分泌抗苹果茎沟病毒单抗的杂交瘤细胞株、其分泌的抗体、其应用和由该单抗制备的试剂盒的制作方法

分泌抗苹果茎沟病毒单抗的杂交瘤细胞株、其分泌的抗体、其应用和由该单抗制备的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种分泌抗苹果茎沟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。本发明提供一种ASGV病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏名称为：杂交瘤细胞株ASGV，保藏号为CCTCC NO:C201485。本发明的有益效果是：1)提供的杂交瘤细胞株ASGV分泌抗苹果茎沟病毒特异性单克隆抗体，以该单克隆抗体为核心建立的TAS-ELISA和dot-ELISA等免疫学方法及用这些方法建立的试剂盒能高度特异、准确、灵敏的检测苹果茎沟病毒；2)利用本发明所制备的单克隆抗体检测苹果茎沟病毒，不需要昂贵的仪器及试剂；3)利用本发明所制备的单克隆抗体，可以有效地用于进口苗木及田间苹果、梨等苹果茎沟病毒寄主中苹果茎沟病毒的检测。
CCTCC NO:C201485
2014.04.26
【专利说明】分泌抗苹果茎沟病毒单抗的杂交瘤细胞株、其分泌的抗体、 其应用和由该单抗制备的试剂盒

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种单克隆抗体、分泌该抗体的细胞株及其应用。具体涉及一种可中 和ASGV病毒各种基因型的广谱性单克隆抗体、分泌该单克隆抗体的细胞株及该单克隆抗 体的用途。

【背景技术】
[0002] 苹果莖沟病毒（Apple stem grooving virus, ASGV)是一种重要的潜隐病毒，在 果树体内病毒浓度很低，且一般不产生明显症状，常给果树生产带来严重经济损失。该病 在世界各地普遍流行。苹果茎沟病毒在苹果树上通常引起慢性衰退症，严重可减产45%? 73%，果实品质下降。当用感病材料嫁接时，往往导致急性衰退症，对生产造成毁灭性损 失；在梨树上潜隐感染比较普遍，当砧木不耐病时，引起梨严重衰退。苹果茎沟病毒可随苗 木、接穗、砧木等无性繁殖材料嫁接传播，可经种子传播给昆诺藜及百合。能危害苹果、梨、 杏、李、柑橘、称猴桃、搜桃、百合等多种作物。
[0003] 由于该病毒危害严重，传播方式多样，寄主广泛，因此目前仍为我国进境植物产品 禁止携带的有害生物之一，而该病毒的特性为潜隐病毒，在植物体内浓度极低，因此开发特 异性好，灵敏度高的检测及富集方法对于该病毒的防控具有重要意义。
[0004] 目前，用于检测苹果茎沟病毒的方法有ELISA、IC-PCR、RT-PCR、IC/RT - PCR和TC/ RT - PCR等。其中ELISA方法通量大，成本低，但所用抗体为多抗，特异性较差，假阴性情 况较多，而基于PCR的检测方法前处理要求高，成本也较高，特别是不适用于大量样品的筛 选。


【发明内容】

[0005] 本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供ASGV病毒单克隆抗 体、杂交瘤细胞株及应用。为此，本发明的解决方案是：
[0006] 提供一种ASGV病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株保藏于中国典型 培养物保藏中心，保藏名称为：杂交瘤细胞株ASGV，保藏号为CCTCC N0:C201485。保藏日期 为2014年4月26日，经检测为存活。（中国典型培养物保藏中心地址：中国.武汉.武汉 大学，邮编：430072)。
[0007] 抗苹果茎沟病毒的单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10'抗体类型及亚类为 IgGl、kappa链，该单克隆抗体能与目前报道的常见苹果茎沟病毒8个基因型（P-209分离 于日本苹果，登录号D14995;L分离于日本百合，登录号D16681;Li-23分离于日本百合， 登录号AB004063 ;Kumquatl分离于中国台湾的金钱橘，登录号AY646511 ;ASGV-K分离于 韩国的梨树，登录号AY596172 ;UV01分离于巴西苹果，登录号AF438409 ;Kiwifruit分离 于中国山西省的猕猴桃，登录号AF522459;KRL-1分离于中国新疆的库尔勒香梨，登录号 AY886760)的外壳蛋白亚基有特异性免疫结合反应。
[0008] 苹果茎沟病毒不同分离物核苷酸序列之间存在较大差异，尤其是0RF1编码的靠 近CP区的284个氨基酸，序列变异更大，称为可变区（V-region)，而该病毒MP基因与CP基 因相对保守，且CP基因的保守性更强。因此利用CP基因所编码的蛋白进行动物免疫并制 备单克隆抗体可以广谱性、特异性地检测各种基因型的ASGV病毒。
[0009] 本发明的试剂盒、试剂或药剂中，ASGV病毒CP选自已经报道ASGV 8个分离物中 的Kiwifruit (分离于中国山西省的称猴桃，登录号AF522459)的序列，该序列所表达的CP 蛋白所制备的抗原最终免疫小鼠获得的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体能同时与常见的8 个基因型CP蛋白结合，具有良好的包容性。
[0010] 本发明的有益效果是：1)提供的杂交瘤细胞株ASGV分泌抗苹果茎沟病毒特异性 单克隆抗体，以该单克隆抗体为核心建立的TAS-ELISA和dot-ELISA等免疫学方法及用这 些方法建立的试剂盒能高度特异、准确、灵敏的检测苹果茎沟病毒；2)利用本发明所制备 的单克隆抗体检测苹果茎沟病毒，不需要昂贵的仪器及试剂；3)利用本发明所制备的单克 隆抗体，可以有效地用于进口苗木及田间苹果、梨等苹果茎沟病毒寄主中苹果茎沟病毒的 检测。本发明提供的杂交瘤细胞株ASGV能大量分泌苹果茎沟病毒单抗，且其分泌的单抗特 异性强、效价高、稳定性好。以该单抗为核心建立了检测苹果茎沟病毒的高通量的血清学方 法及其试剂盒，可成功应用于进境植物材料及田间的检测，从而为预防苹果茎沟病毒随苗 木传入我国及我国苹果茎沟病毒早期监测和预警，科学指导防控提供物质和技术支持。

【具体实施方式】
[0011] 分泌抗病多茎沟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株ASGV于2014年4月26日保藏 于中国典型培养物保藏中心（China Center for Type Culture Collection，简称 CCTCC) (湖北省武汉市武昌珞珈山，武汉大学，保藏中心），保藏号为CCTCC No :C201485,它能分泌 抗苹果茎沟病毒的单克隆抗体。
[0012] 抗苹果茎沟病毒的单克隆抗体腹水间接ELISA效价均达ΚΓ7,抗体类型及亚类均 为IgGl、kappa链，该单克隆抗体能与苹果茎沟病毒的外壳蛋白亚基有特异性免疫结合反 应。
[0013] 抗苹果茎沟病毒的单克隆抗体仅与苹果茎沟病毒有特异性免疫反应，而与苹果 花叶病毒（Apple Mosaic Virus，ApMV)、苹果镑果类病毒（Apple Scar Skin Viroid， ASSVd)、苹果绿皱果病毒（Apple Green CrinkleVirus，AgrCV)、苹果褪绿叶斑病毒（Apple Chlomtie Leafspot Virus，ACLSV)、苹果莖痘病毒（Apple Stem Pitting Virus，ASPV)均 不发生免疫反应。
[0014] 抗苹果茎沟病毒单克隆抗体在该病毒检测上的应用是以单克隆抗体为核心建立 的各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。
[0015] 一、杂交瘤细胞获得及其单克隆抗体的制备
[0016] 1.免疫原及检测抗原的制备
[0017] 根据已报道的苹果茎沟病毒编码外壳蛋白基因序列（登录号：AF522459)设计 一对特异引物：CPUP (5 ' - GGATCC ATGAGITTGGAAGACGTGCT-3 '，斜体部分为 BamH I 酶切位点和 CPNP (5 ' - GGATCC CTAACCCTCCAGTTCCAAGT-3 \ 斜体部分为 BamH I 酶 切位点），并由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。利用Trizol法提取苹果病样的总 RNA，以总RNA为模板，进行反转录，37 °C，15min逆转录反应后，98 °C 5min灭活酶后将 cDNA保存于4°C或者_20°C待用。以cDNA为模板进行PCR反应，即上述反转录的cDNA 模板 1μ l，5XPrimeSTARTM Buffer (含 Mg2+)10y 1，dNTP Mix 4μ 1，PrimeSTARTM DNA Polymerase(2. 5υ/μ L)0. 5μ 1，上下游引物各1 μ 1，最后加无菌双蒸水补足反应终体积 为50μ1。PCR反应参数如下：预变性94Κ，8π?η;变性温度，94%，lmin;退火温度， 48-52冗，lmin ;延伸温度72 9C，lmin ;30个循环后，72 9C，延伸，最后72°C延伸8min。 扩增产物于〇. 8 %琼脂糖凝胶进行电泳分析，并用PCR凝胶回收试剂盒（AxyGEN)回收DNA 片段，具体操作参照产品试剂盒说明书进行。将纯化的PCR产物末端加 A并与克隆载体 PMD-19T simple vector连接，重组质粒命名为pMD19-T-CP，并转化到大肠杆菌DH 5α的 感受态细胞中，用质粒提取试剂盒（TianGen)提取重组质粒，对提取的重组质粒进彳TPCR和 双酶切鉴定，并通过测序验证重组克隆载体PMD19-T-CP中所携带的CP基因序列及读码框 的正确性，序列分析软件为DNAstar、NCBI-BLAST，所用的数据库为GeneBank等。重组质粒 PMD19-T-CP中CP基因片段经BamH I酶切后定向插入经同样酶切的pET-30a表达载体中。 PCR、酶切筛选阳性克隆，并通过测序验证重组原核表达载体pET-30a-CP中所携带CP基因 序列未突变且读码框正确。并把原核表达质粒pET-30a-CP 42°C热击转化入大肠杆菌表达 菌株BL-21 (DE3)中，挑取单菌落接种到含氨苄青霉素的LB液体培养基，37°C培养过夜，按1 :100的比例将培养物接种于含氨苄青霉素的新鲜LB培养基中，振荡培养至0D600?0. 5， 加入终浓度为ImM IPTG诱导表达4h，离心收集菌体。部分菌体加入1 X SDS-PAGE上样缓 冲液悬浮，沸水中变性5-10min，12000rpm离心后取上清10 μ 1进行12. 5% SDS-PAGE电泳 分析，其余菌体经超声波破碎，收集上清按照产品说明书进行用Ni2+-NTA亲和层析柱纯化 目的蛋白。SDS-PAGE电泳发现纯化到了大小为27kD的重组蛋白条带，纯度达到90%以上。 以纯化的重组CP蛋白作为免疫原和检测抗原。
[0018] 2.免疫动物
[0019] 用纯化的ASGV CP蛋白免疫四周龄体重18-20g BALB/C雌性小鼠：纯化的CP蛋 白以生理盐水稀释与等体积弗氏完全佐剂混合，充分乳化后，经背腹部皮下多点注射0. 2ml 每只，间隔3周，取与一免等量抗原和等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化后，第二次腹腔注 射0. 2ml每只，过3周后用加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行融合。
[0020] 3.细胞融合
[0021] 取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0)按6 :1的比例，在无血清的 RPMI-1640 (Gibco)培养基中混匀，1500rpm离心5min，去除培养基，用50% PEG (Sigma，分子 量1500)作为融合剂，在37°C下水浴下加入lml，使其融合2min，用无血清的RPMI-1640培 养基终止融合后1500rpm离心5min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的 细胞板中，37°C，5% C02的细胞培养箱中培养。
[0022] 4.杂交瘤细胞、阳性孔的筛选及其克隆
[0023] 细胞培养箱中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等 到融合细胞覆盖孔底10% -50%时，以ASGV CP重组蛋白和感病叶子汁液为检测抗原包被 ELISA板，用常规间接ELISA方法筛选阳性孔，共获100多个阳性孔。选择7个呈强阳性反 应的细胞孔进行有限稀释法克隆，获得1株能分泌抗ASGV的特异性单抗的杂交瘤细胞株 ASGV。经6个月以上体外传代和多次冻存复苏后，细胞株能良好生长，并稳定分泌抗体。经 扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。
[0024] 5.单克隆抗体的特异性检测
[0025] 用感染苹果花叶病毒（ApMV)、苹果锈果类病毒（ASSVd)、苹果绿皱果病毒 (AgrCV)、苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV)、苹果茎痘病毒（ASPV)的病叶汁包被ELISA板，以相 应的健叶提取液作阴性对照，以病毒分离于中国山西省的猕猴桃，登录号AF522459病毒病 叶为阳性对照，用ACP-ELISA法测定单抗的特异性反应。ACP-ELISA方法具体为上述病毒 感染的病叶用液氮研磨成粉末，按l:30(w/v，g/mL)加入ELISA包被液研磨后100ul/孔包 被ELISA板，4°C过夜或37°C 2小时，使其吸附于聚苯乙烯ELISA板孔；PBST洗涤三次后用 3%的脱脂奶粉或1%BSA或4%牛血清封闭30-60min ;加入单抗lOOul/孔，37°C 1-2小时； PBST洗涤三次后加入稀释10000倍的碱性磷酸脂酶（AP)标记兔抗鼠 IgG二抗（Sigma公 司）100ul/孔，37°C 1-2小时，PBST洗涤四次后，用PNPP底物显色，2mol/L氢氧化钠终止反 应后，用酶标仪读取0D405的值，以与阴性0D值比值大于2. 1为阳性。结果发现，ASGV单 抗对ASGV有特异性反应，而与染苹果花叶病毒（ApMV)、苹果锈果类病毒（ASSVd)、苹果绿皱 果病毒（AgrCV)、苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV)、苹果茎痘病毒（ASPV)均无免疫反应。
[0026] 6.单克隆抗体腹水制备及纯化
[0027] 取8周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射0. 3-0. 5ml降植烷（Sigma)，7-10天后腹腔 注入6-10 X 105个杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，采取腹水，3000rpm 离心3min，收集上清液，即为单克隆抗体腹水。取1倍体积腹水加2倍体积0. 06M pH4. 8 醋酸缓冲液稀释，加辛酸（30ul/ml腹水），室温下边加边搅拌，4°C澄清1小时，12000rpm 离心20min，收集上清，再用50 %饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4°C放置2小时，3000rpm离 心20min，沉淀用2倍体积的PBS溶液溶解，在4°C流动透析24小时后即获纯化的腹水抗 体，-70°C保存。
[0028] 7.单克隆抗体的类型和亚类鉴定及其腹水效价测定
[0029] 将纯化的单抗腹水与Sigma公司的标准抗BALB/C小鼠 IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、 IgM抗体作双向琼脂扩散试验，结果发现上述单抗的抗体类型和亚类为IgGl、kappa链。用 间接ELISA方法检测单抗腹水效价，结果为上述单抗腹水效价达到10'
[0030] 二、病毒免疫学检测方法及其试剂盒
[0031] 1.检测ASGV的TAS-ELISA检测方法
[0032] 1. 1. TAS-ELISA方法的操作流程：
[0033] 1)抗ASGV的兔抗血清1:4000倍稀释后（原核表达的ASGV CP重组蛋白免疫兔子 获得）100ul/孔包被聚苯乙烯板，37°C，2-4h或4°C，过夜；
[0034] 2) PBST洗涤三次后加1-10 %的脱脂奶粉或1-3% BSA或3-6 %牛血清封闭200ul/ 孔于 37°C 封闭 30-60min ;
[0035] 3)加入检测样品lOOul/孔。以感染苹果茎沟病毒（病毒为分离于中国山西省的 猕猴桃的毒株，CP蛋白基因登录号AF522459)病叶为阳性对照，以相应的健康样品为作阴 性对照，37°C l_2h ;
[0036] 4)洗涤后用封闭液稀释5000倍的单抗腹水100ul/孔，37°C l_2h。
[0037] 5) PBST洗涤后加入10000倍稀释的AP标记兔抗鼠 IgG二抗（Sigma) 100ul/孔， 37。。 l-2h。
[0038] 6) PBST洗涤后加 PNPP底物于室温显色5_30min，肉眼观察底物颜色变成黄绿色的 孔为阳性，2mol/L氢氧化钠终止反应后，用680型酶联免疫检测仪测405nm的0D值，以P/ N>2. 1作为阳性判断标准。
[0039] 1. 2. TAS-ELISA检测方法最适条件的确定：
[0040] 采用TAS-ELISA方阵试验进行，即横向分别加用包被缓冲液从1 : 100至1 : 100000倍比稀释的兔抗ASGV血清；加入ASGV病叶汁；纵向分别加用封闭液从1 : 5至1 :2000000倍比稀释单抗腹水；AP标记的兔抗鼠 IgG二抗（Sigma公司产品）1 : 10000倍 稀释；按TAS-ELISA方法流程进行操作。结果为ASGV的兔抗血清及单抗的最适稀释度分别 为1 : 5000、1 : 8000。
[0041] 1. 3. TAS-ELISA方法检测灵敏度的确定
[0042] 在兔抗血清和单抗腹水最适工作浓度下，将ASGV病叶汁用PBS倍比稀释后进行 TAS-ELISA测定，结果表明TAS-ELISA检测病叶达到1:6000倍稀释（w/v，g/mL)，说明本方 法具有很好的灵敏度。
[0043] 2. dot-ELISA方法的建立及田间检测应用
[0044] 2. 1 dot-ELISA方法的操作流程：
[0045] 将苹果叶片称重后用液氮研磨成粉末，按1:10?30(w/v, g/mL)加入0· Olmol/ LPBS(pH7. 4)后研磨；病汁液5000rpm离心3min ;取3μ 1上清点到硝酸纤维素膜（NC)上， 同时设置健康和感病苹果叶汁分别作为阴性和阳性对照；室温干燥10?20min ;NC膜浸 入到含5%脱脂奶粉的PBST(含0· 05% Tween-20的0· 01mol/L PBS)封闭液中室温封闭 30min ;NC膜放入适度稀释的单抗中室温孵育30?60min ;用PBST洗膜3?4次，每次3min ; NC膜放入适度稀释的AP酶标记羊抗鼠 IgG二抗中室温孵育30?60min ;PBST洗膜4?5 次，每次3min ;66 μ L NBT和33 μ L BCIP底物（Promega)加入到10ml底物缓冲液（0· lmol/ L Tris C1、0. lmol/L NaCl、0. 025mol/L MgCl、pH9. 5)混匀，膜放入底物液中反应，肉眼观察 结果。待阳性对照显色明显，而阴性没有任何显色时自来水漂洗终止反应，拍照记录结果。
[0046] 2. 2用方阵试验确定检测苹果病叶的dot-ELISA单抗和酶标二抗的最适工作浓 度，试验表明ASGV单抗及酶标二抗的最适工作浓度分别为1:5000和1:8000倍稀释。以上 述抗体的最适工作浓度建立检测ASGV的dot-ELISA方法。灵敏度分析表明，当苹果叶片稀 释到1:640倍（w/v，g/mL)时，以ASGV单抗建立的dot-ELISA检测均呈现紫色的阳性斑点， 即其检测病叶的灵敏度达到1:640倍稀释。
[0047] 2. 3建立的dot-ELISA方法的样品检测应用
[0048] 用建立的dot-ELISA方法对2012、2013年采自山东及山东口岸进境植物材料等样 品进行检测，结果发现，50个植物检测样品中有2个样品产生紫色的阳性斑点。阳性样品进 一步用RT-PCR分析，结果表明所有的dot-ELISA阳性样品均检测到ASGV特异性的PCR产 物，PCR产物核酸测序表明阳性样品感染ASGV。说明该dot-ELISA方法能准确、可靠地用于 果树类样品中苹果茎沟病毒的检测。
[0049] 3苹果茎沟病毒dot-ELISA检测试剂盒
[0050] 1)试剂盒主要成分：
[0051] ASGV单克隆抗体1管 0.2 ml AP标记羊抗鼠 IgG二抗1管 0.1ml NBT/BCIP底物各1瓶 分别为2 ml和1ml 阳性对照（含ASGV苹果叶片汁液） 1管 2 ml 阴性对照（健康苹果叶片汁液）1管 2 ml 抗体稀释液（10X) 1瓶 80ml
[0052] 以上试剂均保存于4°C下
[0053] 硝酸纤维素膜（NC) 15张
[0054] 2)检测苹果样品的操作步骤：
[0055] a.将苹果叶片称重后用液氮研磨成粉末，按1:10?30 (w/v, g/mL)加入0· Olmol/ L PBS(pH7.4)后研磨；
[0056] b.病汁液 5000rpm 离心 3min ;
[0057] c.取3 μ 1上清点到NC上，同时设置健康和感病苹果叶汁分别作为阴性和阳性对 照，室温干燥10_20min ;
[0058] d. NC膜浸入到含 5%脱脂奶粉的 PBST (含 0· 05% Tween-20 的 0· 01mol/L PBS)封 闭液中室温封闭30min ;
[0059] e. NC膜放入1:2000倍稀释的单抗中室温孵育30_60min ;
[0060] f.用PBST洗膜3?4次，每次3min ;NC膜放入1:3000稀释的AP酶标记羊抗鼠 IgG二抗中室温孵育30?60min ;
[0061] g. PBST洗膜4?5次，每次3min ;66 μ L NBT和33 μ L BCIP底物加入到10ml底 物缓冲液（〇· lmol/L Tris C1、0. lmol/L NaCl、0. 025mol/L MgCl、pH9. 5)混匀，膜放入底物 液中反应，肉眼观察结果；
[0062] h.待阳性对照显色明显（紫色），而阴性没有任何显色时自来水漂洗终止反应，拍 照记录结果。
[0063] 3)保存及有效期于2?8°C避光保存，有效期12个月。
[0064] 4)缓冲液配方：
[0065] 磷酸盐缓冲液（PBS，0. 01mol/L，ρΗ7· 4):
[0066] NaCI 8 g KCI 0.2g KH2P04 0 2g Na2HP0412H20 3g 叠氮化钠 0.2g 。
[0067] 还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上 实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联 想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【权利要求】
1. 一种分泌抗苹果茎沟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于：该杂交瘤细 胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏名称为：杂交瘤细胞株ASGV，保藏号为CCTCC N0:C201485。
2. -种由权利要求1所述的杂交瘤细胞株ASGV分泌的抗苹果茎沟病毒的单克隆抗体， 其特征在于该抗体腹水间接ELISA效价达到ΚΓ 7,抗体类型及亚类为IgGl、kappa链。
3. -种如权利要求2所述的抗苹果茎沟病毒单克隆抗体在苹果茎沟病毒检测上的应 用。
4. 一种检测苹果茎沟病毒的方法，其特征在于采用间接ELISA进行苹果茎沟病毒抗原 的检测，其中使用了权利要求2所述的单克隆抗体。
5. -种检测苹果茎沟病毒的试剂盒，其特征在于：试剂盒中包含权利要求2所述的单 克隆抗体。
【文档编号】C12N5/20GK104232591SQ201410483664
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月19日 优先权日:2014年9月19日
【发明者】魏晓棠, 尼秀媚, 白桦, 朱妍妍, 齐振华 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心