一种山羊传染性胸膜肺炎等温pcr病原现场快速检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种山羊传染性胸膜肺炎等温PCR病原现场快速检测试剂盒，由一套引物、10倍环介导等温扩增反应液、逆转录酶、DNA聚合酶(Bst DNA酶)、阳性对照、阴性对照和显色剂组成；所述的一套引物是由一对引物和一对内引物组成。采用本发明可以定性定量检测传染性胸膜肺炎。本发明利用Bst DNA酶的链置换特性，设计4条引物，识别靶序列的6个区域，在等温条件下生成大量重复的茎环状结构，在定性检测时不需任何特殊设备，只需眼观反应管道颜色变化即可判定，因此具有特异性、敏感性高和检测时间比普通PCR短、适用于羊场现场的快速检测等特点。
【专利说明】-种山羊传染性胸膜肺炎等温PCR病原现场快速检测试剂 合 Sl
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程【技术领域】，涉及一种山羊传染性胸膜肺炎等温PCR病原现场 快速检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 山羊传染性胸膜肺炎（contagious caprine pleuropneumonia，CCPP)是由山羊 支原体山羊肺炎亚种（Mcapricolum subsp.capripneumoniae，Mccp)、丝状支原体山羊亚 种（Mycoplasma mycoides subsp.capri)引起的一种高度接触性呼吸系统疾病，其临诊病 理特征是高热、咳嗽和楽液纤维素性胸膜肺炎，世界动物卫生组织（Office International Des Epizooties，0IE)规定的重要动物传染病之一。
[0003] 自然条件下，Mccp主要感染山羊，各年龄段的山羊均可感染，尤以三岁山羊最易 感。在冬春枯草季节，营养缺乏、气候骤变、羊群密集和寒冷潮湿等因素利于病原的传播和 疾病的发生。多呈地方性流行，一旦发病在羊群中迅速传播，20d左右可波及全群。冬季流行 期平均为15d，夏季持续1个月以上。在羊群中发病率可达100%，急性死亡率可达60%? 70%。
[0004] 病羊是主要的传染源，其病肺组织和胸腔渗出液中含有大量病原体，主要通过呼 吸道分泌物排毒。耐过病羊在相当长时间内通过肺组织向外界排毒。
[0005] CCPP的典型病例特征表现为极度高热（41?43°C )，感染羊群发病率和死亡率都 很高，没有年龄和性别差异，而且妊娠羊容易流产。在高热大约2?3d后，呼吸道症状变得 明显，呼吸加速，显得痛苦，有时还发出呼噜声，持续性剧烈咳嗽。在最后阶段山羊不能运 动，两前肢分开站立，脖子僵硬前伸，有时嘴里不断流出涎水。急性发作时，呼吸系统症状非 常明显，体温41?42°C稽留。但在本病的常发地区也可见亚急性和慢性经过。
[0006] 山羊支原体山羊肺炎亚种（Mccp)模式株为F38株、丝状支原体山羊亚种（Mmc) 模式株为PG3株。典型的CCPP病变仅限于胸腔，表现纤维素性肺炎、胸壁和肺部粘连等症 状，单纯感染不伴随其它器官的损害，主要表现咳嗽、流鼻涕、消瘦、贫血、生长发育迟缓等， 患该病的羊只病程可达数月至数年，并可造成出栏率、毛质和毛量的下降以及饲料和人力 大量的浪费。同时患该病的羊只由于免疫力的下降还能诱发其他病原的继发或混合感染， 造成死亡率上升，给养羊业带来重大的经济损失。目前，CCPP是影响中亚、北非、中东等国 家和地区山羊养殖业的重要疾病之一。我国于1935年在内蒙古百灵庙地区曾流行过山羊 的"烂肺病"。后来又在山西、河北、山东、湖北、云南、江西、新疆以及内蒙等地均有本病的发 生。近年来，随着我国山羊养殖业的发展，在贵州、福建、山东、内蒙古等地陆续报道有疑似 CCPP的发生。据资料记载此病感染山羊发病率为19%?90%，死亡率约为40%?100%。
[0007] 目前，用于检测支原体的方法主要有病原的实验室分离培养法、电镜法、血清学方 法、核酸探针法和PCR法等其中，PCR法是最为敏感的一种检测方法，明显优于分离培养、生 化鉴定、免疫突光检测和ELISA等方法。然而，上述方法存在检测周期长（实验室分离培养 法）、需要特殊的仪器设备（电子显微镜、PCR仪）等原因，而不适合临床的快速检测的要 求。
[0008] 由于MCCP和Mmc的16S rRNA序列测定的较多，也是二者最为保守的核酸序列，且 具有支原体种特异性，因此目前普遍是把MCCP和Mmc的16S rRNA基因作为靴序列设计引 物，通过PCR检测鉴定山羊传染性胸膜肺炎。
[0009] 环介导等温PCR是利用Bst DNA酶的链置换特性，设计4条引物，识别靶序列的6 个区域，在等温条件下生成大量重复的茎环状结构，在定性检测时不需任何特殊设备，只需 眼观反应管道颜色变化即可判定，因此具有特异性、敏感性高和检测时间比普通PCR短、适 用于羊场现场的快速检测等特点。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种山羊传染性胸膜肺炎等 温PCR病原现场快速检测试剂盒，本发明的试剂盒由一套设计的引物、10 X LAMP反应液、逆 转录酶、DNA聚合酶（Bst DNA酶）、阳性对照、阴性对照和显色剂组成。采用本发明可以定性 检测传染性胸膜肺炎。本发明利用Bst DNA酶的链置换特性，设计4条引物，识别靶序列的 6个区域，在等温条件下生成大量重复的茎环状结构，在定性检测时不需任何特殊设备，只 需眼观反应管道颜色变化即可判定，因此具有特异性、敏感性高和检测时间比普通PCR短、 适用于羊场现场的快速检测等特点。本发明的目的具体体现在以下几个方面：
[0011] 1.常规PCR检测技术相比本技术速度慢，从采样到出结果最少需要48h，本技术仅 需30-90分钟；
[0012] 2.常规PCR需要需要PCR仪、电泳系统、凝胶成像系统等大型、昂贵的仪器设备本 技术仅需要一个恒温箱或保温杯即可；
[0013] 3.常规PCR的结果必须在凝胶成像仪下观察，本技术的试剂盒反应完毕后肉眼即 可判定结果；
[0014] 4.本试剂盒检测的敏感性、特异性比常规PCR更高。
[0015] 其具体技术方案为：
[0016] 一种山羊传染性胸膜肺炎等温PCR病原现场快速检测试剂盒，
[0017] 由一套引物、10倍环介导等温扩增反应液、逆转录酶、DNA聚合酶（Bst DNA酶）、 阳性对照、阴性对照和显色剂组成；所述的一套引物是由一对引物和一对内引物组成，其序 列为：
[0018] 引物 I : CGTGGGGAGCAAATAGGATT
[0019] 引物 2 :GGTTCTTCGTGTTGCTTCGA
[0020] 内引物 I : TAATGCGTTAGCTGCAGCGCTG-GTCCACGCCGTAAACGATG
[0021] 内引物 2 : TCCGCCTGAGTAGTATGCTCGC-ATGCTCCACCACTTGTGC
[0022] 其中，所述的一对引物与一对内引物的摩尔数之比为1 : 6?9 ;所述的DNA聚合 酶为具有链置换作用的Bst DNA聚合酶，活力为8个活性单位/微升；所述的阳性对照为含 有插入丝状支原体山羊亚种（PG3)、山羊支原体山羊肺炎亚种（F38)16S rRNA共有的一段 特异序列的阳性质粒，环介导等温扩增反应扩增区位于该特异序列中，其浓度为IO7拷贝/ μ L ;所述的阴性对照为灭菌双蒸水；所述的显色剂为20倍SYBR Green I。
[0023] 优选地，所述的10倍环介导等温扩增反应液是由200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐 酸盐、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、40?100mmol/L硫酸镁、4?IOM甜菜碱、5? 18mmol/L的dNTPs和质量百分浓度0. 1%的Triton X-100组成。
[0024] 优选地，所述的dNTPs为含有四种dNTP的等量混合物。
[0025] 优选地，所述的阳性质粒的制作方法为：采用PCR扩增一段丝状支原体山羊亚种 (PG3)、山羊支原体山羊肺炎亚种（F38)16S rRNA共有的基因特异序列，然后装入PMD18-T 载体，转化至DH5 α感受态细菌，抽取质粒DNA经序列确定后，采用紫外分光光度计测定质 粒DNA的浓度并用灭菌双蒸水调整拷贝数至IO7拷贝/ μ L。
[0026] 优选地，所述的SYBR Green I为高灵敏度的DNA荧光染料。
[0027] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0028] 1、本发明利用Bst DNA酶的链置换特性，设计4条引物，识别靶序列的6个区域， 在等温条件下生成大量重复的茎环状结构，在定性检测时不需任何特殊设备。
[0029] 2、本发明的特异性、敏感性均高于普通PCR技术。
[0030] 3、本发明由于不需经过PCR技术的3个温度的重复循环，检测时间比PCR短。
[0031] 4、本发明的结果判断不需经电泳，比PCR简单，极易推广。对于定量检测，虽然借 助了荧光定量PCR仪，但不需合成荧光探针，只需借助荧光染料SYBR Green I，成本大大减 低。
[0032] 5、本发明的反应温度在60°C?65°C左右，且识别靶基因6个特定区域，引物多聚 体及非特异性扩增几率大大降低，定量准确性大大提高。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
[0034] 一种山羊传染性胸膜肺炎等温PCR病原现场快速检测试剂盒，包括以下步骤：
[0035] 由一套引物、10倍环介导等温扩增反应液、逆转录酶、DNA聚合酶（Bst DNA酶）、 阳性对照、阴性对照和显色剂组成；所述的一套引物是由一对引物和一对内引物组成，其序 列为：
[0036] 引物 I : CGTGGGGAGCAAATAGGATT
[0037] 引物 2 :GGTTCTTCGTGTTGCTTCGA
[0038] 内引物 I : TAATGCGTTAGCTGCAGCGCTG-GTCCACGCCGTAAACGATG
[0039] 内引物 2 : TCCGCCTGAGTAGTATGCTCGC-ATGCTCCACCACTTGTGC
[0040] 其中，所述的一对引物与一对内引物的摩尔数之比为1 : 6?9 ;所述的DNA聚合 酶为具有链置换作用的Bst DNA聚合酶，活力为8个活性单位/微升；所述的阳性对照为含 有插入丝状支原体山羊亚种（PG3)、山羊支原体山羊肺炎亚种（F38)16S rRNA共有的一段 特异序列的阳性质粒，环介导等温扩增反应扩增区位于该特异序列中，其浓度为IO7拷贝/ μ L ;所述的阴性对照为灭菌双蒸水；所述的显色剂为20倍SYBR Green I。
[0041] 所述的10倍环介导等温扩增反应液（通常用" 10 X LAMP反应液"的形式来表示，数 字"10"表示的是使用时稀释的倍数）是由200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、IOOmmol/ L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、40?100mmol/L硫酸缓、4?10M甜菜喊、5?18mmol/L的 dNTPs、和质量百分浓度0. 1%的Triton X-100组成。所述的mmol/L是摩尔浓度的单位，指 的是每升溶液中所含有溶质的摩尔数。
[0042] 所述的dNTPs为含有四种dNTP的等量混合物。所述的阳性质粒的制作方法为：采 用PCR扩增一段丝状支原体山羊亚种（PG3)、山羊支原体山羊肺炎亚种（F38) 16S rRNA共有 的基因特异序列，然后装入PMD18-T载体，转化至DH5 α感受态细菌，抽取质粒DNA经序列 确定后，采用紫外分光光度计测定质粒DNA的浓度并用灭菌双蒸水调整拷贝数至IO7拷贝 /μ L。所述的SYBR Green I为高灵敏度的DNA荧光染料。SYBR Green I与双链DNA的亲 和力非常高。对分子生物学中常用的酶没有抑制作用。
[0043] 本发明工作原理是：环介导等温扩增反应过程是先由引物扩增出内引物扩增所需 要的模板即起始反应物模板的合成；紧接着由内引物引导合成靶基因 DNA片段，由于内引 物扩增的DNA片段含有该引物5,端DNA片段的反向互补序列，因而这些反向互补序列之间 通过杂交形成茎环结构，另外一条内引物与其互补链退火杂交后引导链置换合成反应，在 扩增的DNA片段的另外一端产生了新的茎环结构，形成哑铃状结构，在一小时内该循环反 应可使靶DNA累积到IO 9拷贝，电泳后可见扩增终产物由大小不等的DNA片段组成，呈梯状 条带，也可通过荧光染料来观察扩增结果。LAMP的整个反应分三步完成，即起初反应物模板 的合成、循环扩增阶段、延伸和再循环。
[0044] 以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，本发明的保护范围不限于此，任何熟 悉本【技术领域】的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简 单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
【权利要求】
1. 一种山羊传染性胸膜肺炎等温PCR病原现场快速检测试剂盒，其特征在于， 由一套引物、10倍环介导等温扩增反应液、逆转录酶、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照 和显色剂组成；所述的一套引物是由一对引物和一对内引物组成，其序列为： 引物 1 :CGTGGGGAGCAAATAGGATT 引物 2 :GGTTCTTCGTGTTGCTTCGA 内引物 1 :TAATGCGTTAGCTGCAGCGCTG-GTCCACGCCGTAAACGATG 内引物 2 :TCCGCCTGAGTAGTATGCTCGC-ATGCTCCACCACTTGTGC 其中，所述的一对引物与一对内引物的摩尔数之比为1 : 6?9;所述的DNA聚合酶为 具有链置换作用的Bst DNA聚合酶，活力为8个活性单位/微升；所述的阳性对照为含有插 入丝状支原体山羊亚种PG3、山羊支原体山羊肺炎亚种F38 16S rRNA共有的一段特异序列 的阳性质粒，环介导等温扩增反应扩增区位于该特异序列中，其浓度为1〇7拷贝/ μ L ;所述 的阴性对照为灭菌双蒸水；所述的显色剂为20倍SYBR Green I。
2. 根据权利要求1所述的山羊传染性胸膜肺炎等温PCR病原现场快速检测试剂盒， 其特征在于，所述10倍环介导等温扩增反应液是由200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、 100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、40?100mmol/L硫酸缓、4?10mol/L甜菜喊、5? 18mmol/L的dNTPs、和质量百分浓度0· 1%的Triton X-100组成。
3. 根据权利要求2所述的山羊传染性胸膜肺炎等温PCR病原现场快速检测试剂盒，其 特征在于，所述的dNTPs为含有四种dNTP的等量混合物。
4. 根据权利要求1所述的山羊传染性胸膜肺炎等温PCR病原现场快速检测试剂盒，其 特征在于，所述的阳性质粒的制作方法为：采用PCR扩增一段丝状支原体山羊亚种PG3、山 羊支原体山羊肺炎亚种F38 16S rRNA共有的基因特异序列，然后装入PMD18-T载体，转化 至DH5 α感受态细菌，抽取质粒DNA经序列确定后，采用紫外分光光度计测定质粒DNA的浓 度并用灭菌双蒸水调整拷贝数至1〇7拷贝/ μ L。
5. 根据权利要求1所述的山羊传染性胸膜肺炎等温PCR病原现场快速检测试剂盒，其 特征在于，所述的SYBR Green I为高灵敏度的DNA荧光染料。
【文档编号】C12R1/35GK104263828SQ201410491635
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月12日 优先权日:2014年9月12日
【发明者】敬晓棋, 黄光东, 张琼, 陈生叶 申请人:陕西溯源农业发展有限公司