Mre11基因突变检测体系及其试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种MRE11基因突变检测体系及其试剂盒，包括用于检测MRE11A390G_1328C>G、P631T_2050C>A及R633Q_G2057G>A三个突变位点的引物序列，还包括可靠性高、获取简便、可规模化应用的对应野生型和突变型对照。本发明的MRE11基因突变检测体系及其试剂盒揭示了用于检测的HRM反应体系，可以覆盖多突变位点检测，特异性强，具有快速、准确、高灵敏度等特点。
【专利说明】MRE11基因突变检测体系及其试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明设计涉及一种基因突变的检测产品以及该产品所用到的特异性引物，属于 生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 生物体基因组DNA会时常受到一系列内源或外源DNA损伤试剂的作用而出现 DNA 断裂，包括双链断裂（Double Strains Breaks，DSB)和单链断裂（single- strand breaks，SSB)。如果DNA双链断裂不能得到及时有效地修复，会导致基因组不稳定性，如染色 体缺失，易位，染色体融合、多拷贝染色体等，引起多种人类疾病，甚至癌症的发生。正常情 况下，生物有机体形成了一系列DNA损伤修复机制，以应对损伤的DNA。MRN复合物进化上高 度保守，是参与DNA损伤修复的一个关键分子，由MREl I、NBS1和RAD50蛋白组成，是最先识 另Ij DNA双链断裂并发出信号的反应子，在DNA复制、DNA损伤修复以及细胞周期检验点的信 号传导中发挥着至关重要的作用。MRN探测DNA损伤（DNA双链是否断裂)的情况，并在探测 至IjDNA损伤信号后将把这个信息传递给一系列蛋白激酶，包括ATM(ataxia telangiectasia mutated，毛细血管扩张性共济失调症突变)激酶、ATR (ATM-Rad3_Related，共济失调性毛细 血管扩张和 Rad3_ 相关性）激酶和 DNA-PKcs (catalytic sunbunit of the DNA-dependent protein kinase,正DNA-蛋白激酶），这些激酶磷酸化革巴蛋白从而介导修复，如果损伤不 能被修复则介导细胞发生凋亡。在这个过程中，MREll不仅是DNA损伤的感受器，更是修复 DNA的启动因子，还能修饰受损的DNA分子，在细胞周期检验点及DNA复制中都起重要作用。
[0003] MREll蛋白具有DNA结合、双链DNA3' -5'外切酶和单链DNA结构特异性内切酶 活性等功能，在MRN复合物的结构和功能中处于核心地位。当人类的Mrell基因发生突 变时，会导致共济失调性毛细血管扩张症样紊乱综合症（ataxia-telangiectasia-like disease，ATLD)，表现为发育迟缓、小脑退行性变、免疫缺陷和肿瘤易感等。由于MREll在维 持染色体稳定方面的重要作用，其与肿瘤的发生发展密切相关，已发现Mrell基因突变发 生于多种肿瘤中。约82%的大肠癌中具有MREll基因突变，研究发现一类称为PARP抑制剂 的新型药物可以对抗MREll基因突变型肿瘤。最新的研究还显示MREll基因突变可作为肌 肉浸润性膀胱癌（MIBC)放疗的不良预后因子。Mrell基因检测作为一个新的癌基因位点对 于乳腺癌的防治也具有重要意义。所以，临床上准确快速判断患者是否存在Mrell基因的 突变对于用药及防治策略选择具有重要意义。因此，开发一种检测Mrell基因热点突变的 产品，以实现高灵敏度、低成本、方便快捷的Mrell基因突变检测是非常有必要的。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种可以覆盖多突变位点检测，且快速、准确、高 灵敏度的MREll基因突变检测体系及其试剂盒。
[0005] 本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种MREll基因突变检测体 系，包括用于检测MRE11 A390G_1328C>G突变位点的正向检测引物MREIF和反向检测引物 MRE1R，以及用于检测MREll P631T_2050C>A突变位点或MREll R633Q_G2057G>A突变位点 的正向检测引物MRE23F和反向检测引物MRE23R ; 所述MRElF的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示； 所述MRElR的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示； 所述MRE23F的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示； 所述MRE23R的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。
[0006] 上述技术方案的一种优选是：上述MREll基因突变检测体系还包括阴性对照和阳 性对照； 所述阴性对照分别是针对检测MREll A390G_1328C>G突变位点的野生型对照一和针 对检测MREll P631T_2050C>A突变位点或MREll R633Q_G2057G>A突变位点的野生型对照 -* ? 所述阳性对照分别是针对检测MREll A390G_1328C>G突变位点的突变型对照一、针对 检测MREll P631T_2050C>A突变位点的突变型对照二和针对检测MREll R633Q_G2057G>A 突变位点的突变型对照三。
[0007] 上述技术方案的一种优选是：上述野生型对照一是以未突变基因组为模板，以 MRElF和MRElR为引物进行扩增，而获得的产物； 所述野生型对照二是以未突变基因组为模板，以MRE23F和MRE23R为引物进行扩增，而 获得的产物。
[0008] 上述技术方案的一种优选是：上述突变型对照一是以含MREll A390G_1328C>G突 变位点的基因组为模板，以MRElF和MRElMR为引物，以MRElMF和MRElR为引物，分两组进 行PCR扩增，再将获得的两组产物等量混合，以MRElF和MRElR为引物进行PCR扩增，再将 获得的产物，按体积比与野生型对照一进行混合，而获得的混合物； 所述突变型对照二是以含MREll P631T_2050C>A突变位点的基因组为模板，以MRE23F 和MRE2MR为引物，以MRE2MF和MRE23R为引物，分两组进行PCR扩增，再将获得的两组产物 等量混合，以MRE23F和MRE23R为引物进行PCR扩增，再将获得的产物，按体积比与野生型 对照二进行混合，而获得的混合物； 所述突变型对照三是以含MREll R633Q_G2057G>A突变位点的基因组为模板，以 MRE23F和MRE3MR为引物，以及MRE3MF和MRE23R为引物，分两组进行PCR扩增，再将获得的 两组产物等量混合，以MRE23F和MRE23R为引物进行PCR扩增，再将获得的产物，按体积比 与野生型对照二进行混合，而获得的混合物； 所述体积比的比值是1 : 9、1 : 99或1 : 999; 所述MRElMF是覆盖MREll A390G_1328C>G突变点碱基的正向检测引物，所述MRElMR 是覆盖MREll A390G_1328C>G突变点碱基的反向检测引物； 所述MRE2MF是覆盖MREll P631T_2050C>A突变点碱基的正向检测引物，所述MRE2MR 是覆盖MREll P631T_2050C>A突变点碱基的反向检测引物； 所述MRE3MF是覆盖MREll R633Q_G2057G>A突变点碱基的正向检测引物，所述MRE3MR 是覆盖MREll R633Q_G2057G>A突变点碱基的反向检测引物。
[0009] 上述技术方案的一种优选是：上述突变型对照一是以含MREll A390G_1328C>G未 突变位点的基因组为模板，以MRElF和MRElMR为引物，以MRElMF和MRElR为引物，分两组 进行PCR扩增，再将获得的两组产物等量混合，以MRElF和MRElR为引物进行PCR扩增，再 将获得的产物，按体积比与野生型对照一进行混合，而获得的混合物； 所述突变型对照二是以含MREll P631T_2050C>A未突变位点的基因组为模板，分别以 MRE23F和MRE2MR为引物，以MRE2MF和MRE23R为引物，分两组进行PCR扩增，再将获得的两 组产物等量混合，以MRE23F和MRE23R为引物进行PCR扩增，再将获得的产物，按体积比与 野生型对照二进行混合，而获得的混合物； 所述突变型对照三是以含MREll R633Q_G2057G>A未突变位点的基因组为模板，分别以 MRE23F和MRE3MR为引物，以MRE3MF和MRE23R为引物，分两组进行PCR扩增，再将获得的两 组产物等量混合，以MRE23F和MRE23R为引物进行PCR扩增，再将获得的产物，按体积比与 野生型对照二进行混合，而获得的混合物； 所述体积比的比值是1 : 9、1 : 99或1 : 999; 所述MRElMF是覆盖MREll A390G_1328C>G突变点碱基的正向检测引物，所述MRElMR 是覆盖MREll A390G_1328C>G突变点的碱基的反向检测引物； 所述MRE2MF是覆盖MREll P631T_2050C>A突变点碱基的正向检测引物，所述MRE2MR 是覆盖MREll P631T_2050C>A突变点碱基的反向检测引物； 所述MRE3MF是覆盖MREll R633Q_G2057G>A突变点碱基的正向检测引物，所述MRE3MR 是覆盖MREll R633Q_G2057G>A突变点碱基的反向检测引物。
[0010] 上述技术方案的一种优选是：上述MRElMF的核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示； 所述MRElMR的核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示； 所述MRE2MF的核苷酸序列如SEQ ID No. 7所示； 所述MRE2MR的核苷酸序列如SEQ ID No. 8所示； 所述MRE3MF的核苷酸序列如SEQ ID No. 9所示； 所述MRE3MR的核苷酸序列如SEQ ID No. 10所示。
[0011] 上述技术方案的一种优选是：上述PCR扩增产物经稀释最优浓度为25?30ng/ μ?〇
[0012] 上述技术方案的一种优选是：上述MREll基因突变检测体系，其特征在于：还包括 PCR反应液，所述PCR反应液由HRM Master Mix和MgCl2配置而成。
[0013] 为了保证检测结果的准确性和灵敏度，上述技术方案的一种优选是：上述体系的 体积为ιομ?; 所述用于检测MREll A390G_1328C>G突变位点的体系中的各组分及其用量是25mM的 MgCl2 为 L 2μ1，1〇μΜ 的 MRElF 为 0· 2μ1，1〇μΜ 的 MRElR 为 0· 2μ1，模板 DNA 为 5 ?10ng，HRM Master Mix为5μ1，其余是纯水； 所述用于检测MREll P631T_2050C>A突变位点或MREll R633Q_G2057G>A突变位点的 体系中的各组分及其用量是25mM的MgCl2为1. 2μ1，1〇μΜ的MRE23F为0. 2μ1，1〇μΜ的MRE23R 为(λ 2μ1，模板DNA为5?10ng，HRM Master Mix为5μ1，其余是纯水； 所述模板DNA是样品、阳性对照或阴性对照。
[0014] 本发明为解决上述技术问题提出的另一种技术方案是：一种采用上述检测体系的 MREll基因突变检测试剂盒。
[0015] 本发明具有积极的效果： (1)本发明的MREll基因突变检测体系及其试剂盒利用高分辨率熔解曲线法（HRM法)， 采用特异引物组合，制备了可靠性高，获取简便，适于规模化应用的野生型对照及突变型对 照作为阴性对照和阳性对照，能检出〇. 1%的突变，极大地提高了检出率。采用本发明的 MREll基因突变检测体系及其试剂盒，检测结果与传统测序结果的符合度为100%，灵敏度 更高。
[0016] (2)本发明的MREll基因突变检测体系及其试剂盒，检测过程闭管操作，检测时间 在1小时以内，方便快捷，且通量更高。
[0017] (3)本发明的MREll基因突变检测体系及其试剂盒能覆盖检测三种MREll基因的 热点突变，采用特异的引物组合及合适的Mg 2+浓度，使得检测结果无杂峰，具有高特异性。
[0018] (4)本发明的MREll基因突变检测体系及其试剂盒成本极低，每样品检测试剂耗 材成本控制在人民币8元左右。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1是以阴性对照为基线，以MRElF和MRElR为引物检测样本1的A390G_1328C>G 突变位点的差异视图。
[0020] 图2是以阴性对照为基线，以MRE23F和MRE23R为引物检测10%、1%及0. 1%的突 变对照二的差异视图。
【具体实施方式】
[0021] 下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用 于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可 以根据上述本
【发明内容】
对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意 表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验 方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实 验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所 有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或 均等的方法及材料皆可应用于本发明中。 实施例
[0022] 一、试剂盒的组成。
[0023] 本实施例的MREl 1基因突变检测试剂盒包括PCR反应液、引物混合液、突变型对照 液(阳性对照液)和野生型对照液(阴性对照液)。PCR反应液、引物混合液、突变型对照液和 野生型对照液分别置于不同的试管中，如表1所示。
[0024] 表1试剂盒组成表
【权利要求】
1. 一种MRE11基因突变检测体系，其特征在于：包括用于检测MRE11 A390G_1328C>G突 变位点的正向检测引物MREIF和反向检测引物MRE1R，以及用于检测MRE11 P631T_2050C>A 突变位点或MRE11 R633Q_G2057G>A突变位点的正向检测引物MRE23F和反向检测引物 MRE23R ； 所述MRE1F的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示； 所述MRE1R的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示； 所述MRE23F的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示； 所述MRE23R的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。
2. 根据权利要求1所述的MRE11基因突变检测体系，其特征在于：还包括阴性对照和 阳性对照； 所述阴性对照分别是针对检测MRE11 A390G_1328C>G突变位点的野生型对照一和针 对检测MRE11 P631T_2050C>A突变位点或MRE11 R633Q_G2057G>A突变位点的野生型对照 -* ? 所述阳性对照分别是针对检测MRE11 A390G_1328C>G突变位点的突变型对照一、针对 检测MRE11 P631T_2050C>A突变位点的突变型对照二和针对检测MRE11 R633Q_G2057G>A 突变位点的突变型对照三。
3. 根据权利要求2所述的MRE11基因突变检测体系，其特征在于： 所述野生型对照一是以未突变基因组为模板，以MRE1F和MRE1R为引物进行扩增，而获 得的产物； 所述野生型对照二是以未突变基因组为模板，以MRE23F和MRE23R为引物进行扩增，而 获得的产物。
4. 根据权利要求3所述的MRE11基因突变检测体系，其特征在于：所述突变型对照一 是以含MRE11 A390G_1328C>G突变位点的基因组为模板，以MRE1F和MRE1MR为引物，以 MRE1MF和MRE1R为引物，分两组进行PCR扩增，再将获得的两组产物等量混合，以MRE1F和 MRE1R为引物进行PCR扩增，再将获得的产物，按体积比与野生型对照一进行混合，而获得 的混合物； 所述突变型对照二是以含MRE11 P631T_2050C>A突变位点的基因组为模板，以MRE23F 和MRE2MR为引物，以MRE2MF和MRE23R为引物，分两组进行PCR扩增，再将获得的两组产物 等量混合，以MRE23F和MRE23R为引物进行PCR扩增，再将获得的产物，按体积比与野生型 对照二进行混合，而获得的混合物； 所述突变型对照三是以含MRE11 R633Q_G2057G>A突变位点的基因组为模板，以 MRE23F和MRE3MR为引物，以及MRE3MF和MRE23R为引物，分两组进行PCR扩增，再将获得的 两组产物等量混合，以MRE23F和MRE23R为引物进行PCR扩增，再将获得的产物，按体积比 与野生型对照二进行混合，而获得的混合物； 所述体积比的比值是1 : 9、1 : 99或1 : 999; 所述MRE1MF是覆盖MRE11 A390G_1328C>G突变点碱基的正向检测引物，所述MRE1MR 是覆盖MRE11 A390G_1328C>G突变点碱基的反向检测引物； 所述MRE2MF是覆盖MRE11 P631T_2050C>A突变点碱基的正向检测引物，所述MRE2MR 是覆盖MRE11 P631T_2050C>A突变点碱基的反向检测引物； 所述MRE3MF是覆盖MRE11 R633Q_G2057G>A突变点碱基的正向检测引物，所述MRE3MR 是覆盖MRE11 R633Q_G2057G>A突变点碱基的反向检测引物。
5. 根据权利要求3所述的MRE11基因突变检测体系，其特征在于：所述突变型对照一 是以含MRE11 A390G_1328C>G未突变位点的基因组为模板，以MRE1F和MRE1MR为引物，以 MRE1MF和MRE1R为引物，分两组进行PCR扩增，再将获得的两组产物等量混合，以MRE1F和 MRE1R为引物进行PCR扩增，再将获得的产物，按体积比与野生型对照一进行混合，而获得 的混合物； 所述突变型对照二是以含MRE11 P631T_2050C>A未突变位点的基因组为模板，分别以 MRE23F和MRE2MR为引物，以MRE2MF和MRE23R为引物，分两组进行PCR扩增，再将获得的两 组产物等量混合，以MRE23F和MRE23R为引物进行PCR扩增，再将获得的产物，按体积比与 野生型对照二进行混合，而获得的混合物； 所述突变型对照三是以含MRE11 R633Q_G2057G>A未突变位点的基因组为模板，分别以 MRE23F和MRE3MR为引物，以MRE3MF和MRE23R为引物，分两组进行PCR扩增，再将获得的两 组产物等量混合，以MRE23F和MRE23R为引物进行PCR扩增，再将获得的产物，按体积比与 野生型对照二进行混合，而获得的混合物； 所述体积比的比值是1 : 9、1 : 99或1 : 999; 所述MRE1MF是覆盖MRE11 A390G_1328C>G突变点碱基的正向检测引物，所述MRE1MR 是覆盖MRE11 A390G_1328C>G突变点的碱基的反向检测引物； 所述MRE2MF是覆盖MRE11 P631T_2050C>A突变点碱基的正向检测引物，所述MRE2MR 是覆盖MRE11 P631T_2050C>A突变点碱基的反向检测引物； 所述MRE3MF是覆盖MRE11 R633Q_G2057G>A突变点碱基的正向检测引物，所述MRE3MR 是覆盖MRE11 R633Q_G2057G>A突变点碱基的反向检测引物。
6. 根据权利要求4或5所述的MRE11基因突变检测体系，其特征在于：所述MRE1MF的 核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示； 所述MRE1MR的核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示； 所述MRE2MF的核苷酸序列如SEQ ID No. 7所示； 所述MRE2MR的核苷酸序列如SEQ ID No. 8所示； 所述MRE3MF的核苷酸序列如SEQ ID No. 9所示； 所述MRE3MR的核苷酸序列如SEQ ID No. 10所示。
7. 根据权利要求3至5之一所述的MRE11基因突变检测体系，其特征在于：所述PCR扩 增产物经稀释浓度达到25?30ng/^l。
8. 根据权利要求1或2所述的MRE11基因突变检测体系，其特征在于：还包括PCR反 应液，所述PCR反应液由HRM Master Mix和MgCl2配置而成。
9. 根据权利要求8所述的MRE11基因突变检测体系，其特征在于：所述体系的体积为 1〇μ1 ； 所述用于检测MRE11 A390G_1328C>G突变位点的体系中的各组分及其用量是25mM的 MgCl2 为 1. 2μ1，1〇μΜ 的 MRE1F 为 0· 2μ1，1〇μΜ 的 MRE1R 为 0· 2μ1，模板 DNA 为 5 ?10ng，HRM Master Mix为5μ1，其余是纯水； 所述用于检测MRE11 P631T_2050C>A突变位点或MRE11 R633Q_G2057G>A突变位点的 体系中的各组分及其用量是25mM的MgCl2为1. 2μ1，1〇μΜ的MRE23F为0. 2μ1，1〇μΜ的MRE23R 为(λ 2μ1，模板DNA为5?10ng，HRM Master Mix为5μ1，其余是纯水； 所述模板DNA是样品、阳性对照或阴性对照。
10. -种采用如权利要求1所述的检测体系的MRE11基因突变检测试剂盒。
【文档编号】C12Q1/68GK104293956SQ201410542661
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年10月15日 优先权日:2014年10月15日
【发明者】王明 申请人:上海赛安生物医药科技有限公司