一种简易式鉴定蛋白酶活性的方法
【专利摘要】本发明是一种简易式鉴定蛋白酶活性的方法，包括（1）酪蛋白凝胶的制备；（2）对待测物质进行蛋白酶活性的鉴定。酪蛋白凝胶制备时将酪蛋白加入到NaOH溶液，溶解成悬浊液后灭菌，加无菌蒸馏水混匀；取转谷氨酰胺酶溶解于水中，过滤；将酪蛋白溶液与酶溶液混匀，注入层析柱导液硬质塑料管内，形成酪蛋白凝胶。本发明通过将待测物溶液直接与酪蛋白凝胶共孵育，观察酪蛋白凝胶是否溶解，判断某种物质是否具有蛋白酶活性。本发明方法具有低成本、直观、简便的特点，为鉴定蛋白酶活性提供了极大方便。
【专利说明】一种简易式鉴定蛋白酶活性的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种活性鉴定方法，特别是一种简易式鉴定蛋白酶活性的方法。
【背景技术】
[0002]蛋白酶（proteinase或proteolytic enzymes),是水解蛋白质肽键的一类酶的总称。蛋白酶广泛存在于动物、植物和微生物中，种类繁多，活性多样。在医学、食品、工业等领域中有重要应用价值。从各种生物样本中筛选活性更高、更独特的蛋白酶一直是一个重要的研究领域。如何从众多的生物样本中快速、简便地筛选出具有蛋白酶活性的样本是一个需要不断研究的问题。
[0003]目前，蛋白酶活性鉴定主要有以下方法：1，使用特殊底物，通过蛋白酶作用释放有强光吸收的物质，经过分光光度法鉴定待测物是否有蛋白酶活性。例如，使用异硫氰酸突光素（fluorescein isothiocyanate)标记的酪蛋白为底物，蛋白酶作用后释放异硫氰酸突光素，在485 nm光波下有强吸收峰（Twining, Sally S. Fluoresceinisothiocyanate-Iabeled casein assay for proteolytic enzymes. AnalyticalBiochemistry, 1984，143(1) : 30-34. ) ;2，将酪蛋白或明胶等底物添加到琼脂平板中，将待测物滴加到平板上，保温一定时间，观察是否出现透明圈，进而判断是否具有蛋白酶活性，通过测量透明圈大小可比较不同样品蛋白酶活性；3，环境样本中的蛋白酶鉴定的方法多样，如土壤蛋白酶活性测定中较为通用的方法有荷夫曼法、洛美科法和加勒斯江法(曹承绵，张志明，周礼恺.几种土壤蛋白酶活性测定方法的比较，土壤通报，1982，02)。这些方法通过化学显色鉴定蛋白酶活性，操作较为繁琐。
[0004]目前的筛选方法有如下缺点：一）成本高。方法I中的异硫氰酸荧光素标记的酪蛋白底物，市场价格较为昂贵(约800元/mg)，而干酪素的市场价格约80元/kg。二）普遍适用性不强。方法2中的透明圈法虽然简便，但是对于一些酸性蛋白酶不适用，因为琼脂形成凝胶的条件是中性偏碱的环境。三)需要分光光度计。方法I和3中，均需要通过分光光度计测定水解物的吸光度值，才能鉴定样品中的蛋白酶活性及比较活性大小。
[0005]因此，在蛋白酶研究初期，有必要建立新的快捷、低成本、简易可靠的蛋白酶活性鉴定的方法。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是针对目前现有技术的不足，如劳动强度大、操作繁琐、成本高等，提供一种成本低、易操作、结果可靠的简易式蛋白酶活性鉴定的方法。
[0007]本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种简易式鉴定蛋白酶活性的方法，其特点是，包括以下步骤：
(I)酪蛋白凝胶的制备：称取6 g酪蛋白，加入到30 mL质量浓度为0.8%的NaOH溶液中，微波炉中中等火力溶解成悬浊液，然后放入高压蒸汽灭菌锅中121°C灭菌30 min，取出后再加入10 mL无菌蒸馏水，混匀得酪蛋白溶液；称取8 g转谷氨酰胺酶，溶解于20 ml水中，过滤除菌得酶溶液；将酪蛋白溶液与10 ml酶溶液混匀，注入外径2. O _、内径I _的层析柱导液硬质塑料管内，25 °〇保温过夜，形成酪蛋白凝胶，置于-20 °C长期保存；使用时，按一定长度切断装有酪蛋白凝胶的导管，直接放入待测物溶液中；或者使用注射器推注空气于装有酪蛋白凝胶的导管，将酪蛋白凝胶条推出后使用；
(2)对待测物质进行纤维蛋白溶解活性的鉴定：通过将待测物溶液与酪蛋白凝胶块共孵育，观察酪蛋白凝胶是否水解，判断待测物是否具有蛋白酶活性，以及蛋白酶活性大小的比较。
[0008]本发明所述的一种简易式鉴定蛋白酶活性的方法的步骤（2)鉴定时，可以将固体待测物溶解于去离子水中，取150 μ I溶液加入到96孔细胞培养板的孔或离心管中，液体待测物则直接加入孔中；将步骤（I)中制备的酪蛋白凝胶管或胶条切成一定长度，一端插到待测物溶液中，25 °C保温1-3 h，观测凝胶条溶解情况；如果凝胶条出现溶解，则待测物具有蛋白酶活性。
[0009]本发明所述的一种简易式鉴定蛋白酶活性的方法的步骤（2)中，多个样品进行蛋白酶活性大小比较时，可以通过测量水解的凝胶条长度和水解时间来比较蛋白酶活性大小，酶活力义为：单位时间内单位体积或质量的样品水解凝胶条的长度。
[0010]与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明提供了一种鉴定蛋白酶活性的简易方法，利用干酪素凝胶管或切段作为待测酶液底物，肉眼观察凝胶水解情况，可以快速鉴定蛋白酶活性存在与否及大小比较。与荧光素标记底物法相比，该方法具有成本低的优点；与琼脂平板透明圈法相比，该方法具更广的适用性(详见【背景技术】)。另外，本方法不需要分光光度计，既可以避免设备条件限制，也可以排除复杂样品（如环境样品）中其它强吸光性物质的干扰。同时，干酪素凝胶的化学稳定性较好，对酸碱试剂、蛋白质变性剂、表面活性剂均有较好的稳定性，因此该方法的蛋白酶活性特异性较好(详见实施实例6)。整个过程操作简单、成本低、劳动强度较小，为鉴定蛋白酶活性提供了极大方便。
【具体实施方式】
[0011]以下通过实例进一步说明本发明，以使本领域技术人员更好地理解本发明，而不构成对本发明权利的限制。
[0012]实施例1，一种简易式鉴定蛋白酶活性的方法，其步骤如下：
(I)酪蛋白凝胶的制备：称取6 g酪蛋白，加入到O. 8% NaOH溶液30 mL中，微波炉中中等火力溶解成悬浊液，然后放入高压蒸汽灭菌锅中121°C灭菌30 min，取出后再加入10 mL无菌蒸馏水，混匀。称取8 g转谷氨酰胺酶，溶解于20 ml水中，过滤除菌。将酪蛋白溶液与10 ml酶溶液混匀，注入层析柱导液硬质塑料管（外径2. O _，内径I mm)内，25 °C保温过夜，即可形成酪蛋白凝胶，可置于-20 °C长期保存。
[0013]使用时，可以按一定长度切断装有酪蛋白凝胶的导管，直接放入待测物溶液中，也可以使用注射器推注空气于装有酪蛋白凝胶的导管，将酪蛋白凝胶条推出后使用。
[0014](2)对待测物质进行纤维蛋白溶解活性的鉴定：将固体待测物溶解于去离子水中，取150 μ I溶液加入到96孔细胞培养板的孔中（或离心管)，液体待测物则直接加入孔中。将步骤（I)中制备的酪蛋白凝胶管切成一定长度(如3 cm)，一端插到待测物溶液中，25 V保温1-3 h，观测凝胶条溶解情况。
[0015]如果凝胶条出现溶解，则待测物具有蛋白酶活性。多个样品进行蛋白酶活性大小比较时，可通过测量水解的凝胶条长度和水解时间来比较蛋白酶活性大小，酶活力可以定义为：单位时间内单位体积(或质量）的样品水解凝胶条的长度。
[0016]实施例2，多种蛋白酶对酪蛋白凝胶条水解实验，
为测定酪蛋白凝胶的普遍适用性，选择动物来源的胰蛋白酶、胃蛋白酶、弹性蛋白酶，植物来源的木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶，微生物来源的蛋白酶K、枯草杆菌蛋白酶来测试水解酪蛋白凝胶条的效果。胃蛋白酶用O. I M的HCl溶液配制，其余蛋白酶均用O. 015 M的TrisHCl溶液（pH 7. O)配制。过滤除菌。酪蛋白凝胶条和酶活性测定方法按照实施例I中的方法操作。各种酶溶液均于37°C保温I h。取出凝胶条观察，各种蛋白酶对酪蛋白凝胶均有水解作用。
[0017]实施例3，蛋白酶活性大小比较实验
用O. 015 M的TrisHCl溶液（pH 7. O)配置不同浓度的胰蛋白酶溶液，酶活单位测定采取中国药典2010年版二部中操作方法，浓度分别为2500 U/ml、1250 U/ml、625 U/ml、300U/ml、150 U/ml，过滤除菌。剪取实施实例I中制备的凝胶条（2. 5 cm长)，加入到胰蛋白酶的梯度溶液中，37°C保温4 h，取出各个凝胶条，其水解区为透明状，测量其透明区的长度，从高浓度到低浓度分别对应的水解长度约为9 mm、4 mm、3 mm、l mm、l mm。本实验结果中，当蛋白酶浓度较高时（>300 U/ml)，凝胶条水解长度差别较大；当浓度较低时（〈300 U/ml),凝胶条水解长度差别较小。本方法能够较好的比较不同浓度待测液的蛋白酶活性大小。
[0018]实施例4，无导管凝胶条的蛋白酶水解实验
按照实施例I中的方法制备凝胶条，并用洗耳球或者注射器将凝胶条从塑料导管中推出，用无菌手术刀切成3 mm左右切段。配置2500 U/ml浓度的胰蛋白酶溶液，过滤除菌，力口入到酶标条中，每孔200 μ I。将凝胶条切段放入酶溶液中，用Para封口膜将酶标条密封，放入371：温箱中保温0.5 h，取出后观察凝胶条水解情况。结果表明，用无导管凝胶条测试蛋白酶活性方法可行。
[0019]实施例5，无导管凝胶条和具导管凝胶条的蛋白酶水解速度对比实验
利用实施实例3和4中的方法，分别测试I cm长度的凝胶条在无导管和有导管情况下，被2500 U/ml浓度的胰蛋白酶完全水解所用的时间。结果为，该浓度胰蛋白酶37 V水解Icm无导管凝胶条所用时间为I. 5 h，而水解I cm具导管凝胶条则需4.5 h。结果说明，无导管凝胶条在测试蛋白酶活性实验中耗时更低。
[0020]实施例6，酪蛋白凝胶条对酸碱试剂、蛋白变性剂、表面活性剂的稳定性测试实验配制O. I M氢氧化钠溶液、O. I M盐酸溶液、4 M尿素溶液、10 %十二烷基磺酸钠溶液。
按照实施实例4中方法将4 mm无导管酪蛋白凝胶条分别加入上述溶液中，37 1：保温保温48小时，每隔一定时间观察凝胶水解情况。保温12 h后，各溶液中凝胶均未溶解；24 h以后，O. I M氢氧化钠溶液中的凝胶条出现溶解，其余溶液未出现溶解；36 h后，O. I M氢氧化钠溶液中的凝胶条完全溶解，其余溶液未出现溶解；48 h后，O. I M盐酸溶液、4 M尿素溶液、10 %十二烷基磺酸钠溶液中的凝胶条仍未出现溶解。实验结果表明，酪蛋白凝胶条对酸碱试剂、蛋白变性剂、表面活性剂有较好的稳定性，在对未知来源样品进行蛋白酶活性测定时，出现阴性结果的可能性较低。
【权利要求】
1.一种简易式鉴定蛋白酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)酪蛋白凝胶的制备:称取6g酪蛋白，加入到30 mL质量浓度为0.8%的NaOH溶液中，微波炉中中等火力溶解成悬浊液，然后放入高压蒸汽灭菌锅中121°C灭菌30 min，取出后再加入10 mL无菌蒸馏水，混匀得酪蛋白溶液；称取8 g转谷氨酰胺酶，溶解于20 ml水中，过滤除菌得酶溶液；将酪蛋白溶液与10 ml酶溶液混匀，注入外径2.0 _、内径I _的层析柱导液硬质塑料管内，25 °〇保温过夜，形成酪蛋白凝胶，置于-20 °C长期保存；使用时，按一定长度切断装有酪蛋白凝胶的导管，直接放入待测物溶液中；或者使用注射器推注空气于装有酪蛋白凝胶的导管，将酪蛋白凝胶条推出后使用； (2)对待测物质进行纤维蛋白溶解活性的鉴定:通过将待测物溶液与酪蛋白凝胶块共孵育，观察酪蛋白凝胶是否水解，判断待测物是否具有蛋白酶活性，以及蛋白酶活性大小的比较。
2.根据权利要求1所述的一种简易式鉴定蛋白酶活性的方法，其特征在于:步骤(2)鉴定时，将固体待测物溶解于去离子水中，取150 μ I溶液加入到96孔细胞培养板的孔或离心管中，液体待测物则直接加入孔中；将步骤(I)中制备的酪蛋白凝胶管或胶条切成一定长度，一端插到待测物溶液中，25 °C保温1-3 h，观测凝胶条溶解情况；如果凝胶条出现溶解，则待测物具有蛋白酶活性。
3.根据权利要求1所述的一种简易式鉴定蛋白酶活性的方法，其特征在于:步骤(2)中，多个样品进行蛋白酶活性大小比较时，通过测量水解的凝胶条长度和水解时间来比较蛋白酶活性大小，酶活力义为:单位时间内单位体积或质量的样品水解凝胶条的长度。
【文档编号】C12Q1/48GK104263811SQ201410530719
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年10月10日 优先权日:2014年10月10日
【发明者】焦豫良 申请人:淮海工学院