长链金属硫蛋白基因mtt1的优化及植物表达载体构建的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种经密码子优化的嗜热四膜虫金属硫蛋白 MTT1 植物表达载体及其应用。该载体按照如下步骤的方法得到：在不改变氨基酸序列的前提下，按照芦苇偏爱密码子对嗜热四膜虫金属硫蛋白 MTT1 进行优化设计，综合考虑密码子使用频率，GC含量及mRNA二级结构等影响因素，使其利于在芦苇、烟草等植物中高效表达，并在基因序列两端预留 Nco I和 Eco RI酶切位点。然后用 Nco I和 Eco RI双酶切植物表达载体pCAMBIA-1302和金属硫蛋白基因 MTT1 两端 Nco I和 Eco RI酶切位点，回收植物表达载体片段和金属硫蛋白基因片段，经DNAT4连接酶将二者连接成金属硫蛋白植物表达载体。经将表达载体pCAMBIA-1302-MTT1转化农杆菌侵染烟草组培证实，原生生物金属硫蛋白可以在植物中表达。该载体还可以借助根瘤农杆菌转化芦苇及其他植物，获得具有清除环境中有毒有害重金属离子的植株。
【专利说明】长链金属硫蛋白基因MTT1的优化及植物表达载体构建
【技术领域】
[0001] 本发明设计合成了一种适合在芦苇中表达的长链金属硫蛋白基因，以便克隆到植 物表达载体，转化芦苇得到芦苇植株后，可以用该芦苇植株清除环境中的重金属离子。
【背景技术】
[0002] 重金属是存在于环境中最丰富和最持久的无机污染物，它们能够通过食物链的生 物积累逐步将毒害放大，而却不能像有机污染物那样被微生物降解。几乎所有的重金属，尤 其是那些不属于生物体组成成分的重金属，都能对生物体产生毒害作用，并能够干扰生态 平衡。这些重金属离子在生物体内通过产生氧化剂的方式，直接或间接地强烈破坏蛋白质、 DNA和细胞脂类，从而导致细胞坏死或凋亡。
[0003] 由于金属离子和细胞之间的相互作用机制不同，因此真核细胞和原核细胞存在 不同的金属离子拮抗机制。微生物和高等真核生物体内六大基本重金属拮抗机制之一就 是通过具有鳌和能力的蛋白或多肽来清除胞内金属离子(实质上就是有毒物质的生物积 累），或者是通过其他分子(如多聚磷酸盐）阻止金属离子与细胞敏感靶位发生相互作用。 通常来说，在生物细胞内有两类具有鳌和重金属能力的多肽：a)生物体通过酶解方法合 成的小分子化合物，例如谷胱甘肽或植物螯合素；b)由基因编码的蛋白，例如金属硫蛋白 (metallothionein，MTs)，其带有众多来自半胱氨酸的巯基，这些巯基能够形成鳌和重金属 离子的反应基团。
[0004] 金属硫蛋白（MTs)是细胞胞内金属结合蛋白超家族中的一员，存在于几乎所有生 物体中，有较低的分子量（〈7000Da)，分子内缺少芳香族氨基酸或组氨酸，并且能够通过半 胱氨酸残基鳌合Zn、Cu或Cd等金属离子以达到解毒的目的。在哺乳动物体内MTs维持铜 离子的动态平衡和清除自由基。金属硫蛋白根据物种种类被分为15个家族，四膜虫金属硫 蛋白属于第7亚家族。
[0005] 嗜热四膜虫是第一个完成全基因组测序的纤毛类原生动物。目前，从嗜热四膜虫 全基因组数据库分析发现其有5种金属硫蛋白：#777、#m#7TJ、#77￥和#77^。这5种金 属硫蛋白肽链长度、半胱氨酸数目及结合重金属离子的数目均普遍高于哺乳动物金属硫蛋 白及植物金属硫蛋白，王清路等研究发现最长肽链的MTT1蛋白对有毒重金属有高度的螯 合能力以达到解毒的目的。
[0006] 因此，我们决定采用具有污水、污染物和重金属处理能力的芦苇或其它植物表达 金属硫蛋白#777来净化环境中的重金属离子。因为在这些植物中过表达MTT1蛋白可以提 高植物处理重金属离子的能力，而要想在植物中过表达#777基因就必须构建一个#777植 物表达质粒并能够使其在植物中表达或过表达。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种含有嗜热四膜虫金属硫蛋白#777基因的重组植物表 达载体；提供一种按照芦苇偏爱密码子优化的金属硫蛋白基因；以及该植物表达载体 在芦苇清除环境重金属离子中的应用。
[0008] 本发明提供的一种金属硫蛋白#777基因的重组植物表达载体，包括如下构建步 骤：（1)利用芦苇偏爱密码子表合成能在芦苇中高效表达的嗜热四膜虫金属硫蛋白基因 (#777 );基因的5'-端添加AfcoI酶切位点，3'-端添加feoRI酶切位点。原始#777基 因的核苷酸序列为SEQIDNo. 1，优化后的#777基因的核苷酸序列为SEQIDNo. 2,测序结 果见图1 ; (2)#777基因被合成后克隆至pGH载体上，然后转化到大肠杆菌DH5a。本实验室大量 繁殖大肠杆菌DH5a/pGH-MTTl，而后提取质粒pGH-MTTl;植物表达载体pCAMBIA-1302也经 过转化大肠杆菌DH5a后，繁殖大肠杆菌DH5a/PCAMBIA-1302,提取质粒pCAMBIA-1302 ; 具体过程如下： a、从-80°C冰箱取出200ul感受态DH5a菌体，掌心使其融化后加入pT/pBI121，冰浴 30min，42°C热休克90sec，迅速放回冰上冷却2min，加1000ulLB液体培养基，在37°C， 恒温摇床中180rpm震荡培养40min。将转化后振荡培养的菌液6000rpm离心2min,在 超净台中弃掉部分上清，留下约300ul培养基，将菌体沉淀吹打起来后，均匀涂布在预先涂 有抗生素（DH5a/pGH-MTTl100ug/mlAmp;DH5a/pCAMBIA-1302 30ug/mlAmp)的LB固 体培养基上，37°C恒温培养箱培养12h(先正面放30-60min，而后倒置)。
[0009]b、挑取白色单菌落，转接种于5mlLB液体培养基中（DH5a/pGH-MTTl100ug/ mlAmp;DH5a/pCAMBIA-1302 30ug/mlAmp)，37°C，180rpm振荡培养过夜。质粒提取使 用Biomiga生物技术公司的"BiomigaEZgene?PlasmidMiniprepKit"。
[0010] A)室温下lOOOOrpm离心1min,收集菌体，并尽可能吸去上清，加入250ii1Buffer A1 (确保已加入RNaseA)，用移液枪或涡旋震荡充分悬浮细菌细胞； B) 加入250illBufferB1，轻轻的翻转10次以混合均匀，然后静置5min至溶液粘稠 而澄清； C) 加入350ylBufferN1，立即翻转多次至溶液充分混匀，此时出现白色絮状沉淀； D) 将离心管转至高速离心机，在室温下13000rpm离心10min; E) 小心吸取离心后的上清液至带有收集管的DNA柱中，室温下13000rpm离心1min, 倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中； 卩）向离心柱中加入5001110嫩13811131^€61<确保已加入无水乙醇)，室温下13000印111 离心1min，倒掉收集管中的废液，将离心管重新放回收集管中，重复此步骤； G) 将离心柱放回高速离心机中，13000rpm室温下开盖离心2min，以彻底去除残留的乙 醇； H) 将离心柱转至一个新的1. 5ml离心管中，向DNA柱的正中间加入5(Tl00ii1的ddH20 或ElutionBuffer,室温放置2min, 13000rpm离心1min,洗脱质粒DNA，直接应用或冻 于-20°C。
[0011] (3)表达质粒pCAMBIA-1302 -MTT1 的构建 a、用AfcoI和feoRI双酶切含有#777基因的pGH-MTTl载体及植物表达载体pCAMBIA-1302,酶切反应体系为：
【权利要求】
1. 一种长链金属硫蛋白植物表达载体，包括按照芦苇偏爱密码子优化合成的，适合在 芦苇中表达的嗜热四膜虫金属硫蛋白#777基因，及该基因与植物表达载体pCAMBIA-1302 构建而成的表达质粒pCAMBIA-1302-MTTl，其特征在于，所需载体包含： 按照芦苇偏爱密码子优化合成的长链嗜热四膜虫金属硫蛋白#777核苷酸序列为SEQ ID No. 2,测序结果见图1 #777基因连接在表达质粒pCAMBIA-1302上。
2. 如权利1要求一种金属硫蛋白植物表达载体pCAMBIA-1302-MTTl，以清除环境中有 毒有害重金属离子而设计的表达载体。
3. -种以在芦苇中表达为目的而设计的金属硫蛋白表达载体。
4. 如权利要求1、2及3所述的重组#777植物表达载体的构建及可用性验证方法，其特 征在于，包括如下步骤： (1) 利用芦苇偏爱密码子表合成能在芦苇中高效表达的嗜热四膜虫金属硫蛋白基因 (#777 );基因的5'-端添加Afco I酶切位点，3'-端添加feoR I酶切位点； (2) 基因合成后被克隆至pGH载体上； (3) 用Afco I和feoR I双酶切含有#777基因的pGH载体及植物表达载体 pCAMBIA-1302,回收#777基因片段和pCAMBIA-1302载体片段，将二者用DNA T4连接酶连 接,得到表达质粒pCAMBIA-1302-MTTl ; (4) 质粒pCAMBIA-1302-MTTl转化根瘤农杆菌LBA4404,获得带有#777基因的根瘤农 杆菌； (5) 农杆菌侵染烟草NC89获得转#777基因烟草。
【文档编号】C12N15/66GK104342451SQ201410544335
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2014年10月15日 优先权日:2014年10月15日
【发明者】王清路, 张 杰, 周彩霞, 刘悦, 窦烨 申请人:王清路