trnH-psbA序列作为DNA条形码在鉴定南湖菱中的应用及鉴定方法
【专利摘要】本发明公开了trnH-psbA序列作为DNA条形码在鉴定南湖菱中的应用及鉴定方法，所述鉴定方法包括以下步骤：利用PCR扩增待测样品的trnH-psbA序列并进行测序，如果trnH-psbA序列的278bp碱基为A、308bp碱基为T，则判定待测样品为南湖菱。与传统的形态学鉴定方法和DNA指纹标记相比，本发明利用trnH-psbA序列作为DNA条形码鉴定南湖菱，可通过对trnH-psbA序列进行PCR扩增和测序，直接获得鉴定结果，检测准确性高、可重复性高，鉴定时间短。
【专利说明】trnH-psbA序列作为DNA条形码在鉴定南湖菱中的应用及 鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子鉴定【技术领域】，尤其涉及trnH-psbA序列作为DNA条形码在鉴定 南湖菱中的应用及鉴定方法。
【背景技术】
[0002] 南湖菱（Trapa acornis Nakano)为菱科菱属植物，又名无角菱、和尚菱等，因主产 浙江嘉兴南湖而得名，是我国特产的水生经济作物，2009年获得国家地理标志保护产品称 号。南湖菱果实无角、壳薄，富含多种氨基酸、维生素、矿物质和抗癌活性成分，具有重要的 营养价值和药用价值。
[0003] 目前，尚无关于南湖菱分子鉴定的文献报道。关于菱属植物的分类学研究多集中 在常规的形态分类学以及数量分类学、细胞分类学、花粉形态学等方面，对菱各品种的聚类 分析存在一定差异。由于菱的株叶形态及去除菱壳后的果肉等营养形态基本相同，依靠传 统的形态分类学方法在南湖菱的鉴别上存在局限性。近年来已有应用分子生物学方法研究 菱属植物亲缘关系及分子鉴别的研究报道，研究结果多集中在应用DNA指纹标记对菱属植 物进行分类及系统进化方面。鉴于菱在农业及医药领域的重要作用，针对其种质混乱及鉴 别方法的不统一性，对单一品种菱建立一套可靠的分子鉴别方法势在必行。
[0004] DNA条形码（DNA barcoding)技术是利用标准的、具有足够变异的、易扩增且相 对较短的DNA片段在物种内的特异性和物种间的多样性而创建的一种新的生物身份识别 系统，可实现对物种的快速自动鉴定。DNA条形码技术研究中常用的DNA序列有marK、 trnH-psbA、rbcL和ITS等。该技术已被成功应用于生物物种分类和鉴定等领域，并成为进 展最迅速的学科前沿之一。
【发明内容】
[0005] 本发明通过实验发现南湖菱的trnH-psbA序列的278bp和308bp碱基与其它品种 存在差异，基于以上发现，本发明提供了 trnH-psbA序列作为DNA条形码在鉴定南湖菱中的 应用。
[0006] trnH-psbA序列作为DNA条形码在鉴定南湖菱中的应用。
[0007] 本发明还提供了 trnH-psbA序列作为DNA条形码在制备鉴定南湖菱试剂盒中的应 用。
[0008] 本发明还提供了一种鉴定南湖菱的方法，包括以下步骤：
[0009] 利用PCR扩增待测样品的trnH-psbA序列并进行测序，如果trnH-psbA序列的 278bp碱基为A、308bp碱基为T，则判定待测样品为南湖菱。
[0010] 鉴定范围为菱角，可以包括浙江嘉兴南湖菱、浙江温州二角菱、江苏南京二角菱、 浙江嘉兴四角红菱及江苏南京四角菱。
[0011] 南湖菱中所述trnH-psbA序列的碱基序列如SEQ ID NO. 1所示，278bp碱基为A， 308bp碱基为T，如序列满足该条件，说明样品为南湖菱。
[0012] 所述PCR扩增的反应体系为：
[0013] 10XPCRbuffer，2y L ;dNTP mixture，。· 5μ L ;10μΜ 上游引物，0· 5μ L ;10μΜ 下 游引物，〇. 5 μ L ;样品DNAl μ L ;Taq DNA聚合酶，0. 2 μ L ;补充无菌水至20 μ L。
[0014] 所述PCR扩增的引物对为：
[0015] 上游引物：5, -TCCGCCCCTTACTTTCTTCC-3，
[0016] 下游引物：5 ' -CGTAATGCTCACAACTTCCCT-3 '。
[0017] 所述PCR扩增的反应条件为：
[0018] 94°C预变性 5min ;94°C变性 30s，50°C退火 30s，72°C延伸 lmin，共 36 个循环；72°C 延伸 IOmin ;4°C保温 5min。
[0019] 本发明还提供了一种鉴定南湖菱的DNA条形码，碱基序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0020] 与传统的形态学鉴定方法和DNA指纹标记相比，本发明利用trnH-psbA序列作为 DNA条形码鉴定南湖菱，可通过对trnH-psbA序列进行PCR扩增和测序，直接获得鉴定结果， 检测准确性高、可重复性高，鉴定时间短。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1是南湖菱果实照片。
[0022] 图2是本发明的南湖菱及其他品种菱trnH-psbA序列PCR扩增结果电泳图，其 中，泳道1?5分别为：浙江嘉兴南湖菱（Tl-I)、浙江温州二角菱（T2-1)、江苏南京二角菱 (T2-2)、浙江嘉兴四角红菱（T3-1)、江苏南京四角菱（T3-2)，M为DL2000plus DNAmarker。
[0023] 图3是南湖菱及其他品种菱trnH-psbA序列的比对，黑色箭头分别标注南湖菱 trnH-psbA序列的序列特异位点，第278bp碱基为"A"、308bp碱基为"T"。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合【具体实施方式】进一步阐释本发明。
[0025] 实施例1南湖菱的分子鉴定
[0026] 分别从浙江、江苏等地采集菱属三个类别的5个居群的菱角果实，其中南湖菱分 别从浙江省嘉兴市南湖区和秀洲区共4个地点取样。5个鉴定样品分别为浙江嘉兴南湖菱、 浙江温州二角菱、江苏南京二角菱、浙江嘉兴四角红菱及江苏南京四角菱。南湖菱果实照片 参见附图1。
[0027] 利用CTAB法提取上述菱角果肉的基因组DNA，利用Trapa-Fl及Trapa-Rl引物进 行PCR扩增，PCR扩增使用rTaq (Takara，大连，中国）。
[0028] Trapa-Fl :5, -TCCGCCCCTTACTTTCTTCC-3，
[0029] Trapa-Rl :5, -CGTAATGCTCACAACTTCCCT-3，
[0030] PCR 扩增体系为：10XPCRbuffer，2y L ;dNTP mixture，。· 5μ L ;10μΜ Trapa-Fl 引物，0· 5μ L ;10μΜ Trapa-Rl 引物，0· 5μ L ;样品 DNAly L ;Taq DNA聚合酶，0· 2μ L ;补充 无菌水至20 μ L。
[0031] PCR 扩增条件为：94°C预变性 5min ;94°C变性 30s，50°C退火 30s，72°C延伸 lmin， 共36个循环；72°C延伸IOmin ;4°C保温5min。
[0032] 使用I. 5%琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行检测，鉴定。电泳图谱参见附图2。
[0033] 将PCR产物送由生物公司纯化后测序（测序所用引物与PCR所用引物相同），所得 基因序列经校正后即为目的基因序列。用DNAMN序列比对软件进行多重序列比对。序列 比对结果见附图3。南湖菱的trnH-psbA序列在278bp碱基为"A"、308bp碱基为"T"。
【权利要求】
1. trnH-psbA序列作为DNA条形码在鉴定南湖菱中的应用。 2. trnH-psbA序列作为DNA条形码在制备鉴定南湖菱试剂盒中的应用。
3. -种鉴定南湖菱的方法，包括以下步骤： 利用PCR扩增待测样品的trnH-psbA序列并进行测序，如果trnH-psbA序列的278bp 喊基为A、308bp喊基为T，则判定待测样品为南湖菱。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系为： 10XPCRbuffer，2y L ;dNTP mixture，。· 5μ L ;10μΜ 上游引物，0· 5μ L ;10μΜ 下游引 物，〇· 5 μ L ;样品DNA1 μ L ;Taq DNA聚合酶，0· 2 μ L ;补充无菌水至20 μ L。
5. 如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的引物对为： 上游引物：5' -TCCGCCCCTTACTTTCTTCC-3' 下游引物：5' -CGTAATGCTCACAACTTCCCT-3'。
6. 如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应条件为： 94°C预变性5min ;94°C变性30s，50°C退火30s，72°C延伸lmin，共36个循环；72°C延伸 lOmin ;4。。保温 5min。
7. -种鉴定南湖菱的DNA条形码，其特征在于，碱基序列如SEQ ID NO. 1所示。
【文档编号】C12Q1/68GK104293935SQ201410509124
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月28日 优先权日:2014年9月28日
【发明者】李军, 李白, 高广春, 黄嬛 申请人:浙江省嘉兴市农业科学研究院（所）