一种具有串联ABRE顺式作用元件的RhNAC3启动子及其应用的制作方法

一种具有串联ABRE顺式作用元件的RhNAC3启动子及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种具有串联ABRE顺式作用元件的RhNAC3启动子及其应用。所述启动子是一种对脱落酸敏感的诱导型启动子，其中所包含的ABRE顺式作用元件对其下游基因的表达具有累积效应，由此可以利用脱落酸对下游基因表达进行定量控制。在一些优选的实施方式中，所述下游基因是抗逆基因例如RhNAC3，利用植物在逆境胁迫例如干旱胁迫条件下产生的脱落酸来诱导所述抗逆基因地表达，由此使植物能够在遇到逆境胁迫条件时能够自主地提高抗逆基因的表达量，从而提高其抗逆性。因此，所述启动子提高植物抗逆性方面具有非常重大的利用价值。
【专利说明】-种具有串联ABRE顺式作用元件的RhNAC3启动子及其应 用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物分子生物学领域，提供了诱导型启动子，以及利用启动子通过脱 落酸控制植物表达该启动子下游基因表达的方法。

【背景技术】
[0002] NAC转录因子是植物所特有的一类转录因子，特指具有高度保守的NAC结构域的 一类蛋白质，其名称来源于矮牵牛的NAM基因、拟南芥中的ATAFl，2基因和CUC2基因的首 字母。由于此三种基因编码的蛋白质在N-端具有高度保守的NAC结构域，后来又发现具有 此类特征的基因在植物中数量很多，就把这类基因称为NAC (NAM，ATAFl，2,和⑶C2)家族基 因，其编码的蛋白称为NAC蛋白。
[0003] NAC类蛋白广泛存在于不同的植物中，而且在同一植物中数量众多。NAC类转录因 子的结构大致分为N-端保守的NAC结构域和多样的C-端结构域。NAC蛋白还包含N-端 NAC结构域的核定位信号和C-端高度分化的基序，C-端为转录调节域，多数具有转录激活 功能，部分NAC类转录因子在C-端还具有跨膜基序，用于行使跨膜功能。
[0004] 由于NAC家族成员在结构、顺式作用元件周围序列以及其它辅助作用因子等方面 存在的差异，使其在生物活性和生理功能上有所不同，因此NAC转录因子在多种组织中广 泛存在，参与众多代谢过程的调控。NAC类转录因子广泛参与植物的生长发育、激素调控和 环境胁迫应答，是一类调节植物体内各种生理反应的关键因子。NAC转录因子在细胞分化、 胚和花发育、侧根形成、次生壁形成、叶片衰老、病原菌防御、应对外界不良环境等方面起着 非常重要的调控作用。
[0005] 脱落酸（ABA, abscisic acid)作为一个胁迫信号植物激素，能够被失水胁迫所诱 导，在植物整体水平到细胞水平的调节中起到一个非常重要的作用。ABA的功能多样，广泛 参与植物生长和发育的许多方面，如胚胎成熟、种子发育、种子萌发、气孔开度调节和激活 许多胁迫响应基因，参与植物开花，ABA还可以调节蒸腾效率控制萎蔫，进而减少植物水分 流失。在失水情况下，大量胁迫相关基因受ABA所调节。尽管ABA的功能多样，在参与失水 胁迫方面主要表现在通过促进气孔关闭而保存植物体内的水分，同时它还调节大量失水胁 迫响应相关基因的表达从而使植物对失水胁迫作出响应。目前，ABA在分子水平上的作用 机制仍未清楚。
[0006] 本发明人前期研究发现，RhNAC3是月季中胁迫相关NAC(stress-associated NAC， SNAC)类转录因子，其定位在细胞核内并具有转录激活特性，RhNAC3的转录水平受失水胁 迫等非生物胁迫处理所诱导并能够结合CAC[G/T]顺式作用元件。月季花瓣中沉默RhNAC3 后降低了花瓣的失水胁迫耐性。拟南芥中异源过表达RhNAC3提高了植株的失水胁迫耐 受力。转录因子RhNAC3通过调节渗透胁迫类基因的表达参与失水胁迫耐性（Jiang X， Zhang C，LiiP，Jiang G，Liu X，Dai F and Gao J. 2014. RhNAC3, a stress-associated NAC transcription factor， has a role in dehydration tolerance through regulating osmotic stress-related genes in rose petals.Plant biotechnology journal,12(I)： 38-48)。RhNAC3 R经由本发明人公开，其GenBank登录号为TK617768. I (可参见http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/nucest/.TK617768)。虽然已有工作对 RhNAC3 蛋白进行了研究，但 是本领域对RhNAC3蛋白的调控机制仍不明晰，特别是不清楚其与植物激素 ABA的关系。


【发明内容】

[0007] 本发明的目的是通过分子生物学手段来使植物具有有利的生物学性状，尤其是使 植物具有有利的耐受逆境胁迫的能力，即具有有利的抗逆性。本发明是通过如下技术方案 来实现的：
[0008] 1、一种NAC蛋白转录因子基因的启动子，其中，所述启动子与SEQ No. 1具有至少 50%，例如60%、70%、80%、90%、91%、92%、95%、97%、98%、99%或100%的同一性；优 选的是，所述核苷酸序列包含选自由acgtg、acgtgc、acgtgg、acgtgc和acgtgtc组成的组 中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或至少五种顺式作用元件。
[0009] 2、用于对技术方案1所述的启动子进行克隆、检测、定位、过表达或沉默的引物 对，其中，所述引物对选自由引物对SEQ NO. 2和15、SEQ NO. 2和16、SEQ NO. 2和17、SEQ NO. 2 和 18、SEQ NO. 3 和 19、SEQ NO. 4 和 19、SEQ NO. 5 和 6、引物对 SEQ NO. 7 和 8、引物对 SEQ NO. 9 和 12、引物对 SEQ NO. 10 和 12、引物对 SEQ NO. 11 和 12、引物对 SEQ NO. 13 和 14 组成的组。
[0010] 3、一种克隆技术方案1所述的启动子的方法，其中，所述方法使用选自由引物对 SEQ NO. 2 和 15、SEQ NO. 2 和 16、SEQ NO. 2 和 17、SEQ NO. 2 和 18、SEQ NO. 3 和 19、SEQ NO. 4 和19组成的组中的至少一个引物进行。
[0011] 4、一种克隆或检测技术方案1所述的启动子的方法，其中，所述方法包括使用引 物对SEQ No. 5和6、和/或引物对SEQ NO. 7和8进行；优选的是，所述检测通过⑶S活性 检测进行，并且使用引物对SEQ NO. 7和8进行。
[0012] 5、一种检测植物对ABA的敏感性的方法，所述方法包括对技术方案1所述的启动 子进行检测；优选的是，所述方法包括对所述启动子的ABA顺式作用元件的存在和/或数量 进行检测。
[0013] 6、一种提高植物耐受逆境胁迫能力的方法，所述方法包括利用技术方案1所述的 启动子进行；优选的是，所述方法通过改变植物对ABA的敏感性来实现；另外优选的是，所 述方法通过提高植物对ABA的敏感性来实现；另外优选的是，所述逆境胁迫导致所述植物 的ABA生成量增加；另外优选的是，所述逆境胁迫选自由低温逆境胁迫、高温逆境胁迫、干 旱逆境胁迫、水涝逆境胁迫、高盐逆境胁迫、生物胁迫、机械伤害胁迫组成的组。
[0014] 7、如技术方案6所述的方法，其中，所述方法通过将所述启动子与耐受逆境胁迫 有关的基因的融合表达来实现；优选的是，所述耐受逆境胁迫有关的基因为RhNAC3。
[0015] 8、根据技术方案6或7所述的方法，其中，所述融合表达利用外部施加的外源性 ABA或者植物本身产生的内源性ABA来诱导；进一步优选的是，所述融合表达利用植物本身 产生的内源性ABA来诱导。
[0016] 9、RhNAC3基因在提高植物耐受胁迫能力中的应用；优选的是，所述应用通过将所 述RhNAC3基因与技术方案1所述的启动子的融合表达来实现。
[0017] 10、含有技术方案1所述的启动子的载体；优选的是，所述载体为质粒载体、噬菌 体载体或病毒载体；另外有选的是，所述载体为克隆载体或表达载体。
[0018] 本发明所提供的包含串联ABRE顺式作用元件的RhNAC3启动子序列参与对植物干 旱胁迫耐性和ABA敏感性的调控。例如，在植物中该启动子表达具有广泛性，对ABA的响应 表现出累计效应；在植物中过表达该基因在种子萌发、初生根生长和气孔开度方面表现出 对ABA超敏；在植物中能够调控ABA响应基因的表达。这将使NAC转录因子蛋白RhNAC3在 参与植物非生物胁迫耐性提高植物对ABA敏感性上具有独特的优势。所述RhNAC3启动子 为诱导性启动子，可以与不同功能类型的基因（抗旱、抗寒、耐盐碱）相融合，并调控其在植 物体内的表达，在ABA处理下可以强烈诱导目的基因的表达，增强植物对逆境胁迫的抵抗， RhNAC3启动子区域中含有串联的ABRE顺式作用元件，不同缺失片段包含不同数目ABRE元 件的缺失启动子可以定量调控所启动基因的表达。所述RhNAC3启动子对与参与调控植物 对非生物胁迫的研究具有重要的意义，可为利用基因工程手段培育性状优良的植物提供了 遗传资源储备。

【专利附图】

【附图说明】
[0019] 图1显示了 RhNAC3启动子重要顺式作用元件示意和表达特性。其中，A图：RhNAC3 启动子序列示意图。不同矩形框展示了 RhNAC3启动子中与逆境胁迫相关的W-box、ABRE、 MYC、MYB、CBF等重要的胁迫响应顺式作用元件。图A下半部分的表格中的数字表示启动子 序列中ABRE元件的核苷酸序列类型和具体位置，在RhNAC3启动子区域中，在-484 (核苷酸 acgtg)、_516(核苷酸 acgtgc)、_600(核苷酸 acgtgg)、_914(核苷酸 acgtgc)和-1134(核 苷酸&〇8七8"）处为481?顺式作用元件位置。由4图可知1^嫩03具有多个串联的481?(八8八 顺式作用元件），这RhNAC3在植物应对胁迫响应途径中发挥作用的研究结果吻合，尤其是 在ABA依赖的调控途径中。B图：RhNAC3在拟南芥中的组织化学定位。将RhNAC3启动子驱 动的GUS基因的表达在5d拟南芥实生苗（a)，14d实生苗（b)，幼嫩叶片（c)，幼嫩叶片气孔 (d)，花（e)，柱头（f)，花瓣（g)，花序顶端茎（h)，成熟果荚（i)，未成熟种子（k)的表达情 况，图上的标尺为1mm。由B图可知：RhNAC3基因在植物生长发育的各个阶段都有表达，并 且在各个部分广泛表达，尤其在叶片保卫细胞（图lB-d)和一些维管组织（图lB-b和c) 中有更强烈的表达。
[0020] 图2显示了不同片段RhNAC3启动子缺失分析和ABA剂量效应。A图：RhNAC3启动 子缺失片段在拟南芥原生质体中的GUS活性分析。A图上部分示意性地显示RhNAC3启动子 序列中不同的ABRE顺式作用元件的分布，A图的下部分为3个不同的重组质粒（N0，N1，N2) 和空载对照（NC)的相对⑶S活性，⑶S活性在孵育后24h后检测，其中，NO (-1447?-160bp) 包含有图1的A图所示的所有5个串联的ABRE顺式作用元件，NI (-707?-160bp)包含有图 1的A图所示的其中3个串联的ABRE顺式作用元件，N2 (-377?-160bp)不含有图1的A图 所示的ABRE顺式作用元件，NC位空载体对照；与NC相比较，包含有5个串联的ABRE顺式作 用元件的NO (-1447?-160bp)与NC相比较差异极显著（双星号，P < 0. 01)，包含有3个串 联的ABRE顺式作用元件的NI (-707?-160bp)与NC相比较差异显著（单星号，P <0.05); B图：外源ABA对包含RhNAC3启动子缺失重组体的拟南芥原生质体中⑶S活性的影响。不 同缺失片段的RhNAC3启动子（N0，N1，N2)和空载对照（NC)被转入拟南芥原生质体，其中， NO, NI, N2和NC如上所述。采用O μ M和10 μ M ABA处理原生质体2h ;孵育24h之后检测 ⑶S活性。由图B可知，与对照NC相比较，在未加 ABA时，不同片段之间⑶S活性无显著性 差异，当施加10 μ MABA处理后，含有5个串联的ABRE顺式作用元件的NO (-1447?-160bp) 与NC相比较达到极显著差异（双星号，P值< 0. 01)，含有3个串联的ABRE顺式作用元件 的NI (-707?-160bp)与NC相比较达到显著差异（单星号，P值<0.05)。C图：RhNAC3启 动子对ABA的响应。MS培养基生长9天的转基因实生苗转入有10 μ M ABA的MS培养基生 长4d，然后进行⑶S染色。由图可知，ABA强烈的诱导了 RhNAC3转录活性的表达。从上可 知：RhNAC3启动子中ABREs元件对RhNAC3的转录活性有一个累积效应（图2A)，并且ABA 处理可以更加明显诱导RhNAC3启动子的转录活性（图2B)。ABA处理可以加强RhNAC3启 动子的转录活性（图2C)。
[0021] 图3显示了 RhNAC3转基因株系提高了对ABA的敏感性。A图：对照（WT和VC)和 RhNAC3转基因植株（0E#3,6，12)种子的萌发率。3个RhNAC3过表达株系（0E#3,6，12)和 对照（WT，VC)种子分别播种在含有0,0. 2,0. 4 μ M ABA的MS培养基中。图中所示为所播植 株5d后的生长情况，萌发率为在生长7d时统计。B图：RhNAC3转基因株系（0Ε#3,6，12)和 对照（WT，VC)的种子萌发率统计。双星号显示为在0.2和0.4 μ MABA RhNAC3转基因株系 (0E#3,6,12)与对照（VC)相比较差异极显著（P值< 0. 01)。误差线为标准误（η = 3)。B 图：对照和转基因植株中ABA剂量对主根长度和侧根数目的影响。C图：对照（WT和VC)和 RhNAC3转基因植株（0Ε#3,6，12)根生长表型。7d大的对照实生苗（WT，VC)和3个RhNAC3 转基因株系（〇E#3, 0E#6, 0E#12)分别被转移到分别含有0, 5,10和30 μ M ABA的MS培养 基中，IOd之后统计根形态表型，由图可知，在分别以0和5μ M ABA处理时，RhNAC3转基因 株系（0E#3,6,12)和对照（WT，VC)根部表型一致，10 μ M和30 μ M ABA的MS培养基中，与 对照（VC)相比较，RhNAC3转基因株系（0Ε#3,6,12)的初生根根长更短，侧根数目更少；D 图：RhNAC3转基因株系（0Ε#3,6，12)和对照（WT，VC)初生根主根长分析。RhNAC3转基因 株系（0E#3,6，12)和对照（WT，VC)植株生长IOd之后进行初生根主根长长度统计，hNAC3 转基因株系（〇E#3,6，12)和对照（WT，VC)植株分别用15棵苗子进行统计；E图：RhNAC3转 基因株系（〇E#3,6，12)和对照（WT，VC)侧根数量分析，RhNAC3转基因株系（0E#3,6，12)和 对照（WT，VC)植株生长IOd之后侧根数目统计分析，RhNAC3转基因株系（0E#3,6，12)和对 照（WT，VC)植株分别用15棵苗子进行统计。上述结果表明：拟南芥种子萌发率随ABA浓 度的升高有所下降，而在同水平ABA (0. 2和0. 4 μ M ΑΒΑ)处理下，与对照（VC)植株相比较， RhNAC3转基因株系（0Ε#3,6，12)植株种子萌发率降低更为显著（图3Α和Β)，说明在转基 因拟南芥中，RhNAC3过表达导致种子萌发阶段的ABA超敏感性。在幼苗根部表型上，与对 照（VC)植株相比较，RhNAC3转基因株系（0E#3,6,12)植株在初生根长度和侧根数目上均 出现降低趋势，RhNAC3过表达在根部生长阶段也对ABA表现敏感（图3C、D和E)。
[0022] 图4显示了 ABA和干旱处理下拟南芥中RhNAC3转基因株系的气孔开度情况。A图： ABA处理下对照（WT，VC)和RhNAC3转基因株系（0E#3,6，12)叶片气孔开度，3周苗龄的2 个对照（WT，VC)和3个RhNAC3的转基因株系（0E#3,6，12)的成熟叶片分别用气孔缓冲液 (0 μ M)和10 μ M ABA (气孔缓冲液基础上添加10 μ M ΑΒΑ)处理2h。选取远轴端的表皮细 胞气孔用光学显微镜（Olympus BX-51)观测拍照。RhNAC3转基因株系（0E#3,6，12)和对照 (WT，VC)植株，每个株系样本至少用20个保卫细胞测量气孔开度（宽度/长度）。双星号 表示在10 μ M ABA处理下过表达株系与对照相比差异极显著（P < 0. 01)。标尺=10 μ m。 B图：干旱处理下对照（WT，VC)和RhNAC3转基因株系（OE#3,6，12)叶片气孔开度。3周苗 岭的对照（WT、VC)和RhNAC3转基因株系（OE#3,6，12)分别在正常条件生长和干旱处理条 件下生长l〇d，分别取远轴端的表皮细胞气孔用光学显微镜（Olympus BX-51)拍照后测量， 每个株系用至少20个保卫细胞测量气孔开度（宽度/长度）。单星号表示在IOd干旱处 理下过表达株系（〇E#3)与对照（VC)相比差异显著（P < 0. 05)，双星号表示在IOd干旱处 理下过表达株系（〇E#6,12)与对照（VC)相比差异极显著（P< 0.01)。标尺=10 μ m。上 述结果表明：ABA可以促进气孔关闭，并且可极大地促进RhNAC3转基因株系的气孔关闭，使 ABA处理下RhNAC3转基因株系（0E#3,6，12)气孔开度更小，气孔关闭更为迅速（图4A) ;10d 干旱处理可以诱导RhNAC3转基因植物叶片气孔开度相对于对照（VC)明显减小（图4B)。 RhNAC3以依赖ABA的方式参与植物对水分胁迫的响应。
[0023] 图5显示了 RhNAC3可以正调控ABA响应基因的表达。A图：RhNAC3转基因株系 (0E#3，6，12)中ABA响应基因基因的表达模式。已经明确，RD29A、RD29B、RD20、RD26、C0R47、 C0R15A、KIN2、ABII、ABI3、ABF4、ABA3分别为拟南芥中ABA响应基因，长日照（16h光照/8h 黑暗）条件下，取3周大的VC和和RhNAC3转基因株系（0E#3,6,12)生长的地上部分放在 实验台上（23-25°C，40-50%相对湿度）干旱3h并进行取样。Trizol法提取总RNA后并反 转录成cDNA，并用qRT-PCR法分析11个ABA响应基因的在干旱胁迫后的基因表达量的相对 诱导倍数，诱导倍数大于2视为上调表达。图中数值代表干旱与对照条件下，每个基因的诱 导倍数用3个株系的生物学重复的平均值表示，用内标基因 Actin2作标准化。B图：月季 中与拟南芥高度同源的ABA响应类基因。RU25535、RU07831、RU01455、RU06450、RU04740、 RU22946、RU24499、RU03861、RU26868分别为月季中与拟南芥ABA响应基因的同源基因 。C 图：月季中ABA响应基因在正常植株（TRV)和RhNAC3沉默花瓣中（TRV-RhNAC3)的表达。 不同基因的数据代表TRV-RhNAC3相对于TRV的每个基因的倍数变化，变化倍数小于0. 66 视为表达受到抑制，RhUbil为内标作为标准化。上述结果表明：在拟南芥中，RhNAC3正向 调控了 ABA响应基因的表达（图5A)，在RhNAC3沉默月季花瓣中，ABA信号及下游基因的表 达受到明显的抑制（图5B和C)，这些结果表明RhNAC3正向调节ABA响应基因的表达参与 ABA信号途径。

【具体实施方式】
[0024] 本发明在提供了一种NAC蛋白转录因子基因的启动子，其中，所述启动子与SEQ No. 1 具有至少 50%，例如 60%、70 %、80 %、90%、91 %、92%、95 %、97 %、98%、99 % 或 100%的同一'丨生；优选的是，所述核苷酸序列包含选自由acgtg、acgtgc、acgtgg、acgtgc和 acgtgtc组成的组中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或至少五种顺式作用元件。
[0025] 本发明人通过对所述启动子进行深入研究发现，所述启动子是一种诱导型启动 子，具有多种不同类型的逆境胁迫顺式作用元件，特别是包含有串联的ABRE顺式作用元 件，能够受到例如ABA等反式作用因子的作用，从而诱导其下游基因例如ABA响应基因的表 达。这使得该启动子在植物的基因工程中具有极其重要的利用价值。
[0026] 在一些实施方式中，本发明可以利用该启动子的可诱导特性，通过对该启动子进 行遗传修饰，从而促进或抑制该启动子对其下游基因表达的诱导，由此促进或抑制下游基 因的表达。在一些实施方式中，可以通过例如对某一有害植物中与该启动子同源的内源性 启动子进行修饰，从而抑制该启动子的下游基因的表达，由此影响有害植物的正常生长。在 另外一些实施方式中，可以通过对某一植物中的与该启动子同样的内源性启动子进行遗传 修饰，或者通过遗传工程手段例如转基因技术，转入该启动子或者转入该启动子与所要表 达的目标蛋白的基因（即下游基因）的融合基因，从而促进或者过表达下游基因，由此可控 地生成或者促进生成由下游基因编码的有用蛋白。
[0027] 在一些实施方式中，所述下游基因可以是编码任何有用蛋白的基因。例如所述有 用蛋白可以能够用于药物、营养、保健等用途的蛋白。在一些优选的实施方式中，所述下游 基因是与植物耐受逆境胁迫能力有关的基因。所述逆境胁迫选自由低温逆境胁迫、高温逆 境胁迫、干旱逆境胁迫、水涝逆境胁迫、高盐逆境胁迫、生物胁迫、机械伤害胁迫组成的组。
[0028] 本发明人还发现，所述启动子是一种ABA敏感性的启动子，能够受到ABA的作用而 影响其下游基因的表达。
[0029] 于是，在一些实施方式中，本发明利用ABA作用于所述启动子从而控制该启动子 下游基因的表达。如上文所述，ABA是一种非常重要的植物激素，广泛参与植物生长和发育 的许多方面，如胚胎成熟、种子发育、种子萌发、气孔开度调节和激活许多胁迫响应基因，参 与植物开花，ABA还可以调节蒸腾效率控制萎蔫，进而减少植物水分流失。另外，本领域技术 人员应当了解的是，植物在逆境胁迫的作用下常常会产生比在非逆境条件下多得多的ΑΒΑ。 这些逆境胁迫包括例如低温逆境胁迫、高温逆境胁迫、干旱逆境胁迫、水涝逆境胁迫、高盐 逆境胁迫、生物胁迫、机械伤害胁迫等。
[0030] 于是，本发明提供了一种提高植物耐受逆境胁迫能力的方法，所述方法通过融合 表达所述启动子与抗逆蛋白基因来进行。当植物遇到逆境胁迫时，会产生ABA，该ABA作 用于植物体内的所述启动子，由此诱导抗逆蛋白基因的表达，从而提高植物的抗逆性，这是 非常有利的。当植物处在非逆境条件下，植物没有产生或者只是产生低水平的ABA，因此没 有或极少有ABA作用于所述启动子，因此植物不会诱导表达或者极少诱导表达抗逆蛋白基 因。当植物处在逆境胁迫的条件下时，植物会产生比在非逆境胁迫条件下更多的ABA，从而 诱导表达抗逆蛋白基因，从而使植物可以在遇到逆境胁迫时能够非常聪明地自主提高其抗 逆性，无需采用人工措施来防止植物在逆境胁迫条件下无法正常生长。
[0031] 当然，如果植物在逆境条件下所产生的ABA的量不足以充分地作用于所述启动 子，从而无法诱导足量的抗逆蛋白基因以使植物能够具有预期水平的抗逆性，也可以通过 人为施用ABA来提高植物的抗逆性。
[0032] 另外，由于所述启动子对ABA敏感，因此，可以利用ABA控制带有与所述启动子同 源的内源性启动子或者转入由所述启动子或启动子与下游基因的植物控制下游基因的表 达，所述下游基因可以是任何有用的基因，例如抗逆基因，所述抗逆基因例如可以为RhNAC 基因。根据本申请所公开的内容，本领域技术人员在知道所述启动子是诱导型启动子，尤其 是对ABA敏感的诱导型启动子的情况下，完全有能力将有用的基因作为下游基因与所述启 动子融合并转入到植物中，从而利用ABA来控制转基因植物中有用基因的表达。因此，此处 所述有用基因绝非限于RhNAC基因。另外，所述ABA可以是植物本身产生的内源性ABA，也 可以是外部施加的外源性ΑΒΑ。优选的是，所述ABA是内源性ΑΒΑ。
[0033] 另外，本发明人还发现，所述启动子中在植物中该启动子表达具有广泛性，并且尤 为重要的是，所述启动包含多种串联ABRE顺式作用元件，这些顺式作用元件对ABA的响应 表现出累计效应。尤其可以通过遗传修饰手段控制所述顺式作用元件的种类和数量，量化 地或者精确地控制所述启动子下游基因的表达。
[0034] 本发明还提供了用于所述启动子进行克隆、检测、定位、过表达或沉默的引物对， 其中，所述引物对选自由引物对SEQ NO. 2和15、SEQ NO. 2和16、SEQ NO. 2和17、SEQ NO. 2 和 18、SEQ NO. 3 和 19、SEQ NO. 4 和 19、SEQ NO. 5 和 6、引物对 SEQ NO. 7 和 8、引物对 SEQ NO. 9和12、引物对SEQ NO. 10和12、引物对SEQ NO. 11和12、引物对SEQ NO. 13和14组成 的组。
[0035] 在一些实施方式中，本发明还提供了一种克隆所述的启动子的方法，其中，所述方 法使用选自由引物对 SEQ NO. 2 和 15、SEQ NO. 2 和 16、SEQ NO. 2 和 17、SEQ NO. 2 和 18、SEQ NO. 4和19组成的组中的至少一个引物进行。所述方法包括如下步骤：以植物DNA为模板， 通过 PCR 由引物对 SEQ NO. 2 和 15、SEQ NO. 2 和 16、SEQ NO. 2 和 17、SEQ NO. 2 和 18 中的 任意一对引物获得的第一产物；以所述第一产物为模板，通过PCR由所述引物对SEQ NO. 3 和19获得第二产物；以及以所述第二产物为模板，通过PCR由所述引物对SEQ NO. 4和19 克隆所述启动子。在另外一些实施方式中，所述方法以植物DNA作为模板由所述引物对SEQ NO. 5和6直接克隆得到所述启动子。
[0036] 在一些实施方式中，本发明提供了一种克隆或检测技术方案1所述的启动子的方 法，其中，所述方法包括使用引物对SEQ NO. 5和6、和/或引物对SEQ NO. 7和8进行；优选 的是，所述检测通过⑶S活性检测进行，并且使用引物对SEQN0. 7和8进行。
[0037] 在一些实施方式中，本发明还提供了一种检测植物对ABA的敏感性的方法，所述 方法包括对技术方案1所述的启动子进行检测；优选的是，所述方法包括对所述启动子的 ABA顺式作用元件的存在和/或数量进行检测。
[0038] 在一些实施方式中，本发明提供了一种提高植物耐受逆境胁迫能力的方法，所述 方法包括利用技术方案1所述的启动子进行；优选的是，所述方法通过改变植物对ABA的 敏感性来实现；另外优选的是，所述方法通过提高植物对ABA的敏感性来实现；另外优选的 是，所述逆境胁迫导致所述植物的ABA生成量增加；另外优选的是，所述逆境胁迫选自由低 温逆境胁迫、高温逆境胁迫、干旱逆境胁迫、水涝逆境胁迫、高盐逆境胁迫、生物胁迫、机械 伤害胁迫组成的组。在一些实施方式中，所述方法通过将所述启动子与耐受逆境胁迫有关 的基因的融合表达来实现；优选的是，所述耐受逆境胁迫有关的基因为RhNAC3。在一些实 施方式中，所述融合表达利用外部施加的外源性ABA或者植物本身产生的内源性ABA来诱 导；进一步优选的是，所述融合表达利用植物本身产生的内源性ABA来诱导。
[0039] 本发明人还惊讶地发现，RhNAC3转基因株系提高了对ABA的敏感性。ABA和干旱 处理下RhNAC3转基因株系的气孔关闭更迅速，从而降低了植物受到干旱胁迫时的失水速 度和失水量，由此提高了植物耐受失水胁迫的能力。植物在众多逆境胁迫中都会产生ABA， 而RhNAC3的上述启动子对ABA敏感。因此，本发明还提供了 RhNAC3在提高植物耐受逆境 胁迫能力中的应用，尤其是提高植物耐受失水胁迫能力中的应用。优选的是，所述应用通过 将所述RhNAC3基因与所述的启动子的融合表达来实现。
[0040] 另外，本发明还提供了含有技术方案1所述的启动子的载体；优选的是，所述载体 为质粒载体、噬菌体载体或病毒载体；另外有选的是，所述载体为克隆载体或表达载体。
[0041] 下文将通过实施例对本发明进行进一步的说明。应当理解的是，这些实施例仅仅 出于说明目的，不应被理解为是对本发明请求保护的范围的限制。
[0042] 实施例
[0043] 为了研究RhNAC3的调控机制，对RhNAC3上游调节序列进行分离，提取了月季基因 组 DNA，利用基因组 DNA，以 High-tail PCR(Liu Y，Chen Y(2007)High_efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences. BioTechniques43 :649-656.)方法经过3轮反向PCR获得RhNAC3的启动子片段，并采用生 物信息学的方法对获得的启动子片段进行分析，以明确其中所包含的重要顺式作用元件。
[0044] 1 · RhNAC3启动子克隆
[0045] 试验材料月季切花（Rosa hybrid L.)品种'萨蔓莎'（'Samantha'），于旺盛营养 生长期采收健康月季的幼嫩茎叶和处于商业采收级别为2级（处于花蕾时期）的花枝，立 即插于水中。将芽尖和幼叶去除叶柄后放于塑料袋中，用于DNA的提取。
[0046] 月季叶片基因组DNA的提取采用CTAB法，具体操作如下：
[0047] A.取2g月季切花的幼嫩叶片样本，置于液氮预冷的研钵中充分研磨至样本呈现 粉末状，迅速转入50mL离心管中，加入10mL65°C预热的2XCTAB溶液（1M Tris-HCl，pH8. 0， 0.5M EDTA，5M NaCl，2% CTAB)。置于碎冰中冰浴。
[0048] B.加入ImL B-巯基乙醇，用光滑的玻璃棒搅拌。置于水浴摇床中56°C、转速 IOOrpm下水浴45min，水浴过程中用玻璃棒小心搅拌混合数次。
[0049] C.加入IOmL CIA(氯仿：异戊醇=24 : 1，体积比）抽提液，轻柔颠倒混合，放入 37°C水浴摇床中、转速120rpm下水浴20min。
[0050] D.常温、3000rpm转速下离心20min。用切除尖端的ImL枪头，吸取上清液（含有 基因组DNA)，转入新的50mL离心管中。
[0051] E.加入上清液体积1/10的CTAB溶液，轻柔混合，然后再加入10ml CIA (氯仿：异 戊醇=24 : 1，体积比）置入37°C水浴摇床中于、转速120rpm下水浴20min。
[0052] F.常温、3000rpm转速下离心20min。小心吸取上清液到新的50mL离心管中。
[0053] G.沿试管壁缓慢加入 DNA 沉淀缓冲液（1M Tris-HCl，pH8. 0,0. 5M EDTA，1% CTAB)，轻柔颠倒混合15-20次，至DNA完全沉淀。
[0054] H.用玻璃弯钩（酒精喷灯高温拉伸做成）挑取出DNA絮状沉淀，转入含有5mL的 IM NaCl的试管中，56 °C水浴轻轻摇动2h。
[0055] I.分别用70%和100%乙醇清洗DNA两遍，在空气或真空中晾干。
[0056] J.加入 ImL 的 TE 溶液（IOmM Tris-HCl，pH8. 0, ImM EDTA)使 DNA 溶解，于 37°C下 过夜。
[0057] 获得月季DNA后，按照High-Tail PCR的方法利用通用简并引物（SEQ NO. 15至19) 和RhNAC3基因3条反向的特异引物（SEQ NO. 2、SEQ NO. 3和SEQN0. 4)进行3轮PCR反应 扩增。
[0058] 第一轮PCR用简并引物（SEQ NO. 15至18)分别和引物SEQ NO. 2进行反应，条 件如下：94°C 5min，95°C IOminl 个循环；95°C 15s，61°C 15s，72°C 30s5 个循环；95°C 15s， 25°C 3min，0. 5°C /s 升至 72°C 3min，72°C 2minl 个循环；
[0059] 95 °C 15s, 44 °C 15s, 72 °C 30s3min ；95 °C 15s, 61 °C 15s, 72 °C 2min,95 °C 15s, 61°C 15s，72°C 2min，95°C 15s，44°C 15s，72°C 2minl5 个循环；72°C IOminl 个循环；KTC结 束；
[0060] 将各对引物获得的四个第一轮产物分别稀释50倍后用于第二轮PCR反应模板，第 二轮PCR用简并引物（SEQ NO. 19)和特异性引物（SEQ NO. 3)进行反应，条件如下：
[0061] 95°C 15s，63°C 15s，72°C 2min，95°C 15s，63°C 15s，72°C 2min，95°C 15s，44°C 15s， 72°C 2minl5 个循环；72°C IOminl 个循环；10°C结束。
[0062] 将四个第二轮产物分别稀释100倍后用于第三轮PCR反应模板，第三轮PCR用简 并引物（SEQ NO. 19)和特异性引物（SEQ NO. 4)进行反应，条件如下：95°C 15s，64°C 15s， 72 °C 2min，95 °C 15s，64 °C 15s，72 °C 2min，95 °C 15s，44 °C 15s，72 °C 2minl5 个循环； 72°C IOminl 个循环；10°C结束。
[0063] 3轮反应结束后，将第二轮和第三轮PCR反应产物用琼脂糖凝胶电泳分离，根据 第二轮和第三轮反应产物的大小和设计SEQ NO. 4和SEQ NO. 3所差的位置确定所得片段 是否为目的片段，将所得目的片段采用Axygen的DNA快速纯化/回收试剂盒（AP-GX-50， Axygen)回收目的 DNA，连接到 Promega 公司的 pGEM-T Easy Vector Systems (Promega)。 将连接产物转化大肠杆菌Dh5 α，取I μ I菌液为模板，用PCR检测和琼脂糖凝胶电泳分析 确定阳性克隆。利用阳性克隆测序并保存阳性克隆以备后用。根据测序后结果设计引物对 SEQ NO. 5 和 SEQ NO. 6。
[0064] 以基因组DNA作为模版，利用SEQ NO. 5和SEQ NO. 6弓丨物扩增得到长度为1447bp 的序列（参见SEQN0. 1)。将该序列命名为RhNAC3启动子序列。
[0065] 2.启动子序列分析
[0066] 将分离得到的RhNAC3启动子提交到植物顺式调控元件在线数据库 PLACE(http://www. dna. affrc. go. jp/PLACE/signalscan. html)和 PlantCARE(http:// bioinformatics· psb. ugent. be/webtools/plantcare/html/)进行顺式作用兀件分析，分 析结果表明，在1447bp的启动子序列中，除含有CAAT和TATA等启动子基本元件外，还包含 有W-box、MYC结合元件、CBF结合元件、MYB结合元件等不同种类的逆境胁迫相关的顺式作 用元件。而且更加令人惊讶的是，RhNAC3启动子还含有串联的5种不同核苷酸类型的ABRE 结合元件。
[0067] 经数据库检索，未见有关于RhNAC3启动子的分离和功能研究的报道。
[0068] 3.⑶S表达的组织化学定位和荧光活性检测
[0069] 获得RhNAC3启动子后，为了研究RhNAC3启动子的基本特性，对其组织化学定位进 行了研究，同时由于RhNAC3启动子中包含有5个串联的ABRE顺式作用元件，对其在ABA处 理下的诱导特性和不同缺失片段的GUS活性进行了探究，以期明确RhNAC3的调控机制。
[0070] 组织化学定位：以⑶S作为报告子，将RhNAC3启动子融合⑶S后转入拟南芥中， 利用引物对SEQ NO. 7和SEQ NO. 8检测获得带有RhNAC3启动子的转基因植株（采用花序 浸蘸法将RhNAC3启动子融合GUS载体转入拟南芥中）。将不同苗龄的T3代拟南芥转基 因植株的叶片、根和花等器官放入2ml试管中，加入200 μ 1组织化学染色液（75. 5mM磷 酸钠 ρΗ7· 0,0· 1 % Triton X-100,0· 05mM K3/K4FeCN，IOmM EDTA，20 % 甲醇（v/v)，50 μ g mrS-溴-4-氯-3-吲哚基-葡萄糖醛酸）。37°C培养箱中放置5h，再用70%的酒精脱色 至显现白色。在体式显微镜（Olympus SEX16)下观察⑶S表达部位并拍照记录。
[0071] 荧光活性检测：利用引物对SEQ NO. 9和SEQ NO. 12获得含有5个串联ABRE顺式作 用元件的N0,利用引物对SEQ NO. 10和SEQ NO. 12获得含有3个串联ABRE顺式作用元件的 N1，利用引物对SEQ NO. 11和SEQ NO. 12获得不含有ABRE顺式作用元件的N2,将含有不同 数目ABRE顺式作用元件缺失片段（NO, NI, N2和NC)转入拟南芥原生质体后测定荧光活性 (方法同上），将RhNAC3启动子融合⑶S的转基因株系用10 μ M处理后，分别测定ABA处理 前后的⑶S荧光活性，将拟南芥植株放入I. 5ml Eppendorf试管中，加入300 μ 1拟南芥⑶S 提取液（50mM磷酸钠（ρΗ7. 0)，IOmM Na2-乙二胺四乙酸（EDTA，ρΗ8. 0)，0. 1 %月桂酰肌氨 酸钠，0. 1% Triton Χ-100, ΙΟπιΜβ -巯基乙醇），在冰上用匀浆机将组织磨碎。4°C 8000rmp 离心IOmin,将上清液转入新管。预先准备160μ L的MUG溶液（ImM)于I. 5ml Eppendorf 试管中，37°C下水浴5min，加入40μ 1的上清液，迅速充分混匀，并立刻取出100μ 1反应混 合液加入到900 μ 1的终止液中（0. 2mol/L的Na2CO3)，将该管作为酶促反应的0点。15min 后，取出剩余的100 μ 1反应混合液，加入到900 μ 1的终止液中。用分光光度计在激发波长 365nm、发射波长455nm下，测定反应前后不同处理样品的荧光值。取100 μ 1的上清液，考 马斯亮蓝法测定样品蛋白含量。计算每个样品单位时间内的GUS活性。
[0072] GUS活性=(反应后突光值-反应前突光值）/蛋白质含量/反应时间
[0073] GUS测定后的结果如图2所示，A图显示RhNAC3启动子缺失片段在拟南芥 原生质体中的GUS活性分析，与NC相比较，包含有5个串联的ABRE顺式作用元件的 NO (-1447?-160bp)与NC相比较差异极显著（双星号，P < 0. 01)，包含有3个串联的ABRE 顺式作用元件的NI (-707?-160bp)与NC相比较差异显著（单星号，P < 0. 05)。B图显 示外源ABA对包含RhNAC3启动子缺失重组体的拟南芥原生质体中⑶S活性的影响。与对 照NC相比较，在未加 ABA时，不同片段之间⑶S活性无显著性差异，当施加10 μ M ABA处理 后，含有5个串联的ABRE顺式作用元件的NO (-1447?-160bp)与NC相比较达到极显著差 异（双星号，P值< 〇. 01)，含有3个串联的ABRE顺式作用元件的NI (-707?-160bp)与NC 相比较达到显著差异（单星号，P值< 0. 05)。C图显示RhNAC3启动子对ABA的响应。ABA 强烈的诱导了 RhNAC3转录活性的表达。
[0074] 4. RhNAC3转基因植株表型观测
[0075] ABRE顺式作用元件的存在对RhNAC3的转录活性具有非常重要的作用，为了进一 步明确RhNAC3的功能，特别是ABA处理后RhNAC3转基因植株的表型，对RhNAC3转基因植 株的种子萌发率和幼苗期根生长表型以及ABA处理下气孔开度进行了测定。
[0076] 1)萌发率统计
[0077] 将筛选出的RhNAC3转基因 T2代纯合体植株播于含有ABA (0,0. 2 μ M，0. 4 μ M)的 MS培养基中（含有3%蔗糖和0.7%的琼脂），4°C低温春化4d后，长日照（16h光照，8h黑 暗）条件培养7d后，拍照并统计萌发率。
[0078] 萌发率如图3所示，拟南芥种子萌发率随ABA浓度的升高有所下降，而在同水平 ABA (0· 2和0· 4 μ M ΑΒΑ)处理下，与对照（VC)植株相比较，RhNAC3转基因株系（0E#3,6,12) 植株种子萌发率降低更为显著（图3A和B)
[0079] 2)初生根根长及侧根统计
[0080] T2代种子在附加3%蔗糖和0. 6%琼脂的MS培养基上萌发，4°C低温春化4d后，长 日照条件培养7d后，转移到新的MS培养基上，培养基中包含ABA (0, 5 μ M，10 μ M，30 μ M)，长 日照条件下将培养皿立向生长IOd之后拍照并统计植株根长及侧根数目。
[0081] 在幼苗根部表型上，与对照（VC)植株相比较，RhNAC3转基因株系（0E#3,6,12)植 株在初生根长度和侧根数目上均出现降低趋势，RhNAC3过表达在根部生长阶段也对ABA表 现敏感（图3C、D和E)。
[0082] 3)转基因植株气孔运动观测
[0083] 选择10片叶龄期的拟南芥（移栽以后ll-13d左右，3周左右大小的苗子），选择 次新一轮大小，状态一致的叶片。如果叶片上有褶皱等不健康的状态均不进行选择。
[0084] A.选取整齐一致的拟南芥植株，选取同一轮叶片中大小，状态一致的叶片，带叶柄 剪下。
[0085] B.叶片背面朝上，放入表皮条缓冲液中（2.0离心管），浸入缓冲液液面以下。每 个管中一片叶子，且不同管中叶片的液下深度要求一致。
[0086] C.将不同的株系均匀置于冷光源下，照射3h。
[0087] D.撕取叶片中脉一侧的下表皮进行观测，看气孔是否已经完全打开。
[0088] E.若气孔已经完全打开，则加入ABA进行处理3h。
[0089] F.撕取叶片中脉另一侧的下表皮进行观测。
[0090] ABA用无水乙醇配置成IOOmM母液，工作液为ImM，用水稀释即可。平时存于-20°C。
[0091] 气孔开度的测定结果如图4所示，ABA可以促进气孔关闭，并且可极大地促进 RhNAC3转基因株系的气孔关闭，使ABA处理下RhNAC3转基因株系（0E#3,6，12)气孔开度更 小，气孔关闭更为迅速（图4A) ;10d干旱处理可以诱导RhNAC3转基因植物叶片气孔开度相 对于对照（VC)明显减小（图4B)。RhNAC3以依赖ABA的方式参与植物对水分胁迫的响应。
[0092] RhNAC3转基因株系在ABA处理下表现为对ABA更为敏感，为了进一步解释高ABA 敏感性的调控方式，选取拟南芥和月季中ABA响应基因，采用实时荧光定量PCR对其表达量 进行检测，以期明确ABA响应基因与ABA敏感性的关系。
[0093] 5.实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)
[0094] A.采用Trizol法提取植物组织材料RNA，用分光光度计检测浓度，甲醛变性胶检 测质量。
[0095] B.利用 DNase I (Takara 公司，D2215, 5U/ μ L)处理 RNA 样品。
[0096] 采用乳如下的IOyL反应体系：总RNA5yg(可处理2?5yg) ;DNase IlyL5DEPC H20补齐到10 μ L ;
[0097] C.体系混匀后轻离心，在37°C下处理20min。
[0098] D.反应完成后65 °C处理IOmin使DNaseI变性（PCR仪中完成），变性完的样品 在-80°C保存。
[0099] E.取1 μ L样品跑胶检测RNA质量，另外取1 μ L稀释100倍，测定RNA的含量。
[0100] F.米用 SuperScriptTM II RNase H Reverse Transcriptase (Invitrogen)和 Oligo dT18 (Invitrogen)进行反转录，采用如下的25 μ L反应体系：寡聚dT引物1 μ L ;总 尺隱2以8;补水至18以1^，701€变性5111；[11，迅速冷却至少1111；[11，离心 ；5\第一链缓冲液5 μ L ; dNTPl μ L ;uperScriptTM II RNase H 逆转录酶 1 μ L。
[0101] G.加完样品后轻弹管底混匀离心，42°C反应90min，后冰浴lOmin，稀释5倍获得 cDNA第一链-20°C保存备用。
[0102] Η·实时荧光定量 PCR :采用仪器 ABI PRISM St印 ONE Plus Real-time PCR System(Applied Biosystems，Foster City，CA, USA)和试剂盒 ΚΑΡΑ SYBR FAST qPCR KIT (ΚΑΡΑ Biosystems，Boston，Massachusetts，USA)进行定量 PCR 反应。
[0103] I.加好反应体系后，将样品加入实时定量PCR仪（Applied Biosystems，Foster City，CA, USA)中，设置反应条件如下：
[0104] 95°C IOmin ;95°C 15s ;6(TC lmin，40 个循环。
[0105] J.反应结束后进行数据处理，采用双Λ ΛΤ方法计算各基因的相对表达量。
[0106] 在拟南芥和月季中对ABA响应基因的表达检测结果如图5所示。在拟南芥中， RhNAC3正向调控了 ABA响应基因的表达（图5Α)，在沉默RhNAC3月季花瓣中，ABA信号及 下游基因得表达受到明显的抑制（图5B和C)，这些结果表明RhNAC3正向调节ABA响应基 因的表达参与ABA信号途径。
[0107] 利用拟南芥数据库（http://www. arabidopsis. org)TAIR Loci Upstream Seq-IOOObp方法，对拟南芥中ABA响应基因的上游调节序列进行了进一步分析，以期确定 这些基因的上游调节区域中是否含有NAC蛋白结合元件，所得结果如表1所示。其中获得 了 11个ABA响应基因的上游IOOObp的调控序列，通过对上游调节序列的分析。在所分析 的11个ABA响应基因中，均发现含有不同数目和类型的NAC蛋白结合位点，表明上述基因 是RhNAC3调控的直接靶基因。
[0108] 表IABA响应基因启动子序列NAC结合元件分析
[0109]

【权利要求】
1. 一种NAC蛋白转录因子基因的启动子，其中，所述启动子与SEQ No. 1具有至少50%， 例如 60%、70%、80%、90%、91%、92%、95%、97%、98%、99%或 100% 的同一性； 优选的是，所述核苷酸序列包含选自由acgtg、acgtgc、acgtgg、acgtgc和acgtgtc组 成的组中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或至少五种顺式作用元件。
2. 用于对权利要求1所述的启动子进行克隆、检测、定位、过表达或沉默的引物对，其 中，所述引物对选自由引物对SEQ NO. 2和15、SEQ NO. 2和16、SEQ NO. 2和17、SEQ NO. 2和 18、5￡0勵.3和19、5￡0勵.4和19、5￡0勵.5和6、引物对5￡0勵.7和8、引物对5￡0勵.9 和12、引物对SEQ NO. 10和12、引物对SEQ NO. 11和12、引物对SEQ NO. 13和14组成的组。
3. -种克隆权利要求1所述的启动子的方法，其中，所述方法使用选自由引物对SEQ NO. 2 和 15、SEQ NO. 2 和 16、SEQ NO. 2 和 17、SEQ NO. 2 和 18、SEQ NO. 3 和 19、SEQ NO. 4 和 19组成的组中的至少一个引物进行。
4. 一种克隆或检测权利要求1所述的启动子的方法，其中，所述方法包括使用引物对 SEQ No. 5和6、和/或引物对SEQ NO. 7和8进行； 优选的是，所述检测通过GUS活性检测进行，并且使用引物对SEQ NO. 7和8进行。
5. -种检测植物对ABA的敏感性的方法，所述方法包括对权利要求1所述的启动子进 行检测； 优选的是，所述方法包括对所述启动子的ABA顺式作用元件的存在和/或数量进行检 测。
6. -种提高植物耐受逆境胁迫能力的方法，所述方法包括利用权利要求1所述的启动 子进行； 优选的是，所述方法通过改变植物对脱落酸的敏感性来实现； 另外优选的是，所述方法通过提高植物对脱落酸的敏感性来实现； 另外优选的是，所述逆境胁迫导致所述植物的脱落酸生成量增加； 另外优选的是，所述逆境胁迫选自由低温逆境胁迫、高温逆境胁迫、干旱逆境胁迫、水 涝逆境胁迫、高盐逆境胁迫、生物胁迫、机械伤害胁迫组成的组。
7. 如权利要求6所述的方法，其中，所述方法通过将所述启动子与耐受逆境胁迫有关 的基因的融合表达来实现； 优选的是，所述耐受逆境胁迫有关的基因为RhNAC3。
8. 根据权利要求6或7所述的方法，其中，所述融合表达利用外部施加的外源性脱落酸 或者植物本身产生的内源性脱落酸来诱导； 进一步优选的是，所述融合表达利用植物本身产生的内源性脱落酸来诱导。 9. RhNAC3基因在提高植物耐受胁迫能力中的应用； 优选的是，所述应用通过将所述RhNAC3基因与权利要求1所述的启动子的融合表达来 实现。
10. 含有权利要求1所述的启动子的载体； 优选的是，所述载体为质粒载体、噬菌体载体或病毒载体； 另外有选的是，所述载体为克隆载体或表达载体。
【文档编号】C12N15/10GK104372005SQ201410528697
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年10月9日 优先权日:2014年10月9日
【发明者】张常青, 姜新强, 高俊平 申请人:中国农业大学