一株木质素耐受性酿酒酵母菌及其在生物乙醇生产中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株能耐受木质素毒性的酿酒酵母LTY-1（ Saccharomyces cerevisiae LTY-1），已于2014年5月6日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），其保藏编号为CCTCC NO：M2014184。当采用葡萄糖242g/L、蛋白胨10g/L、酵母浸粉61g/L、pH5.5的发酵培养基，在30℃、150rpm条件下发酵36h，酿酒酵母LTY-1的糖转化率为84.4%。当发酵培养基含有紫丁香醇、对羟基苯甲醛和香草醛等木质素成分，且各成分的浓度均为1.44g/L时，酿酒酵母LTY-1的糖转化率仅仅降低了7.0%。其降低程度远远小于原始酵母的18.5%。为改善木质纤维素水解液乙醇发酵效率提供了核心技术和材料。本发明技术可应用于木质纤维素为原料的生物乙醇生产，对促进生物乙醇生产的产业化发展、以及环境保护、粮食安全保障具有重要意义。CCTCC NO：M20141842014.05.06
【专利说明】一株木质素耐受性酿酒酵母菌及其在生物乙醇生产中的应 用
【技术领域】
[0001] 本发明属于本发明涉及生物发酵【技术领域】，具体涉及一株木质素耐受性酿酒酵母 菌及其在生物乙醇生产中的应用。
【背景技术】
[0002] 秸杆、树木边材、牧草等木质纤维素材料是地球上储量最丰富且可持续再生的有 机物资源，其年产约1500亿吨，所含的能量是全世界年消耗能量总和的10倍（刘刚，沈 镭.中国生物质能源的定量评价及其地理分布[J].自然资源学报.2007, 41(3):9?19)。 以木质纤维素为原料的生物乙醇生产和利用被认为是解决能源、环境和粮食问题的有效途 径之一。世界各国都在着力开发木质纤维素生物乙醇生产过程的共性关键技术和专用设 备，以积极推进生物能源产业的发展。
[0003] 木质纤维素生物乙醇生产过程一般包括原料预处理、酶解、乙醇发酵和乙醇精制 等主要步骤。预处理是为了破坏木质纤维素材料的结构，从而取得良好的纤维素水解效 果（曾凡洲，蒋剑春，卫民，等.生物质水解发酵生产燃料乙醇的研究进展[J].生物 质化学工程，2009, 43(2) :43-48);酶解是指利用纤维素酶和半纤维素酶，将纤维素、半纤 维素转化为可发酵性糖；乙醇发酵是指利用酿酒酵母，将酶解液中的可发酵性糖转化为乙 醇。然而，在木质纤维素材料的预处理及酶解过程中，木质素会降解成小片段、以及阿魏 酸、香草醛、紫丁香醇、对羟基苯基醛（醇）等成分。因为这些木质素成分对酿酒酵母具有 毒性，所以木质纤维素水解液的乙醇发酵效率受到严重抑制（李文莉，缪冶炼，陈介余，花 卫俊，邵慧丽.木质素降解物对酿酒酵母的毒性及作用机理，生物加工过程，2014 ;Ezeji T，Qureshi N，Blaschek H P.Butanol production fromagricultural residues:impact of degradation products on Clostridium beijerinckii growth and butanol fermentation[J]. Biotechnol Bioeng，2007, 97:1460-1469)。
[0004] 为了提高木质纤维素水解液的乙醇发酵效率，人们尝试了对木质纤维素水解液 进行发酵前的脱毒处理。脱毒处理方法可以分为物理法、化学法和生物法。目前，物理 法包括活性炭吸附（Wang Lj Chen H Z. Increased fermentability of enzymatically hydrolyzed steam-exploded corn stover for butanol production by removal of fermentation inhibitors [J] · Process Biochemistry，2011，46:604-607)、离子交换吸 附(Larsson S, Reimann A, Joosson L, et al. Comparison of different methods for the detoxification of lignocellulosic hydrolysates of spruce[J]. Appl Microbiol Biotechnol，1999b，77:91-103)、膜分离（黄洲，缪冶炼，陈介余，李文莉.溶液中木质 素和葡萄糖的超滤分离，生物加工过程，2014, 12(2) :56-62);化学法利用NH40H、NaOH、 Ca (OH) 2 和木质素降解物的反应（Qureshi N，Saha B C，Hector R E，et al. Production of butanol (a biofuel)from agricultural residues:Part II-Use of corn stover and switchgrass hydrolysates [J] · Biomass Bioenergy，2010, 34:566-571);生物法利用漆 酶、过氧化物酶催化木质素降解物的聚合反应（薛捃，蒲欢，孙春宝.纤维素稀酸水解 产物中发酵抑制物的去除方法[J].纤维素科学与技术，2004, 12(3) :48-52 ;Cho D H，Lee Y J, Um Y, et al. Detoxification of model phenolic compounds in lignocellulosic hydrolysates with peroxidase for butanol production from Clostridium beijerinckii[J].Appl Microbiol Biotechnol, 2009, 83:1035-1043)。但是，这些方法存 在处理成本高、毒性成分去除率低、糖损失大等问题，因而其产业化应用程度不高。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一目的是提供一株同时具有较强的木质素耐受能力和乙醇发酵 能力的酿酒酵母菌LTY-I (Saccharomyces cerevisiae LTY-1)。本发明以酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)CGMCC2. 1429为原始菌，利用紫外诱变结合定向驯化、筛选的 方法获得酿酒酵母菌株LTY-I。
[0006] 为实现该目的，本发明采用的技术方案如下：
[0007] -株耐受木质素的酿酒酵母菌，其特征在于，其分类命名为酿酒酵母 LTY_l(Saccharomyces cerevisiae LTY-1)，已于2014年5月6日保藏于中国典型培养物 保藏中心CCTCC，地址：中国.武汉.武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO :M2014184。
[0008] 本发明的第二目的是提供上述权利要求1所述的酿酒酵母菌株LTY-I在生产乙醇 中的应用。
[0009] 该应用的具体技术方案如下：
[0010] (1)种子培养：将酿酒酵母菌LTY-I在种子培养基、30°C、180rpm条件下培养至对 数中期，作为种子液；
[0011] (2)乙醇发酵：将种子液按10 %的接种量接入装有50mL发酵培养基的250mL三角 瓶中，在摇床上进行乙醇发酵。
[0012] 进一步的，所述步骤（2)中初始糖浓度220-260g/L，发酵时间36-40h，发酵温度 30-33°C，摇床转速 150-175rpm。
[0013] 进一步的，所述步骤（2)中初始糖浓度为242g/L、发酵时间36h、发酵温度30°C、摇 床转速150rpm。
[0014] 进一步的，所述步骤（2)中，发酵培养基还含有木质素或木质素成分。
[0015] 进一步的，所述的木质素在发酵培养基中的浓度为4. 3g/L。
[0016] 进一步的，所述木质素成分包括紫丁香醇、对羟基苯甲醛、香草醛中的一种或多 种。
[0017] 进一步的，所述的紫丁香醇、对羟基苯甲醛、香草醛在发酵培养基中的浓度各为 I. 44g/L〇
[0018] 本发明的有益效果：
[0019] 本发明的酿酒酵母LTY-I有较强的木质素耐受能力和乙醇发酵能力，当采用葡萄 糖242g/L、蛋白胨10g/L、酵母浸粉61g/L、pH5. 5的发酵培养基，在30°C、150rpm条件下发 酵36h，酿酒酵母LTY-I的糖转化率更是高达84. 4%。当发酵培养基含有紫丁香醇、对羟基 苯甲醛和香草醛等木质素成分，且各成分的浓度均为1.44g/L时，酿酒酵母LTY-I的糖转 化率仅仅降低了 7. 0%，糖向乙醇的转化率仍有77. 4%。其降低程度远远小于原始酵母的 18. 5%，具有较强的木质素耐受性。为改善木质纤维素水解液乙醇发酵效率提供了核心技 术和材料。本发明技术可应用于木质纤维素为原料的生物乙醇生产，对促进生物乙醇生产 的产业化发展、以及环境保护、粮食安全保障具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 以下结合【专利附图】
【附图说明】本发明的特征和有益效果。
[0021] 图1 :表示紫外诱变中的细胞存活率曲线。
[0022] 图2 :突变株MS-W驯化过程中的菌液OD值变化（a、b、c、d、e、f分别表示各木质 素成分浓度为〇. 25、0. 5、0. 75、1. 0、1. 25、I. 5g/L的培养阶段）。
[0023] 图3 :突变株MS-P驯化过程中的菌液OD值变化（a、b、c、d、e、f分别表示各木质 素成分浓度为〇. 25、0. 5、0. 75、1. 0、1. 25、I. 5g/L的培养阶段）。
[0024] 图4 :表示酿酒酵母LTY-I在种子培养基中的生长曲线。
[0025] 图5 :乙醇发酵过程中酿酒酵母LTY-I和原始酵母的发酵液OD值变化（〇酿酒酵 母LTY-I，Λ原始酵母）。
[0026] 图6 :乙醇发酵过程中酿酒酵母LTY-I和原始酵母的糖转化率和残糖浓度变化 (〇酿酒酵母LTY-I的糖转化率，?酿酒酵母LTY-I的残糖浓度，Λ原始酵母的糖转化率，▲ 原始酵母的糖转化率）。
[0027] 本发明提供的能耐受木质素毒性的酿酒酵母菌LTY-I (Saccharomyces cerevisiae LTY-1)，已于2014年5月6日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC)， 地址：中国.武汉.武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO :M2014184。
【具体实施方式】
[0028] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。
[0029] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法的条件。本发明对常规 方法的做了进一步优化，以得到最优的技术效果。
[0030] 实施例1本实施例说明本发明所述的Saccharomyces cerevisiae LTY-1的筛选 方法。
[0031] 本发明筛选中采用的培养基为：
[0032] (1)液体Yro培养基：酵母浸粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，自然pH。
[0033] (2)固体Yro培养基：在液体Yro培养基中加入琼脂20g/L。
[0034] (3)固体再生培养基：在液体Yro培养基中加入琼脂20g/L、蔗糖170g/L。
[0035] (4)种子培养基：酵母浸粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，自然pH。
[0036] (5)发酵培养基：酵母浸粉61g/L、蛋白胨10g/L、葡萄糖350g/L，自然pH。
[0037] 以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) CGMCC2. 1429 (中国普通微生物保藏中 心）为原始酵母菌种。菌种购入后，从安瓿管转接至斜面Yro培养基上，于3〇°c的生化培养 箱中培养48h，连续传两代，进行菌种活化。菌种活化后，在4°C条件下保藏待用。
[0038] 具体筛选步骤如下：
[0039] 1、采用紫外诱变箱对原始酵母的单倍体全细胞及其原生质体进行诱变。紫外灯功 率为15w，灯下垂直距离30cm处有磁力搅拌器，诱变箱体积为50cmX30cmX30cm。
[0040] (1)全细胞诱变
[0041] 将酵母单倍体全细胞在50ml液体YH)培养基中振荡培养（30°C、180rpm、12h)至 对数早期，取5mL适当稀释的菌液（其细胞浓度为IO 6个/mL)于直径为9cm的灭菌培养皿 中，在每个培养皿中放一个回形针并置于紫外诱变箱内的磁力搅拌器上，边搅拌边进行紫 外线照射处理。紫外线照射时间分别设定为40、80、120、160、200、240、280、320、3608。紫外 线照射处理后，取菌液ImL涂布在平板YH)培养基上，每组样品涂5-10个平板，避光条件下 30°C培养48h，测定菌落数（即活细胞数）。紫外诱变中的细胞存活率由下式计算：
【权利要求】
1. 一株耐受木质素的酿酒酵母菌，其特征在于，其分类命名为酿酒酵母LTY-1 cerdisiae LTY-1)，已于2014年5月6日保藏于中国典型培养物保藏中 心，地址：中国.武汉.武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO :M 2014184。
2. 如上述权利要求1所述的酿酒酵母LTY-1在生产乙醇中的应用。
3. 根据权利要求2所述酿酒酵母LTY-1在生产乙醇中的应用，其特征在于，包括如下步 骤： (1) 种子培养：将酿酒酵母菌LTY-1在种子培养基、30 °C、180 rpm条件下培养至对数 中期，作为种子液； (2) 乙醇发酵：将种子液按10 %的接种量接入装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶 中，在摇床上进行乙醇发酵。
4. 根据权利要求3所述的酿酒酵母LTY-1在生产乙醇中的应用，其特征在于，所述 步骤（2)中发酵初始糖浓度220-260g/L，发酵时间36-40h，发酵温度30-33°C，摇床转速 150_175rpm〇
5. 根据权利要求4所述的酿酒酵母LTY-1生产乙醇应用，其特征在于，所述步骤（2)中 发酵初始糖浓度为242 g/L、发酵时间36 h、发酵温度30°C、摇床转速150 rpm。
6. 根据权利要求4-5所述酿酒酵母LTY-1生产乙醇的应用，其特征在于，所述步骤（2) 中，发酵培养基还含有木质素或木质素成分。
7. 根据权利要求6所述酿酒酵母LTY-1生产乙醇的应用，其特征在于，所述的木质素在 发酵培养基中的浓度为4. 3g/L。
8. 根据权利要求6所述的酿酒酵母LTY-1生产乙醇的应用，其特征在于，所述木质素成 分包括紫丁香醇、对羟基苯甲醛、香草醛中的一种或多种。
9. 根据权利要求8所述的酿酒酵母LTY-1生产乙醇的应用，其特征在于，所述的紫丁香 醇、对羟基苯甲醛、香草醛在发酵培养基中的浓度各为1. 44g/L。
【文档编号】C12R1/865GK104263665SQ201410489663
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月23日 优先权日:2014年9月23日
【发明者】缪冶炼, 尤业兵, 季萌, 陈君, 李文莉, 许琳 申请人:南京工业大学