一种来源于外周血Vδ1γδT细胞的体外激活扩增方法
【专利摘要】本发明公开了一种来源于外周血Vδ1γδT细胞的体外激活扩增方法，所述的方法为：取外周全血，采用密度梯度离心及免疫磁珠分选的方法收集总γδT细胞；将总γδT细胞用含改良1640培养基作为培养液重悬，在5％CO2、37℃条件下进行细胞培养，每2-3天换新鲜培养液，获得体外激活扩增的以Vδ1γδT亚群为主的γδT细胞；本发明的原料获取方便，不存在伦理问题，具备极强的使用价值；本发明所获得的细胞具有较高杀伤实体肿瘤细胞、肿瘤干细胞和血液系统肿瘤细胞的细胞毒活性；本发明获得细胞的方法简单，高效，成本低。
【专利说明】—种来源于外周血V δ 1 Y δ T细胞的体外激活扩增方法
(-)
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种来源于外周血V δ I Υ δ T细胞的体外激活扩增方法。
(二)
【背景技术】
[0002]Y δ T细胞是一类在多种免疫应答及免疫病理反应中具有重要作用的固有淋巴细胞。Y S T细胞有别于大多数a β T细胞，其TCR受体由Y及δ两条链组成。生理情况下，Y δ T细胞在外周血中的数量占T淋巴细胞的0.5%-16%。Y δΤ细胞具有多种细胞亚群，在正常人外周血中主要以VY 9νδ 2 Y δ T细胞亚群为主(大于70% )，νδ I γ δΤ细胞亚群仅占总Y δΤ细胞的1%-10%。Y δ T细胞具有以下特点:1、非MHC限制性；2、分泌多种细胞因子；3、可被炎症，损伤，感染和肿瘤激活；4、肿瘤免疫监视作用等。自从MartinWilhelm等2003年第一次将Y δ T细胞用于治疗非霍奇金淋巴瘤和多发性骨髓瘤的临床试验取得一定效果以来，Y S T细胞的体外激活扩增的技术方法成为新的研究热点，其对肿瘤的过继免疫治疗展现广阔的应用前景。
[0003]目前基于肿瘤的Y δ T细胞过继免疫治疗的研究主要集中在V Y 9V δ 2 Y δ T细胞亚群。与Vy9VS2y δΤ细胞不同，νδ1Υ δ T细胞主要分布在肠上皮、皮肤、脾、肝等组织，在外周血中比例很低。研究报道νδ I γ δ T细胞也有抗肿瘤作用，尤其是上皮来源的肿瘤。因此，νδ?Υ δ T细胞有可能成为肿瘤的细胞过继免疫治疗的候选细胞亚群。但是由于其细胞数量少，体外激活扩增获得大量νδ I γ δ T细胞尤为必要。
[0004]传统的Y δ T细胞体外激活扩增方法主要以扩增Vy 9νδ 2 Y δ T细胞亚群为主，但在体外激活扩增后其细胞活性下降，凋亡细胞数量较多对肿瘤过继免疫治疗尤其是对实体瘤的治疗效果不佳。目前已有研究报道扩增方法PHA+IL-2可以选择性扩增νδ1Υ δ T细胞，并能有效提高其对血液系统肿瘤的杀伤能力(Blood.2011Jul 28;118(4):992-1001.)。但仍存在以下问题:1)细胞扩增效率低，V5 I γ δ T细胞亚群比例扩增至40% -60%，绝对细胞数量增加40-80倍左右，细胞纯度及数量均不能达到临床要求；
2)细胞活性下降且凋亡细胞数量较多，扩增两周后10%-20%的νδI γ δ T细胞亚群凋亡；
3)扩增后Vδ I γ δ T细胞对实体瘤细胞及肿瘤干细胞的杀伤能力没有评价。
[0005]因此，如果能对从外周血获取的Y δ T细胞采用一种扩增效率高，杀伤肿瘤的细胞毒活性强，纯度高，且简单快捷，成本低廉的方法，则对今后大量扩增V δ I γ δ T细胞亚群并将其应用于临床肿瘤过继免疫治疗具有重要的实际应用价值。
(三)
【发明内容】
[0006]本发明目的是提供一种来源于外周血νδ I Υ δ T细胞的体外激活扩增方法，该方法扩增效率高，杀伤肿瘤的细胞毒活性强，纯度高，且简单快捷，成本低廉，解决现有技术中细胞扩增效率低，扩增后细胞活性下降，凋亡细胞数量多，杀伤能力不足的问题。
[0007]本发明采用的技术方案是:
[0008]本发明提供一种来源于外周血V δ I Υ δ T细胞的体外激活扩增方法，所述的方法为:取外周全血，采用密度梯度离心及免疫磁珠分选的方法收集总Y S T细胞；将总Y δτ细胞用含改良1640培养基作为培养液重悬，在5% CO2、37°C条件下进行细胞培养，每2_3天换新鲜培养液，获得体外激活扩增的以V δ I γ δ T亚群为主的Y δ T细胞；所述改良1640培养基组成为:体积浓度10%胎牛血清，50mg/mL青链霉素(青霉素的含量为10000U/ml，链霉素的含量为10mg/ml)，0.1-10 μ g/ml PHA (植物凝集素)和l-100ng/ml IL_7(白细胞介素7)，溶剂为1640培养基。
[0009]进一步，所述密度梯度离心及免疫磁珠分选的方法具体为:
[0010](I)取外周全血，用PBS以体积比1:1稀释，获得外周全血稀释液；
[0011](2)将比重为1.107的Ficoll淋巴细胞分离液加入离心管中，然后将步骤(I)的外周血稀释液缓慢加至Ficoll淋巴细胞分离液上层，水平离心机400g/min，20°C，离心25min,反应液依次分层为上层血清、白膜层细胞、Ficoll分离液层、粒细胞层和底层红细胞层；所述外周血稀释液与Ficoll淋巴细胞分离液体积比3:1;
[0012](3)将步骤(2)分离的白膜层细胞吸出并转移至新的离心管，用5倍体积的PBS洗2次，1000r/min,离心5min,弃上清,收集细胞a ；
[0013](4)以I X 17个细胞/40 μ I磁珠分选缓冲液a的量用磁珠分选液a重悬步骤(3)获得的细胞a，然后加入Y STCR抗体，4°C孵育lOmin，再加入磁珠分选缓冲液b和、δ TCR磁珠抗体，4°C孵育15min，离心，沉淀用PBS洗I次，离心，弃上清，收集细胞b ;所述磁珠分选缓冲液b与磁珠分选缓冲液a体积比为3:4 ;所述γ δ TCR抗体与磁珠分选缓冲液a体积比为1:4;所述Y STCR磁珠抗体与磁珠分选缓冲液a体积比为1:2;所述Y δ TCR磁珠抗体优选购自德国美天旎公司；所述磁珠分选缓冲液a和磁珠分选缓冲液b均为磁珠分选缓冲液，为了便于表述不同步骤所用体积不同而命名，字母本身没有含义；
[0014](5)向步骤(4)获得的细胞b中加入PBS重悬，过MACS磁珠分选柱(阳性选择分离Y δ T细胞:Y δ TCR磁珠抗体结合Y δ T细胞，过磁珠分选柱分离Y δ TCR+的细胞)，PBS清洗柱子3次，1000r/min,离心5min，弃上清，收集细胞C，即获得、δ T细胞。
[0015]进一步，优选所述1640培养基中PHA终浓度为I μ g/ml。
[0016]进一步，优选所述1640培养基中IL-7的终浓度为20ng/ml。
[0017]本发明在现有技术的研究基础上进一步提高，利用简单的培养方法，选择性扩增
Vδ I γ δ T细胞亚群数量约100倍，比例扩增至80%，并提高其杀伤实体瘤(包括肿瘤干细胞)和血液系统肿瘤的细胞毒活性。此技术将促进νδ I γ δT细胞在临床肿瘤过继免疫治疗的应用。
[0018]本发明的有益效果体现在:(I)本发明的原料获取方便，不存在伦理问题，具备极强的使用价值；(2)本发明所获得的细胞具有较高杀伤实体肿瘤细胞、肿瘤干细胞和血液系统肿瘤细胞的细胞毒活性；(3)本发明获得细胞的方法简单，高效，成本低；(4)本发明细胞适合于实体瘤如大肠癌和血液系统肿瘤如慢性髓细胞白血病、急性T淋巴细胞白血病的细胞治疗、药物筛选和作为组织工程的种子细胞。
(四)
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为密度梯度法离心分离外周血单个核细胞分层示意图；
[0020]图2为νδ I Υ δ T细胞体外扩增的情况，A为新鲜分离外周血Y δ T细胞中V5 Iy δ T细胞亚群的比例；Β为体外扩增培养后V δ I Υ δ T细胞增殖情况；C为体外培养扩增后Y δ T细胞中V δ I γ δ T细胞亚群的比例；D为低剂量PHA+IL-7扩增V δ I γ δ T细胞亚群的比例；Ε为高剂量PHA+IL-7扩增V δ I γ δ T细胞亚群的比例；
[0021]图3为单用PHA培养V δ I Υ δ T细胞亚群扩增及凋亡的比例；
[0022]图4为单用IL-7培养V δ I Υ δ T细胞亚群扩增及凋亡的比例；
[0023]图5为体外培养扩增前后V δ I Υ δ T细胞活性比较；
[0024]图6为体外培养扩增前后V δ I Υ δ T细胞毒性相关分子表达，Granzyme B表示颗粒酶，Perforin表示穿孔素，Fasl表示细胞凋亡相关配体，TRAIL表示细胞凋亡相关配体，NKG2D表示自然杀伤细胞表面受体，LFA-1表示粘附分子，NKp30表示自然杀伤细胞表面受体，NKp44表示自然杀伤细胞表面受体，NKp46表示自然杀伤细胞表面受体；
[0025]图7为不同培养体系扩增V δ I Υ δ T细胞情况，其中A为PHA+IL-7和PHA+IL-2培养体系扩增V δ I γ δ T细胞效率比较(左侧为细胞扩增数量统计图，右侧为扩增倍数统计图)；Β为PHA+IL-7和PHA+IL-2培养体系V δ I γ δ T细胞增殖比较(左侧为流式代表图，右侧为统计图)；C为PHA+IL-7和PHA+IL-2培养体系V δ I γ δ T细胞凋亡比较(左侧为流式代表图，右侧为统计图)；D为PHA+IL-7和PHA+IL-2培养体系V δ I γ δ T细胞对大肠癌肿瘤细胞及肿瘤干细胞杀伤能力比较；
[0026]图8为体外培养扩增后V δ I Υ δ T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，A为体外培养扩增后V δ I γ δ T细胞直接杀伤大肠癌肿瘤细胞和肿瘤干细胞能力；Β为体外培养扩增后V5 Iy δΤ细胞杀伤血液系统肿瘤细胞能力；
[0027]图9为体外培养扩增后V δ I Υ δ T细胞对人大肠癌移植瘤小鼠的抑瘤情况，A为抑制荷瘤小鼠肿瘤生长，B为延长荷瘤小鼠的生存时间。
(五)
【具体实施方式】
[0028]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
[0029]本发明实施例所述PBS的pH值为7.4，购自杭州吉诺生物医药技术有限公司。
[0030]实施例1:外周血单个核细胞梯度离心分离
[0031](I)将比重为1.107的Ficoll淋巴细胞分离液(美国GE公司)1ml —次加入50ml离心管底部。
[0032](2)取外周血(院内伦理委员会审批通过，符合国际公约，样本检验合格)，用PBS(pH值为7.4，杭州吉诺生物医药技术有限公司)以体积比1:1稀释，获得外周血稀释液。将30ml外周血稀释液缓慢加入步骤(I) 50ml离心管中Ficoll淋巴细胞分离液(美国GE公司)上层，水平离心机400g/min，20°C，离心25min，反应液依次分层为上层血清、白膜层细胞、Ficoll分离液层、粒细胞层和底层红细胞层；将富集外周血单个核细胞的白膜层细胞(图1)吸出并转移至新的50ml离心管，用5倍体积PBS洗2次，1000r/min，离心5min，弃上清，收集细胞沉淀，即获得外周血单个核细胞。
[0033]实施例2:外周血总Y δ T细胞磁珠分选
[0034]将实施例1中经梯度离心分离的外周血单个核细胞以IXlO7细胞量加入40 μ I磁珠分选缓冲液(德国美天旎公司)重悬，然后加入10μ I的Y STCR抗体(德国美天旎公司)，4°C孵育lOmin，再加入30 μ I磁珠分选缓冲液和20 μ I γ δ TCR磁珠抗体(德国美天旎公司)，4°C孵育15min，离心，沉淀用PBS洗I次，离心，弃上清，收集细胞沉淀。向获得的细胞沉淀中加入500 μ I PBS重悬，过MACS磁珠分选柱(德国美天旎公司)进行阳性选择分离Υ δ T细胞，PBS清洗柱子3次，收集细胞流出液(即磁珠分选柱上冲洗下来的流出液)，将细胞流出液1000r/min，离心5min，弃上清，收集细胞沉淀，即获得总、δ T细胞。
[0035]实施例3:PHA+IL-7体外培养外周血Y δ T细胞
[0036]改良1640培养基:体积浓度10%胎牛血清，50mg/mL青链霉素(青霉素浓度100000IU/mL,链霉素浓度为 10mg/mL)，I μ g/ml PHA (植物凝集素)和 20ng/ml IL-7 (白细胞介素7)，溶剂为1640培养基(美国Gibco公司)。
[0037]用改良1640培养基作为培养液重悬实施例2所获细胞沉淀，在含5% CO2的37°C恒温培养箱进行细胞培养，每2-3天换新鲜培养液，连续培养14天，获得细胞悬液。结果:培养14天后，V5 I γ δ T细胞亚群比例从〈10%扩增至80%左右(图2中A和C所示)。
[0038]对照:体积浓度10%胎牛血清，50mg/mL青链霉素(青霉素浓度100000IU/mL，链霉素浓度为10mg/mL)，0.1 μ g/ml PHA和lng/ml IL-7的1640培养基重悬实施例2所获细胞沉淀，在含5% CO2的37°C恒温培养箱进行细胞培养，每2-3天换新鲜培养液，连续培养14天，获得细胞悬液。结果:培养14天后，V5 Iy δ T细胞有效被扩增，但扩增略低于上述改良1640培养基(图2中D所示)。
[0039]对照:体积浓度10%胎牛血清，50mg/mL青链霉素(青霉素浓度100000IU/mL，链霉素浓度为10mg/mL)，10 μ g/ml PHA和100ng/ml IL-7的1640培养基重悬实施例2所获细胞沉淀，在含5% CO2的37°C恒温培养箱进行细胞培养，每2-3天换新鲜培养液，连续培养14天，获得细胞悬液。结果:培养14天后，V5 I γ δ T细胞有效被扩增，但扩增效率略低于上述改良1640培养基(图2中E所示)。
[0040]实施例4:PHA+IL-2体外培养外周血Y δ T细胞
[0041]将实施例3中改良1640培养基中的20ng/ml IL_7(白细胞介素7)改为100IU/ml IL-2(白细胞介素2)，其他同实施例3，在含5% CO2的37°C恒温培养箱进行细胞培养，每2-3天换新鲜培养液，连续培养14天，获得细胞悬液。结果:培养14天后，V δ I Υ δ T细胞亚群比例从〈10%扩增至40% -60% (图3)。
[0042]实施例5 =PHA体外培养外周血Y δ T细胞
[0043]将实施例3中改良1640培养基中的IL_7去除，其他同实施例3，在含5% CO2的37°C恒温培养箱进行细胞培养，每2-3天换新鲜培养液，连续培养14天，获得细胞悬液。结果:PHA单因素也可以有效扩增νδ I γ δΤ细胞，但νδ I γ δ T细胞凋亡较多(图3)。
[0044]实施例6:IL-7体外培养外周血Y δ T细胞
[0045]将实施例3中改良1640培养基中的PHA去除，其他同实施例3，在含5% CO2的37°C恒温培养箱进行细胞培养，每2-3天换新鲜培养液，连续培养14天，获得细胞悬液。结果:IL-7单因素不能明显扩增V δ I γ δ T细胞(图4)。
[0046]实施例7:扩增前后的外周血Y δ T细胞亚群比例检测
[0047]分别将扩增前(实施例2制备)、扩增后(实施例3中用改良1640培养基制备)获得的细胞悬液1000r/min，离心5min，弃上清，收集细胞沉淀。将I X 15细胞重悬于100 μ I含2% (v/v)BSA(牛血清白蛋白)的流式染色缓冲液(美国B1legend公司)，分别加入5μ I抗人νδ 1TCR。抗体(美国GeneTax公司)及5 μ I抗人V δ 2TCR抗体(美国B1legend公司)，4°C孵育30min,加入Iml PBS,以1000r/min,离心5min,再将沉淀用PBS清洗2次，并将细胞沉淀重悬于500 μ I PBS,于FACSCantoII多色流式检测仪(美国BD公司)上机检测。将检测数据于Flowjo分析扩增前后细胞亚群比例，如图2中A和C所示，说明PHA+IL-7选择性扩增V δ I γ δ T细胞。
[0048]实施例8:扩增后的外周血Y δ T细胞增殖检测
[0049]将实施例2磁珠分选后的细胞沉淀(实施例2方法制备)于Iml含2 % (v/v) BSA的0.5mM CFSE (羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂)(Invitrogen公司)染色液中，37°C孵育20min，加入4°C预冷的PBS 9ml终止染色，并以1000r/min离心5min，沉淀用PBS清洗2次，获得染色后的细胞。将染色后的细胞置于改良1640培养基(组成同实施例3)中，在含5% CO2的37°C恒温培养箱进行细胞培养，每2-3天换新鲜培养液，连续培养14天，获得细胞悬液。最后将此细胞悬液以1000!'/1^11离心51^11，弃上清，将1\105细胞重悬于100 μ I含2% (v/v) BSA (牛血清白蛋白)的流式染色缓冲液(美国B1legend公司)，分别加入5μ I抗人νδ 1TCR。抗体(美国GeneTax公司)及5 μ I抗人V δ 2TCR抗体(美国B1legend公司)，4°C孵育30min,加入Iml PBS,以1000r/min,离心5min,再将沉淀用PBS清洗2次,并将获得细胞(即沉淀)重悬于500 μ I PBS,于FACSCanto II多色流式检测仪(美国BD公司)上机检测并分析TCRV δ 1+CFSE-细胞及TCRV δ 2+CFSE-增殖情况(图2中B所示)，说Wvsiy δτ细胞增殖明显，νδ2γ δτ细胞几乎不增殖。
[0050]实施例9:扩增前后外周血V δ I Υ δ T细胞活性检测
[0051]同实施例7中细胞亚群检测，将扩增前(实施例2制备)、扩增后(实施例3中用改良1640培养基制备)获得的细胞悬液1000r/min，离心5min，弃上清，收集细胞。将细胞重悬于100 μ I含2% (v/v)BSA的流式染色缓冲液(美国B1legend公司)，分别加入5μ I抗人νδ ITCR抗体及5μ I抗人CD69抗体(美国B1legend公司)，4°C孵育30min，加入Iml PBS,以1000r/min,离心5min,沉淀用PBS清洗2次后将沉淀重悬于500 μ I PBS,于FACSCanto II多色流式检测仪上机检测。将检测数据于Flowjo分析扩增前后细胞活性(图5)，说明体外扩增后V δ I γ δ T细胞活性显著提高。
[0052]实施例10:扩增前后外周血V δ I Υ δ T细胞胞内分泌因子和细胞表面分子等细胞毒性相关分子检测
[0053]细胞表面分子检测同实施例9。于实施例3中用改良1640培养基扩增14天后的细胞培养基200 μ I中加入2μ I淋巴细胞激活剂(美国BD公司)，37°C孵育6小时，100r/min离心5min，收集细胞沉淀，向IX 15细胞中加入破膜穿孔液(美国BD公司)100 μ 1，于4°C孵育25min,加入Iml清洗缓冲液(美国BD公司)，1000r/min离心5min,沉淀用PBS清洗两次后将沉淀重悬于100 μ I流式染色缓冲液(美国B1legend公司)，分别加入5 μ I抗人胞内因子抗体(美国B1legend公司)，4°C孵育30min,加入Iml PBS,以1000r/min,离心5min，沉淀用PBS清洗2次后将细胞重悬于500 μ I PBS,并于FACSCanto II多色流式检测仪(美国BD公司)上机检测细胞毒性相关分子表达情况(图6) =Granzyme B (颗粒酶)，Perforin (穿孔素)，Fasl (细胞凋亡相关配体)，TRAIL (细胞凋亡相关配体)，NKG2D (自然杀伤细胞表面受体)，LFA-1 (粘附分子)，NKp30 (自然杀伤细胞表面受体)，NKp44(自然杀伤细胞表面受体)，NKp46(自然杀伤细胞表面受体)。结果:激活扩增后νδ 1Υ δΤ细胞毒性相关分子表达明显提闻。
[0054]实施例11:PHA+IL-7和PHA+IL-2培养体系扩增外周血V δ I Υ δ T细胞效率检测
[0055]同实施例7细胞亚群比例检测，分别对实施例3中PHA+IL-7和实施例4中PHA+IL-2培养体系扩增的外周血V δ I γ δ T细胞，在培养0、7、14、21天时进行细胞绝对计数，比较扩增前后两个培养体系对V δ I γ δ T细胞扩增的细胞绝对数量和扩增倍数(图7中Α)，说明PHA+IL-7对V δ I γ δ T细胞的扩增效率明显高于PHA+IL-2。
[0056]实施例12:PHA+IL-7和PHA+IL-2培养体系外周血V δ I Υ δ T细胞增殖检测
[0057]将实施例2磁珠分选后的细胞预标记CFSE (同实施例5)，将染色后的细胞分别置于PHA+IL-7 (组成同实施例3)和PHA+IL-2 (组成同实施例4)培养体系，连续培养14天。采用实施例8所述方法进行流式检测并分析TCRV δ I+CFSE-细胞增殖情况(图7中B)，说明PHA+IL-7培养体系中V δ I γ δ T细胞增殖明显高于PHA+IL-2培养体系。
[0058]实施例13:PHA+IL-7和PHA+IL-2培养体系外周血V δ I Υ δ T细胞凋亡检测
[0059]分别于实施例3 (PHA+IL-7)和实施例4 (PHA+IL-2)培养体系扩增14天后的培养液100 μ I中加入5 μ I碘化丙啶(PI)(美国BD公司)，室温孵育15分钟，于FACSCanto II多色流式检测仪(美国BD公司)上机检测TCRV δ I+PI+细胞(图7中C)。结论PHA+IL-7培养体系中V δ I γ δ T细胞凋亡明显少于PHA+IL-2培养体系。
[0060]实施例14:PHA+IL-7和PHA+IL-2培养体系外周血V δ I Υ δ T细胞对大肠癌肿瘤细胞和肿瘤干细胞杀伤能力检测
[0061]将实施例3(PHA+IL-7)培养体系扩增后的细胞悬液1000r/min，离心5min，弃上清，收集细胞沉淀。将IX 15细胞重悬于ΙΟΟμ I含2% (v/v)BSA的流式染色缓冲液(美国B1legend公司)，加入5μ I抗人νδ ITCR抗体，4°C孵育30min，加入Iml PBS以100r/min,离心5min，沉淀用PBS清洗2次后将细胞重悬于2ml PBS,流式分选仪(美国BD公司)分选νδ I γ δΤ细胞。将νδ I γ δΤ细胞以体积比10:1的效靶比，将I X 15V δ I γ δΤ细胞与终浓度ImM DDAO-SE (琥珀酰亚胺酯)预染的I X 14大肠癌细胞ΗΤ29 (购自美国ATCC)共培养4小时。然后向共培养体系中加入5μ I PI，室温孵育15分钟，于FACSCanto II多色流式检测仪(美国BD公司)上机检测DDAO-SE+PI+细胞情况(图7中D)。
[0062]DDAO-SE预染方法为:1 μ I DDAO-SE加入Iml含IX 14肿瘤细胞的悬液中，37°C孵育20分钟，加1ml PBS，1000r/min，离心5min，沉淀用PBS清洗两次，收集细胞，即为DDAO-SE预染的大肠癌细胞HT29。
[0063]分别将大肠癌细胞HT29替换为大肠癌细胞HCT116(美国ATCC)、大肠癌细胞
Y(实验室建立人大肠癌原代细胞系)和大肠癌干细胞HT29S (实验室建立)、大肠癌干细胞HCT116S (实验室建立)、大肠癌干细胞YS (实验室建立)，结果见图7中D所示。
[0064]同样条件下以实施例4(PHA+IL_2)培养体系扩增后的细胞悬液作为对照。
[0065]实施例15:扩增后的外周血V δ I Υ δ T细胞杀伤大肠癌细胞、肿瘤干细胞和血液系统肿瘤细胞能力检测
[0066]将实施例3中用改良1640培养基扩增后获得的细胞悬液1000r/min，离心5min，弃上清，收集细胞。将IX15细胞重悬于ΙΟΟμ I含2% (v/v)BSA的流式染色缓冲液(美国B1legend公司)，加入5 μ I抗人V δ ITCR抗体，4°C孵育30min,加入Iml PBS,以1000r/min,离心5min，细胞(即沉淀)用PBS清洗2次后将细胞重悬于2ml PBS,流式分选V5 I γ δ T细胞(同实施例14)。将V δ I γ δ T细胞以体积比10:1效靶比与ImM DDAO-SE预染的大肠癌细胞ΗΤ29共培养4小时(同实施例14)。然后向共培养体系中加入5μ I PI,室温孵育15分钟，于FACSCanto II多色流式检测仪(美国BD公司)上机检测DDAO-SE+PI+细胞情况，结果实施例3 (PHA+IL-7)扩增后的V δ I γ δ T细胞能够有效杀伤大肠癌细胞、大肠癌干细胞及慢性髓细胞白血病和急性T淋巴细胞白血病细胞。将大肠癌细胞ΗΤ29分别替换为大肠癌细胞HCT116、大肠癌细胞Y和大肠癌干细胞HT29S、大肠癌干细胞HCT116S、大肠癌干细胞YS (图8中Α)及慢性髓细胞性白血病细胞(Κ562)(美国ATCC)和急性T淋巴细胞白血病细胞(Jurkat)(美国ATCC)(图8中B)。
[0067]实施例16:扩增后的外周血V δ I Υ δ T细胞体内抑瘤能力检测
[0068]将人大肠癌细胞系ΗΤ29以5Χ 14细胞量皮下接种到N0D/SCID小鼠建立荷瘤模型。三天后将实施例3扩增获得的V δ I γ δ T细胞流式分选出来(同实施例14)，100r/min，离心5min，弃上清，收集细胞沉淀。用100 μ I PBS重悬细胞沉淀(浓度为I X 107/ml)，小鼠尾静脉注射1Χ106νδ1Υ δ T细胞，I次/3天，共5次。游标卡尺测量肿瘤瘤径及荷瘤小鼠生存情况。PHA+IL-7扩增的V δ I γ δ T细胞治疗组可以抑制肿瘤的生长(图9中Α)并延长荷瘤小鼠生存时间(图9中B)。同样条件下，以尾静脉注射100 μ I PBS为对照。
[0069]总结:
[0070]本发明使用的原料:外周血易获取、不存在伦理问题；
[0071]本发明获得细胞的方法简单、高效、成本低；
[0072]所获得的细胞具有较高杀伤实体肿瘤细胞、肿瘤干细胞和血液系统肿瘤细胞的细胞毒活性；
[0073]本发明所获细胞广泛表达细胞毒性相关分子；
[0074]本发明所获细胞适合于实体瘤如大肠癌和血液系统肿瘤如慢性髓细胞白血病、急性T淋巴细胞白血病的细胞治疗、药物筛选和作为组织工程的种子细胞。
[0075]综上所述，本方法利用外周血经过密度梯度离心及磁珠分选的纯化方法，得到较高纯度、扩增能力强、细胞活性高的Y S T细胞，在特定培养基中体外培养扩增14天后，获得较高杀伤实体肿瘤细胞、肿瘤干细胞和血液系统肿瘤细胞的细胞毒活性的V δ I Υ δ T细胞亚群，在肿瘤过继免疫治疗领域展现了广阔的应用前景，将会给V δ I Υ δ T细胞亚群的临床应用带来极大发展。
【权利要求】
1.一种来源于外周血νδ I γ δT细胞的体外激活扩增方法，其特征在于所述的方法为:取外周全血，采用密度梯度离心及免疫磁珠分选的方法收集总Y S T细胞；将总Y δτ细胞用改良1640培养基作为培养液进行重悬，在5% C02、37°C条件下进行细胞培养，每2-3天换新鲜培养液，获得体外激活扩增的以νδ I γ δ T亚群为主的γ δ T细胞；所述改良1640培养基组成为:体积浓度10%胎牛血清，50mg/mL青链霉素，0.1-10 μ g/ml PHA和l-100ng/ml IL-7，溶剂为 1640 培养基。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述密度梯度离心及免疫磁珠分选的方法具体为: (1)取外周全血，用PBS以体积比1:1稀释，获得外周全血稀释液； (2)将比重为1.107的Ficoll淋巴细胞分离液加入离心管中，然后将步骤(I)的外周血稀释液缓慢加至Ficoll淋巴细胞分离液上层,水平离心机400g/min,20°C,离心25min,反应液依次分层为上层血清、白膜层细胞、Ficoll分离液层、粒细胞层和底层红细胞层；所述外周血稀释液与Ficoll淋巴细胞分离液体积比3:1; (3)将步骤(2)分离的白膜层细胞吸出，转移至新的离心管，用5倍体积的PBS洗2次，1000r/min,离心5min,弃上清,收集细胞a ； (4)以IX 17个细胞/40 μ I磁珠分选缓冲液a的量用磁珠分选液a重悬步骤(3)获得的细胞a，然后加入Y STCR抗体，4°C孵育lOmin，再加入磁珠分选缓冲液b和、δ TCR磁珠抗体，4°C孵育15min，离心，沉淀用PBS洗I次，离心，弃上清，收集细胞b ;所述磁珠分选缓冲液b与磁珠分选缓冲液a体积比为3:4 ;所述γ δ TCR抗体与磁珠分选缓冲液a体积比为1:4 ;所述Y STCR磁珠抗体与磁珠分选缓冲液a体积比为1:2 ; (5)向步骤(4)获得的细胞b中加入PBS重悬，过MACS磁珠分选柱，PBS清洗柱子3次，1000r/min，离心5min，弃上清，收集细胞C，即获得γ δ T细胞。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述1640培养基中PHA终浓度为Iμ g/ml。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述1640培养基中IL-7的终浓度为20ng/ml ο
【文档编号】C12N5/0783GK104388386SQ201410519531
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年9月30日 优先权日:2014年9月30日
【发明者】黄建, 武当, 伍品, 叶俊 申请人:浙江大学