枯草芽孢杆菌h4及其制备的腐熟菌剂、腐熟菌剂的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种枯草芽孢杆菌H4及其制备的腐熟菌剂、腐熟菌剂的应用，所述腐熟菌剂由短短芽孢杆菌H3冻干粉、枯草芽孢杆菌H4冻干粉、枯草芽孢杆菌H8-3冻干粉和淀粉以重量比为1:1:1:97构成；本发明提供一株新菌株--枯草芽孢杆菌H4，利用该菌株制备的腐熟菌剂具有耐高温，分泌蛋白酶、脂肪酶以高效发酵动物类废弃物的优点，利用所述腐熟菌剂堆肥具有环境污染小、经济易行等优点，堆肥处理后的产品经过后续处理，可以作为有机肥料达到变废为宝的目的。
CCTCC NO：M 2013483
2013.10.21
CCTCC NO：M 2013481
2013.10.21
CCTCC NO：M 2013482
2013.10.21
【专利说明】枯草芽孢杆菌H4及其制备的腐熟菌剂、腐熟菌剂的应用 (一）
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种腐熟菌剂，株枯草芽孢杆菌及应用，特别涉及一种腐熟菌剂、腐熟 菌剂在处理富含蛋白质与脂肪的废弃物的应用及制备腐熟菌剂的新菌株--枯草芽孢杆菌 H4。 (二）
【背景技术】
[0002] 有机废弃物常被当作垃圾送进垃圾场、焚化炉或者随意丢弃。开发利用有机废弃 物的方法是非常必要的，不光能保护环境，而且能变废为宝。当前已经开发了不少利用有机 废弃物的方法，但是大部分都是对纤维素、淀粉含量高的废弃物的利用，而对含蛋白质与脂 肪较高的废弃物的利用方法则较少。
[0003]富含蛋白质与脂肪的废弃物（如动物类废弃物），如果直接丢弃，将产生大量的污 水、臭气，污染环境，并有可能导致病菌传播扩散，存在极大的安全隐患。目前世界范围内处 理动物类废弃物的方法主要包括深埋法、焚化法、和炼油法。但这些方法都各自存在这一些 诸如成本高、效率低或安全性差等不足之处。正是基于这一出发点，应用堆肥法处理动物类 废弃物逐渐走入了人们的视线。堆肥法可以定义为利用自然界广泛存在的微生物（细菌、 放线菌、真菌等）或商业菌株，有控制地促进可被生物降解的有机物向稳定的腐殖质转化 的生物化学过程。由于堆肥过程受微生物种类、环境温度等因素的影响较大，所以在没有人 为添加菌剂的情况下堆肥发酵效率较低。所以亟待开发一种发酵效率高的菌剂以安全环保 又经济的处理动物类废弃物。
[0004] 本发明提供的菌剂具有耐高温，分泌蛋白酶、脂肪酶以高效发酵动物类废弃物的 优点。利用该菌剂堆肥具有环境污染小、经济易行等优点，堆肥处理后的产品经过后续处 理，可以作为有机肥料达到变废为宝的目的。 (三）
【发明内容】
[0005]本发明目的是提供一种腐熟菌剂、腐熟菌剂在处理富含蛋白质和/或脂肪的废弃 物的应用及制备腐熟菌剂的新菌株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)H4,所述腐熟 菌剂能高效分解蛋白质、脂肪，在处理动物类废弃物方面有良好的应用。
[0006]本发明采用的技术方案是：
[0007]本发明提供一种腐熟菌剂，所述腐熟菌剂由短短芽孢杆菌H3冻干粉、枯草芽孢杆 菌H4冻干粉、枯草芽孢杆菌H8-3冻干粉和淀粉构成，所述短短芽孢杆菌H3冻干粉与枯草 芽孢杆菌H4冻干粉、枯草芽孢杆菌H8-3冻干粉和淀粉重量比为1:1:1:97 ;
[0008]所述短短芽孢杆菌H3冻干粉是由短短芽孢杆菌H3经发酵培养获得的发酵液离 心，取沉淀冷冻干燥（优选-50°C?-KTC冷冻干燥12?24h，更优选-50°C冷冻干燥24h) 获得的，所述短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis)H3,保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏日期为2013年10月21日，保藏编号为CCTCC NO :M 2013481，地址为湖北武汉武汉大 学；
[0009] 所述枯草芽孢杆菌H8-3冻干粉是由枯草芽孢杆菌H8-3经发酵培养获得的发酵 液离心，取沉淀冷冻干燥（优选-50°C?-KTC冷冻干燥12?24h，更优选-50°C冷冻干燥 24h)获得的，所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)H8-3,保藏于中国典型培养物保藏中 心，保藏日期为2013年10月21日，保藏编号为CCTCC NO :M 2013483,地址为湖北武汉武 汉大学；
[0010] 所述枯草芽孢杆菌H4冻干粉是由枯草芽孢杆菌H4经发酵培养获得的发酵液离 心，取沉淀冷冻干燥（优选-50°C?-KTC冷冻干燥12?24h，更优选-50°C冷冻干燥24h) 获得的，所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)H4,保藏于中国典型培养物保藏中心，保 藏日期为2013年10月21日，保藏编号为CCTCC NO :M 2013482,地址为：湖北武汉武汉大 学。
[0011] 本发明还提供一种所述腐熟菌剂在降解含蛋白质和/或脂肪的废弃物中的应用， 具体所述的应用为：将腐熟菌剂加入到含蛋白质和/或脂肪的废弃物中，在30°c?60°C下 降解反应1?4天（即将腐熟菌剂与废弃物混合均匀后放置1?4天即可进行降解），降解 产物处理后作为植物有机肥再利用，所述处理优选常温堆肥1?4周即可。
[0012] 进一步，优选所述腐熟菌剂与废弃物重量比为0. 1?5 :100。
[0013] 进一步，优选所述降解的温度为50°C?60°C。
[0014] 本发明还提供一种用于制备所述腐熟菌剂的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis) H4,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2013年10月21日，保藏编号为CCTCC NO :M 2013482,地址为：湖北武汉武汉大学。
[0015] 所述枯草芽孢杆菌H4生理生化特征如下：在LB培养基上菌落呈乳白色，无光泽， 边缘不整齐，表面有皱褶。好氧呼吸，在有氧条件下生长良好；革兰氏染色阳性；在葡萄糖、 蔗糖、木糖、甘露糖、麦芽糖发酵试验中可产酸；能水解明胶、淀粉和酪蛋白；还原石蕊牛 奶；V-P测定阳性；甲基红测定阴性。产蛋白酶，能耐70°C的高温。
[0016] 枯草芽孢杆菌H8-3生理生化特征如下：在LB培养基上菌落呈乳白色，无光泽，边 缘不整齐，表面有皱褶。好氧呼吸，在有氧条件下生长良好；革兰氏染色阳性；在葡萄糖、蔗 糖、木糖、甘露糖、麦芽糖发酵试验中可产酸；能水解明胶、淀粉和酪蛋白；还原石蕊牛奶； V-P测定阳性；甲基红测定阴性。产蛋白酶，能耐60°C的高温。
[0017] 短短芽孢杆菌H3生理生化特征如下：在LB培养基上菌落呈白色，无光泽，边缘不 整齐，表面有皱褶。好氧呼吸，在有氧条件下生长良好；产脂肪酶，能耐60°C的高温。
[0018] 本发明所述枯草芽孢杆菌H4具有耐高温（在70°C高温能存活）、蛋白酶活性较 高，且生长较迅速的优点。
[0019] 本发明所述枯草芽孢杆菌H4冻干粉的制备方法为：
[0020] (1)斜面培养
[0021] 将枯草芽孢杆菌H4接种至斜面培养基，30°C?50°C培养1天，获得斜面菌体；所 述斜面培养基终浓度组成为：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉15g/L，溶剂 为去离子水，pH值为7. 0 ;
[0022] (2)种子培养
[0023] 从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至种子培养基，在30°C?70°C培养1天，获得 种子液；所述种子培养基终浓度组成为：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，溶剂为去 离子水，pH值为7. 0;
[0024] (3)发酵培养
[0025] 将种子液以体积浓度0. 1%?1% (优选0. 1% )的接种量接种至发酵培养基， 30°C?70°C、100?300rpm发酵培养1?2天，获得发酵液，将发酵液离心，收集沉淀 在-50°C?-KTC冷冻干燥12?24h (优选-50°C冷冻干燥24h)，获得所述枯草芽孢杆菌H4 冻干粉；所述发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖30g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，氯化钠 2g/L，硫酸镁0. 5g/L，磷酸氢二钾lg/L，磷酸二氢钾lg/L，溶剂为去离子水，pH值为7. 2。
[0026] 本发明所述枯草芽孢杆菌H8-3冻干粉的制备方法为：
[0027] (1)斜面培养
[0028] 将枯草芽孢杆菌H8-3接种至斜面培养基，30°C?50°C培养1天，获得斜面菌体； 所述斜面培养基终浓度组成为：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉15g/L，溶 剂为去离子水，pH值为7.0;
[0029] (2)种子培养
[0030] 从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至种子培养基，在30°C?60°C培养1天，获得 种子液；所述种子培养基终浓度组成为：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，溶剂为去 离子水，pH值为7. 0;
[0031] (3)发酵培养
[0032] 将种子液以体积浓度0. 1%?1% (优选0. 1% )的接种量接种至发酵培养基， 30°C?60°C、100?300rpm发酵培养1?2天，获得发酵液，将发酵液离心，收集沉淀 在-50°C?-KTC冷冻干燥12?24h(优选-50°C冷冻干燥24h)，获得所述枯草芽孢杆菌 H8-3冻干粉；所述发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖30g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L， 氯化钠2g/L，硫酸镁0. 5g/L，磷酸氢二钾lg/L，磷酸二氢钾lg/L，溶剂为去离子水，pH值为 7. 2。
[0033] 本发明所述短短芽孢杆菌H3冻干粉的制备方法为：
[0034] (1)斜面培养
[0035] 将短短芽孢杆菌H3接种至斜面培养基，30?50°C培养1天，获得斜面菌体；所述 斜面培养基终浓度组成为：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaC110g/L，琼脂粉15g/L，溶剂为去 离子水，pH值为7. 0;
[0036] (2)种子培养
[0037] 从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至种子培养基，在30?60°C培养1天，获得种 子液；所述种子培养基终浓度组成为：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，溶剂为去离 子水，pH值为7.0;
[0038] (3)发酵培养
[0039] 将种子液以体积浓度0? 1%?1% (优选0? 1% )的接种量接种至发酵培养 基，30?60°C、100?300rpm发酵培养1?2天，获得发酵液，将发酵液离心，收集沉淀 在-50°C?-KTC冷冻干燥12?24h (优选-50°C冷冻干燥24h)，获得所述短短芽孢杆菌H3 冻干粉；所述发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖30g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，氯化钠 2g/L，硫酸镁0. 5g/L，磷酸氢二钾lg/L，磷酸二氢钾lg/L，溶剂为去离子水，pH值为7. 2。
[0040]本发明所述含蛋白质和/或脂肪的废弃物是指自然死亡的家畜家禽，如鸡、鸭、猪 等，以及它们屠宰后的废弃物。
[0041] 与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供一株新菌株--枯草 芽孢杆菌H4,利用该菌株制备的腐熟菌剂具有耐高温，分泌蛋白酶、脂肪酶以高效发酵动物 类废弃物的优点，利用所述腐熟菌剂堆肥具有环境污染小、经济易行等优点，堆肥处理后的 产品经过后续处理，可以作为有机肥料达到变废为宝的目的。 (四）
【专利附图】
【附图说明】
[0042] 图1枯草芽孢杆菌H4耐高温实验图。
[0043] 图2枯草芽孢杆菌H4蛋白水解圈实验图。
[0044] 图3枯草芽孢杆菌H4蛋白酶活性实验图。
[0045] 图4枯草芽孢杆菌H8-3耐高温实验图。
[0046] 图5枯草芽孢杆菌H8-3蛋白酶水解圈实验图。
[0047] 图6枯草芽孢杆菌H8-3蛋白酶活性实验图。
[0048] 图7短短芽孢杆菌H3耐高温实验图。
[0049] 图8短短芽孢杆菌H3脂肪酶水解圈实验图。
[0050] 图9短短芽孢杆菌H3脂肪酶活性实验图。
[0051] 图10猪肉经腐熟菌剂处理前后对比图。
[0052] 图11腐熟菌剂消化猪肉实验中游离蛋白质含量变化图。
[0053] 图12腐熟菌剂消化猪肉实验中粗脂肪含量变化图。 (五）
【具体实施方式】
[0054] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0055] 实施例1菌株筛选及鉴定
[0056] 1、菌株H4的筛选及鉴定
[0057] (1)培养基及试剂配方：
[0058] S0C液体培养基终浓度组成为：胰化蛋白胨20g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 0. 5g/ L、KC1 2. 5mmol/L、MgCl20. 01mol/L、葡萄糖 0? 02mol/L，溶剂为去离子水，pH 值 7. 0。
[0059] SOC固体培养基终浓度组成为：SOC液体培养基加质量终浓度1. 5%的琼脂粉。
[0060] S0C液体培养基配制方法：配置每升培养基，在965ml去离子水中加入胰化蛋白胨 20g、酵母提取物5g、NaCl 0. 5g摇动容器使溶质完全溶解。加10ml 250mmol/L KC1水溶液， 用5mol/L NaOH调pH至7.0,在15psi(1.05kg/cm2)高压下蒸汽灭菌20min。灭菌后的溶 液加入5ml过滤灭菌的2mol/L MgCl2，冷却至60°C或60°C以下，加20ml过滤灭菌的lmol/ L葡萄糖水溶液。
[0061] 脱脂奶粉培养基终浓度组成：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，脱脂奶粉 20g/L，15g/L琼脂粉，溶剂为去离子水，pH值为7. 0。在15psi (1. 05kg/cm2)高压下蒸汽灭 菌 20min。
[0062] LB液体培养基终浓度组成：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，溶剂为去离 子水，pH值为7.0。在15psi(1.05kg/cm2)高压下蒸汽灭菌20min。
[0063] LB平板终浓度组成：LB液体培养基加质量终浓度1. 5%的琼脂粉。
[0064] (2) 土样采集
[0065] 储藏于杭州师范大学生物医药与健康研究中心的土样：郴州汝城温泉土壤。
[0066] (3)菌种初筛
[0067] 配制S0C液体培养基，灭菌冷却后分装，每根试管加入10ml培养基，加入土壤样品 0. 5g，混匀后60°C水浴摇床震荡3小时。无菌水稀释103倍，涂布S0C固体培养基平板，37°C 培养20小时。
[0068] (4)菌种复筛
[0069] 挑取初筛平板生长良好的菌落接种于脱脂奶粉培养基，37°C培养20小时。观察是 否有透明圈产生。得到一株能产生明显透明圈的菌株，标记为菌株H4,保存。
[0070] (5)耐高温实验
[0071] 将菌株H4接种于LB液体培养基，37°C培养6小时。分装于10ml试管，分别在30°C、 40°C、50°C、60°C、70°C、80°C、90°C的水浴摇床震荡半小时，取出冷却，无菌水稀释10 5倍，取 200iil涂布于LB平板上，37°C培养18小时，计数生长的菌落（见图1)。可见菌株H4能耐 70°C的高温。
[0072] (6)蛋白酶活性实验
[0073] 将菌株H4接种于脱脂奶粉培养基，37°C培养24小时，以无蛋白酶活性的大肠杆菌 作为对照。结果见图2,表明H4具有蛋白酶活性。
[0074] 将菌株H4培养于LB液体培养基，37°C培养18小时，培养液离心，取上清。取 BSA(lmg/ml)(购于宝生物工程大连有限公司）100微升，加入100微升上清，50°C孵育0、5、 10、15、20、25、30分钟，加入5ml考马斯亮蓝染色液终止反应。分光光度计测0D_吸收值。 结果见图3,表明菌株H4能产蛋白酶。
[0075] (7) 16S rDNA测序鉴定菌种
[0076] 使用DNA提取试剂盒（购自杭州宝赛生物有限公司）提取菌株H4的DNA，以16S rDNA通用引物为引物，进行PCR扩增。扩增体系为16S rDNA通用引物1 iil，DNA模板 0.1 ill，dnTP2 iil，buffer 2 iil，rTaq 酶 0.2 iil，无菌水补足 20 ill。扩增条件为 95 °C 预 变性5min，32个循环（98°C变性lOsec ;58°C退火30sec ;72°C延伸2min)，16°C保持。扩增 序列由南京金斯瑞生物科技有限公司测定，菌株H4的16S rDNA全序列为SEQ ID. N01所 示。根据菌株H4的16S rRNA序列分析结果，结合生理生化试验结果，在NCBI基因库比对 后，确定菌株H4为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)，命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)H4〇
[0077] 引物：
【权利要求】
1. 一种腐熟菌剂，其特征在于所述腐熟菌剂由短短芽孢杆菌H3冻干粉、枯草芽孢杆菌 H4冻干粉、枯草芽孢杆菌H8-3冻干粉和淀粉构成，所述短短芽孢杆菌H3冻干粉与枯草芽孢 杆菌H4冻干粉、枯草芽孢杆菌H8-3冻干粉和淀粉重量比为1:1:1:97 ; 所述短短芽孢杆菌H3冻干粉是由短短芽孢杆菌H3经发酵培养获得的发酵液离心，取 沉淀冷冻干燥获得的，所述短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis) H3,保藏于中国典型培 养物保藏中心，保藏日期为2013年10月21日，保藏编号为CCTCC NO :M 2013481，地址为 湖北武汉武汉大学； 所述枯草芽孢杆菌H8-3冻干粉是由枯草芽孢杆菌H8-3经发酵培养获得的发酵液离 心，取沉淀冷冻干燥获得的，所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtil is) H8-3,保藏于中国典 型培养物保藏中心，保藏日期为2013年10月21日，保藏编号为CCTCC NO :M 2013483,地 址为湖北武汉武汉大学； 所述枯草芽孢杆菌H4冻干粉是由枯草芽孢杆菌H4经发酵培养获得的发酵液离心，取 沉淀冷冻干燥获得的，所述枯草芽孢杆菌（Baci 1 lus subti 1 is) H4,保藏于中国典型培养物 保藏中心，保藏日期为2013年10月21日，保藏编号为CCTCC NO :M 2013482,地址为：湖北 武汉武汉大学。
2. -种权利要求1所述腐熟菌剂在降解含蛋白质和/或脂肪的废弃物中的应用。
3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为：将腐熟菌剂加入到含蛋白质 和/或脂肪的废弃物中，在30?60°C的条件下降解反应1?4天，降解产物处理后作为植 物有机肥再利用。
4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于所述腐熟菌剂与废弃物重量比为0. 1?5 : 100。
5. 如权利要求3所述的应用，其特征在于所述降解的温度为50°C?60°C。
6. -种用于制备权利要求1所述腐熟菌剂的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)H4， 保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2013年10月21日，保藏编号为CCTCC NO :M 2013482,地址为：湖北武汉武汉大学。
【文档编号】C12R1/01GK104328066SQ201410519541
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年9月30日 优先权日:2014年3月28日
【发明者】黄黎锋, 李海峰, 蓝袁洋, 施建军, 钟丹成, 沈如玥 申请人:杭州法莫西生物医药科技有限公司