解同一条sgRNA是否和Cas9蛋白共表达对靶点的剪切效率产生影响，以及针对相同 基因所设计的不同sgRNA对基因的剪切效率是否不同。
[0031] 本发明首先针对mir-505基因，设计两条不同的sgRNA，其中一条的靶点在 mir505-5P成熟体上游（sgRNA3)，而另一条的靶点位于mir505-5P成熟体中（sgRNA4)。在 构建sgRNA表达载体时，利用体外合成方法合成两条部分碱基互补的DNA单链，随后再对其 进行退火和延伸从而形成一条长的包含sgRNA在内的DNA双链片段，并且该片段两端分别 于41824载体的Afl II酶切位点两端序列同源。而41824载体经Afl II酶切，将其线性 化，随后利用同源重组的方法将DNA片段插入到41824载体的Afl II酶切位点处。在构 建sgRNA和Cas9蛋白共表达载体时，利用体外合成两条单链核苷酸，随后在体外退火使得 两条单链核苷酸通过碱基互补形成双链DNA，该双链即是特异设计的sgRNA，并在两端携带 特定粘性末端。42230载体经Bbs I酶切，并将线性化载体进行纯化；纯化后的线性载体分 别和两条不同双链sgRNA在14°C过夜链接。所有构建好的载体转化制大肠杆菌感受态细 胞DH5 α，提取质粒，经菌落PCR鉴定和测序确认sgRNA正确插入后，获得sgRNA表达载体和 sgRNA/Cas9共表达载体。分别将载体转染哺乳动物细胞，利用Τ7Ε1酶切试验，验证的确在 mir-505基因组上发生剪切。
[0032] 将构建好的针对mir-505的sgRNA表达载体和Cas9表达载体共转染哺乳动物细 胞或将sgRNA/Cas9共表达载体转染哺乳动物细胞，72小时后，提取细胞基因组DNA。利用 PCR方法扩增出包含mir505基因在内约Ikb大小的片段，再通过将PCR产物变性，再退火的 方式形成异源杂交双链，利用T7E1酶切试验确定利用CRISPR-Cas9系统对mir-505基因的 剪切效率。
[0033] 有益效果
[0034] 本发明构建了能够在哺乳动物细胞中能够同时表达Cas9蛋白和sgRNA的载体，并 且针对同一个mir-505基因设计不同GC%的sgRNA，并将SgRNA插入到sgRNA/Cas9共表达 载体中，用于研究不同sgRNA对相同基因的剪切效率是否不同；同时sgRNA插入到sgRNA表 达载体中，用于研究sgRNA是否和Cas9共传递对靶点的剪切效率有所不同；
[0035] 本发明是在42230载体的Bbs I酶切位点插入合成的sgRNA片段，通过测序得到阳 性克隆；同时也在41824载体的Afl II酶切位点插入合成的sgRNA片段，通过菌落PCR和测 序得到阳性克隆。将得到的插入不同sgRNA的共表达载体载体转染哺乳动物细胞或sgRNA 表达载体和Cas9表达载体共转染哺乳动物细胞，随后抽提被转染的细胞的基因组DNA，并 利用PCR的方法扩增得到包含mir505基因在内的片段，通过T7E1酶切试验便可确定不同 GC%的sgRNA的确对相同基因的剪切效率存在影响，GC%偏低会相应降低其靶点的剪切效 率，为以后设计和选择sgRNA提供一定参考。以及由于sgRNA/Cas9共表达载体由于提高了 sgRNA和Cas9蛋白的共传递，的确能够提高靶点的剪切效率，为如何选择sgRNA表达载体提 供参考。
【专利附图】
【附图说明】
[0036] 图1为Type II CRISPR介导DNA双链断裂示意图；
[0037] 图2为构建mir_505sgRNA表达载体不意图；
[0038] 图3为构建mir_505sgRNA/Cas9共表达载体不意图；
[0039] 图4为41824的sgRNA插入片段的电泳图，其中泳道I :marker，泳道2 :退火延伸 后的DNA片段，泳道3 :未退火延伸的单链核苷酸；
[0040] 图5为42230利用不同缓冲体系形成sgRNA插入片段电泳图，其中泳道I :marker， 泳道2 :单链核酸在H20退火，泳道3 :单链核酸在酶切buffer中退火，泳道4 :单链核酸在 PCR buffer中退火，泳道5 :单链核酸未退火；
[0041] 图 6 为 41824-mir-505-sgRNA3载体菌落PCR结构，其中泳道 I :marker，泳道2-16 : 单克隆，泳道17 :阴性，泳道18 :marker ;
[0042] 图7为T7E1酶切试验结构，其中泳道I :marker，泳道2:375ng42230载体， 125ng41824-mir-505-sgRNA3 载体；泳道 3 :500ng42230 载体，200ng41824-mir-505-sgRNA3 载体；泳道 4 :750ng42230 载体，250ng41824-mir-505-sgRNA3 载体，泳道 5 :野生型； 泳道 6 :375ng 42230-mir-505-sgRNA3，泳道 7 :500ng 42230-mir-505-sgRNA3，泳 道：750ng42230-mir-505-sgRNA3，泳道 9 :375ng 42230-mir-505-sgRNA4，泳道 10 : 500ng42230-mir-505-sgRNA4,泳道 ll:759ng 42230-mir-505-sgRNA4。
【具体实施方式】
[0043] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0044] 实施例1
[0045] (1)针对mir-505基因，利用在线sgRNA设计软件设计sgRNA
[0046] sgRNA3 sgRNA4 j'-GTAAATTGATGCACCCAGTGGGGGAGCCAGGAAGTATTGATGTTTCTGCCAGTTTAGC GTCAACACTTGCTGGTTTCCTCTCTGGAGCATC-3' ( ^!1 SEQ ID NO: 14)
[0047] sgRNA3 ：GC% :52% ；
[0048] sgRNA4 ：GC% :43%
[0049] (2)体外合成单链核苷酸链，并形成DNA双链片段
[0050] A. 41824 中 mir-505sgRNA3 插入片段
[0051] sgRNA3-F: 5 ' -TTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGTAAATTGATGCACCCAG TG
[0052] sgRNA3-R: 5 ' -ACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACCACTGGGTGCATCAATTT AC
[0053] 利用PCR体系，将两条单链核苷酸退火并延伸为双链DNA片段，序列长度为98bp， 并通过2 %琼脂糖凝胶电泳进行鉴定（图4)。PCR体系：加 ddH20 10ul，GT Buffer， 1.5ul，dNTP 1.5ul，正负单链（10P)1.5ul，BSA 0.2ul，taq 酶 lul。PCR 程序：95°C2min， (95°C 30sec，56°C 30sec，72°C lmin)5 个循环，72°C lOmin。
[0054] B. 42230 中 mir-505sgRNA3 和 mir-505sgRNA4 插入片段
[0055] sgRNA3-F: 5，-CACCGTAAATTGATGCACCCAGTG-3 '
[0056] sgRNA3-R: 5 ' -AAACCACTGGGTGCATCAATTTAC-3 '
[0057] sgRNA4-F: 5 ' -CACCGCAGAAACATCAATACTTCC-3 '
[0058] sgRNA4-R: 5 ' -AAACGGAAGTATTGATGTTTCTGC-3 '
[0059] 利用不同的缓冲，将两条单链核苷酸退火为双链DNA片段，通过2%琼脂糖凝胶电 泳进行鉴定（图5)。体系1 :加 H20 10ul，正负单链（IOP) 5ul ;体系2 :H20 8. 5ul，正负单链 (10P)5ul，GT Buffer I. 5Ul ;体系 3 :H2〇 8. 5Ul，正负单链（10P)5ul，ITElBuffer I. 5Ul。 程序：95°C 4min后，室温放置lOmin。
[0060] (3) 41824-mir-505-sgRNA3 及 42230-mir505-sgRNA 载体的构建
[0061] A. 41824载体用Afl II进行酶切，线性化后的载体41824和双链sgRNA3通过同 源重组的方法进行片段插入，并转化至大肠杆菌感受态细胞DH5 α，涂布到1 %氨苄抗性 的琼脂糖LB平板至长出菌落，用下列一对引物对单菌落进行PCR鉴定，41824-AflII-L : 5' TTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTT，41824-AflII-R :5' TTGTACAAGAAAGCTGGGTCT
[0062] 2%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，短片段说明没有mir-505-SgRNA3片段插入，出现长 片段说明有mir-505-sgRNA3插入。菌落PCR鉴定中PCR体系：加 ddH20 9. 3ul，GT Buffer I. 5ul，dNTPL 5ul，Primer(2P) I. 5ul，BSA 0· 2ul，taq 酶 lul，最后挑取单菌落作为模板。 PCR 程序：95°C 2min，（95°C 30sec，56°C 30sec，72°C lmin30sec)40 个循环，72°C lOmin。
[0063] 为了确保插入片段的碱基是完全正确的，随后将菌落PCR筛选出的阳性克隆进行 测序鉴定。双向测序引物：41824-AflII-L :5'TTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTT，41824-AflII-R : 5' TTGTACAAGAAAGCTGGGTCT。得到候选阳性克隆，挑单菌落摇菌得到菌液，取Iml菌液和 20ul IOP上下游引物（上游引物，下游引物各10P)，交由生物公司进行商业双向测序。
[0064] B. 42230载体用Bbs I进行酶切，线性化后的载体42230和退火后的sgRNA3 和sgRNA4通过T4DNA连接酶连接进行片段插入，并转化制大肠杆菌感受态细胞DH5 α， 涂布到1 %氨苄抗性的琼脂糖LB平板至长出菌落。由于插入片段过小无法用菌落PCR 方法进行区分，因此通过测序的方法鉴定阳性克隆。单向测序引物：42230-BbsI-R: 5, CGACTCGGTGCCACTTTT
[0065] (4) 41824-mir-505-sgRNA 及 42230-mir-505-sgRNA 对 HEK293A 细胞转染
[0066] 实验前将HEK293A细胞以I. 5 X IO5细胞/孔的密度铺于24孔板中，确保各孔细胞 生长状态良好，密度相仿，待细胞为单层并处于对数中期，细胞汇合度在60%?70%时进 行转染。41824-mir-505-sgRNA和42230两个载体以不同的浓度梯度共转染HEK293A细胞， 同42230-mir-505-sgRNA载体也以不同浓度梯度转染HEK293A细胞。转染后细胞质37°C， 5% CO2的培养箱中孵育72小时。
[0067] (5)利用CRISPR-Cas9能够在mir-505基因位置发生剪切
[0068] 使用动物基因组DNA快速抽提试剂盒提取细胞的基因组DNA，利用PCR的方法扩增 包含 mir-505 基因在内的长片段，扩增引物 mir-505-L: AGTGTCAGGCCTGCTATGTT, mir-505-R :CTCCTGGCTTCTACTCCCTG。对扩增产物进行纯化处理后，各取500ng纯化后PCR产物，通过将 产物变性再退火复性的方法形成异源杂交双链。通过T7E1酶切异源杂交双链，以及跑2% 琼脂糖凝胶电泳，得到各个细胞群发生的剪切效率。
[0069] PCR扩增出包含mir-505基因在内的的片段。PCR体系：加 CldH2O 9. 5ul，2X hotstart MIX 12.5ul，Primer(10P)lul，Template 2ul〇PCR程序：94。〇3111；[11，（94。03086。， 63.2? 30sec，72°C lmin)35 个循环，72°C 5min。
[0070] 将PCR扩增得到的PCR产物利用试剂盒进行产物回收，定量。取500ng产物进行 变性退火形成异源杂交双链反应体系：PCR产物500ng，T7ElBuffer I. lul，用CldH2O补充 体系至llul。反应程序：95°C10min，（95°C30sec，共70个循环，每个循环温度降TC), 25°C lmin。得到异源杂交双链后，在上述体系中加入0. 5ul T7E1酶，37°C反应30min，进行 酶切。
[0071] 结果如图7所示，1#-3#和5#-7#使用相同GC%的sgRNA，由于5#-7#是SgRNA和 Cas9蛋白是共表达的，所以一定程度上提高其在靶点的剪切效率。5#-7#和8#-10#使用不 同GC%的sgRNA，并且都是SgRNA和Cas9蛋白共表达的，结果由于8#-10#的SgRNA的GC% 为43%，相对偏低，因此其在靶点的剪切效率也较低。
[0072] 因此在使用CRISPR-Cas9系统进行microRNA敲除时，在选择SgRNA是去GC%应为 50%左右，并且提高SgRNA和Cas9蛋白的共传递能够一定程度的提高其基因敲除效率。
【权利要求】
1. 一种在哺乳动物细胞系中敲除mir-505的方法，包括： (1) 针对mir-505基因设计sgRNA，然后体外合成SgRNA的核苷酸单链，进行退火，延伸 为双链DNA片段，41824载体用AfI II进行酶切，得到41824线性载体，然后41824线性载 体和双链DNA片段利用同源重组的方法进行片段插入，然后转化至大肠杆菌的感受态细胞 DH5a，涂布到1 %氨苄抗性的琼脂糖LB平板至长出菌落，然后对单菌落进行PCR鉴定，测 序，得到sgRNA表达载体，其中SgRNA的核苷酸单链为： sgRNA3-F:5' -TTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGTAAATTGATGCACCCAGTG ; sgRNA3-R:5' -ACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACCACTGGGTGCATCAATTTAC ; 或者体外合成sgRNA的核苷酸单链，退火为双链DNA片段，42230载体用Bbs I进行酶 切，得到42230线性载体，然后42230线性载体和双链DNA片段通过T4DNA连接酶连接进行 片段插入，然后转化至大肠杆菌的感受态细胞DH5 a，涂布到1 %氨苄抗性的琼脂糖LB平板 至长出菌落，测序，得到sgRNA/Cas9共表达载体；其中体外合成sgRNA的核苷酸单链为： sgRNA3-F:5' -CACCGTAAATTGATGCACCCAGTG-3' ； sgRNA3-R:5' -AAACCACTGGGTGCATCAATTTAC-3' ； sgRNA4-F:5' -CACCGCAGAAACATCAATACTTCC-3' ； sgRNA4-R:5' -AAACGGAAGTATTGATGTTTCTGC-3' ； (2) 将上述表达载体转染哺乳动物细胞，孵育48-72h后，提取细胞基因组DNA，然后利 用PCR扩增出包含mir-505基因在内的片段，然后通过将PCR产物进行变性、退火的方式形 成异源杂交双链，通过T7E1酶切异源杂交双链，及2%琼脂糖凝胶电泳，得到各个细胞群发 生的剪切效率。
2. 根据权利要求1所述的一种在哺乳动物细胞系中敲除mir-505的方法，其特征在于： 所述步骤（1)中合成sgRNA的核苷酸单链进行退火，延伸，其中PCR体系：加 ddH20 10ul， GT Buffer，I. 5ul，dNTP I. 5ul，正负单链（IOP) I. 5ul，BSA 0· 2ul，taq 酶 Iul ;PCR 程序： 95°C 2min，然后 95°C 30sec，56°C 30sec，72°C lmin，为 5 个循环，72°C lOmin。
3. 根据权利要求I所述的一种在哺乳动物细胞系中敲除mir-505的方法，其 特征在于：所述步骤⑴中PCR鉴定，测序中PCR鉴定的引物为：41824-AflII-L : 5, TTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTT，41824-AflII-R :5, TTGTACAAGAAAGCTGGGTCT ;测 序引物为：41824-AflII-L:5，TTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTT，41824-AflII-R : 5' TTGTACAAGAAAGCTGGGTCT。
4. 根据权利要求1所述的一种在哺乳动物细胞系中敲除mir-505的方法，其特征 在于：所述步骤⑴中菌落PCR鉴定，测序中，PCR体系：加 ddH20 9. 3ul，GT Buffer I. 5ul，dNTPL 5ul，Primer (2P) I. 5ul，BSA 0· 2ul，taq 酶 Iul，单菌落作为模板；PCR 程序： 95°C 2min，然后 95°C 30sec，56°C 30sec，72°C lmin30sec，40 个循环，72°C IOmin ; 得到阳性克隆候选，挑单菌落摇菌得到菌液，取Iml菌液和20ul IOP上下游引物，上游 引物，下游引物各10P，进行双向测序。
5. 根据权利要求1所述的一种在哺乳动物细胞系中敲除mir-505的方法，其特征在 于：所述步骤（1)中退火为双链DNA，体系：加 ddH20 8. 5ul，正负单链（10P)5ul，GT Buffer I. 5ul ;程序：95°C 4min 后，室温放置 lOmin。
6. 根据权利要求1所述的一种在哺乳动物细胞系中敲除mir-505的方法，其特征在于： 所述步骤（1)中测序引物为：42230-BbsI-R:5'CGACTCGGTGCCACTTTT，挑选单菌落摇菌得到 菌液，取Iml菌液和20ul IOP下游引物，进行单向测序。
7. 根据权利要求1所述的一种在哺乳动物细胞系中敲除mir-505的方法，其特征在于： 所述步骤（2)中哺乳动物细胞为HEK293A细胞。
8. 根据权利要求1所述的一种在哺乳动物细胞系中敲除mir-505的方法，其特征在于： 所述步骤（2)中孵育条件为37°C，5% CO2的培养箱中孵育。
9. 根据权利要求1所述的一种在哺乳动物细胞系中敲除mir-505的方法，其特征在 于：所述步骤⑵中用PCR扩增出包含mir-505基因在内的的片段的，PCR体系：加 CldH2O 9.5ul，2X hotstart MIX 12.5ul，Primer(10P)lul，Template 2ul;PCR 程序：94°C3min，然 后 94°C 30sec，63. 2°C 30sec，72°C lmin，35 个循环，72°C 5min。
10. 根据权利要求I所述的一种在哺乳动物细胞系中敲除mir-505的方法，其特征在 于：所述步骤（2)中扩增引物为： mir-505-L:AGTGTCAGGCCTGCTATGTT ； mir-505-R:CTCCTGGCTTCTACTCCCTGo
11. 根据权利要求1所述的一种在哺乳动物细胞系中敲除mir-505的方法，其特征在 于：所述步骤（2)将PCR扩增得到的PCR产物利用试剂盒进行产物回收，定量，取500ng产物 进行变性退火形成异源杂交双链，反应体系：PCR产物500ng，T7ElBuffer I. lul，用CldH2O 补充体系至Ilul ;反应程序：95°C lOmin，然后95°C 30sec，共70个循环，每个循环温度降 1°C，25°C lmin，得到异源杂交双链后，在上述体系中加入0. 5ul T7E1酶，37°C反应30min， 进行酶切。
【文档编号】C12N15/85GK104212836SQ201410478757
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月18日 优先权日:2014年9月18日
【发明者】邓倩云, 周宇荀, 常雪莹, 王斯佳, 肖君华, 李凯 申请人:东华大学