一种肉苁蓉多肽提取物、制备方法及其用途
【专利摘要】本发明提供了一种从肉苁蓉中提取肉苁蓉多肽提取物的方法，及其由此方法获得的肉苁蓉多肽提取物和该肉苁蓉多肽提取物的用途。本发明利用肉苁蓉渣，经烘干粉碎，再经过碱溶酸沉法处理、酶解、超滤纯化，最终得到的分子量为500-10000道尔顿的肉苁蓉多肽，并对肉苁蓉多肽治疗癌症及癌症化疗引起的腹泻的功效进行研究。本发明提高了珍稀濒危药材肉从蓉的利用率，使其产生更高的经济价值，同时为广大肿瘤患者提供了一种高效低毒、价格低廉，易于推广的可用于减轻癌症化疗相关性腹泻并起化疗增效作用的药物。
【专利说明】一种肉苁蓉多肽提取物、制备方法及其用途
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药【技术领域】，具体涉及一种从肉苁蓉中提取肉苁蓉多肽提取物的方 法，及其由此方法获得的肉苁蓉多肽提取物和该肉苁蓉多肽提取物的用途。
【背景技术】
[0002] 肉灰蓉（Cistanche deserticola Y. C. Ma)是列当科（Orobanchaeceae)肉灰蓉 属（Cistanche)植物肉灰蓉干燥带鳞叶的肉质莖，叉名精舆、纵蓉、肉松蓉、地精、大芸，有 "沙漠人参"之美誉，始记载于《神农本草经》，列为上品，是常用中药之一，具有补肾壮阳、填 精补髓、养血润燥、悦色延年等功效。本属植物全球约18个种，我国约4个种1个变种，分 别为肉苁蓉、盐生肉苁蓉、管花肉苁蓉、白花盐肉苁蓉及沙苁蓉，除沙苁蓉外，其他4种主产 于我国西北各省区。
[0003] 20世纪80年代初日本学者开始研究肉苁蓉的化学成分。到20世纪80年代后 期，国内学者开始研究我国产出的肉苁蓉的化学成分。随着提取分离和检测技术的飞速发 展，已分离得到苯乙醇苷类、环烯醚萜类、挥发性成分、木脂素类、多糖、生物碱等多种化学 成分。
[0004] 现代药理学研究也证明肉苁蓉除具有补肾壮阳、润肠通便作用外，还具有抗衰老 的作用，并且没有发现不良反应。近年来肉苁蓉广泛应用于各类药品及保健品中。
[0005] 肉从蓉传统的初加工方法有晾晒法、盐渍法、窖藏法等，这些方法费工费时，受自 然条件的影响，且质量不稳定，严重影响药材的利用率及疗效；并且，传统的初加工方法己 远远不能满足产地大量药材初加工的需要。因此，如何提高珍稀濒危药材肉从蓉的利用率， 使其产生更高的经济价值，是巫待解决的关键问题。
[0006] 中国专利CN102349650A公开了 一种提高肉苁蓉有效成分溶出率的方法，该发明 主要通过新鲜的肉苁蓉经过快速清洗，然后切分、柠檬酸液浸泡、微波灭酶后，加入淀粉酶 和果胶酶进行酶解，然后加入助滤剂，对酶解液进行分离。该专利解决的技术问题是提高出 汁率，使出汁率由54%提高到65%，从而提高了肉苁蓉有效成分的溶出率，该专利没有给出 本发明肉苁蓉多肽及其制备方法的技术启示。
[0007] 本专利采用塔克拉玛干沙漠优质肉苁蓉为原料，对其鲜药材进行剥皮处理，所得 的肉苁蓉皮进行干燥再采用乙醇进行提取，可以得到传统的化学成分；对果肉采用榨汁机 进行榨汁，得到水提取物；对榨汁后所得到的肉苁蓉渣进行烘干处理，粉碎成粉，再经过碱 溶酸沉法处理、酶解、超滤纯化，最终得到的分子量为500-10000道尔顿的多肽，并进行治 疗癌症及癌症化疗引起的腹泻功效的研究，以及与中国专利CN103585546A公开的中药组 合物配伍使用的研究。
[0008] 目前癌症已成为人类面临的一大杀手，死亡率仅次于心血管疾病，而且呈逐年上 升的趋势。肿瘤患者进行化疗，虽然有一定的疗效，但化疗后大部分患者会出现不同程度的 副作用，其中化疗药单用或联合用均会引起患者腹泻等毒副反应，肿瘤化疗后腹泻又叫化 疗相关性腹泻。近年来随着化疗药物如5-氟尿嘧啶、紫杉烷类、羟基喜树碱、伊立替康、希 罗达等的面世及推广应用，化疗相关性腹泻的发生率逐年提高，而且若不进行积极治疗，易 导致患者脱水、营养不良、血清电解质紊乱、酸碱平衡失调等，不仅对机体的康复带来极大 的不利，也给周期性化疗带来一定的困难，因此对化疗相关性腹泻的有效治疗已成为肿瘤 患者整体治疗的重要组成部分。
[0009]目前尚无对抗癌症化疗具有减轻腹泻及增效作用的中成药，中国专利 CN103585546A公开的中药组合物在治疗癌症化疗引起的腹泻的作用机理不明确，药效不明 显，因此在此中药组合物的辅助下，研发一种高效低毒、价格低廉，易于推广的可用于减轻 癌症化疗相关性腹泻并起化疗增效作用的药物组合物显得尤其重要。
【发明内容】
[0010]为了解决现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供肉苁蓉多肽提取物、制 备方法及其用途。本发明提供的一种从肉苁蓉粉中制备肉苁蓉多肽提取物的方法，包括以 下步骤： (1) 往肉苁蓉粉加入NaOH溶液至pH值为8-10,在45-55°C下浸提时间40-60min，然后 离心处理，即得肉苁蓉蛋白； (2) 使用步骤（1)得到的肉苁蓉蛋白配置底物浓度5-9%的肉苁蓉蛋白反应体系，调节 肉苁蓉蛋白反应体系的pH值至6. 0-7. 0,控制温度60-70°C，加入酶底比3. 0-4. 0%的酶解 蛋白酶，恒温搅拌酶解，酶解时间为3. 0-4. 0h，即得酶解液，所述的酶解蛋白酶为碱性蛋白 酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、果胶酶和淀粉酶中的至少一种； (3) 对步骤（2)得到的酶解液进行12-17min的煮沸灭酶处理，冷却后使用2 mol/L的 HCL溶液调至pH值至中性，然后离心除去沉淀，取上清液，上清液含有肉苁蓉蛋白肽； (4) 将步骤（3)所得到的含有肉苁蓉蛋白肽的上清液，在温度为40-50°C，pH值 为7.0-9. 0,压力为0.7-0. 9MPa下，选择500Da和IOOOODa的超滤膜对肉苁蓉蛋白肽中 500-10000Da分子量的肉苁蓉多肽进行分离，获得分离液，60°C下浓缩得到相对密度为 1. 20的浸膏，即为肉苁蓉多肽提取物。
[0011] 进一步地，本发明提高了一种最优的从肉苁蓉粉中制备肉苁蓉多肽提取物的方 法，包含以下步骤： (1) 往肉苁蓉粉加入NaOH溶液至pH值为9,在50°C下浸提时间50min，然后离心处理， 即得肉苁蓉蛋白； (2) 使用步骤（1)得到的肉苁蓉蛋白配置底物浓度7%的肉苁蓉蛋白反应体系，调节肉 苁蓉蛋白反应体系的pH值至6. 5,控制温度65°C，加入酶底比3. 5%的酶解蛋白酶，恒温搅 拌酶解，酶解时间为3. 5h，即得酶解液，所述的酶解蛋白酶为木瓜蛋白酶； (3) 对步骤（2)得到的酶解液进行15min的煮沸灭酶处理，冷却后使用2 mol/L的HCL 溶液调至pH值至中性，然后离心除去沉淀，取上清液，上清液含有肉苁蓉蛋白肽； (4) 将步骤（3)所得到的含有肉苁蓉蛋白肽的上清液，在温度为45°C，pH值为8. 0,压 力为0. 8MPa下，选择500Da和IOOOODa的超滤膜对肉苁蓉蛋白肽中500-10000Da分子量的 肉苁蓉多肽进行分离，获得分离液，60°C下浓缩得到相对密度为1.20的浸膏，即为肉苁蓉 多肽提取物。
[0012] 经过检测，上述方法获得的肉苁蓉多肽提取中的活性多肽的含量为99%，活性多肽 的分子量范围在500-10000道尔顿之间。
[0013] 本发明的第二个目的是提供一种按照上述方法从肉苁蓉粉获得的肉苁蓉多肽提 取物，肉苁蓉多肽提取物中含有肉苁蓉多肽99%，并且肉苁蓉多肽的分子量在500-10000 道尔顿之间。
[0014] 本发明的第三个目的在于提供肉苁蓉多肽提取物在用于制备治疗癌症药物中的 用途。
[0015] 本发明的第四个目的在于提供肉苁蓉多肽提取物在用于制备治疗癌症化疗引起 的腹泻的药物中的用途。
[0016] 进一步的，所述的药物为由如下重量份的原料组成的组合物：肉苁蓉多肽提取物 5-16份、山楂7-9份、红曲5-8份、莱菔子6-14份、黄连3-9份、绞股蓝5-9份、桂花5-12 份、三七5-14份、丹参8-12份、黄芪9-15份、砂仁6-14份、黄芩4-6份、飞仙藤6-12份、蔷 薇根5-12份、干姜5-9份和荜拔6-10份。
[0017] 再进一步的，所述的药物的制备方法包含下述步骤：取处方量的上述药材碎成细 粉，肉苁蓉多肽提取物除外，按照粗粉总重量的5-8倍加入体积浓度为75-90%的乙醇溶液， 回流提取三次，回流时间为2-4h，过滤，所得的滤液中加入肉苁蓉水提取物，60°C下浓缩得 到相对密度为1. 20的浸膏，即得到本发明药物浸膏。
[0018] 再进一步的，所述的药物为散剂、水剂、片剂或胶囊剂。
[0019] 总之，本发明与现有技术相比，具有如下突出的技术优势： (1)本发明采用肉苁蓉为原料，对其鲜药材进行剥皮处理，所得的肉苁蓉皮进行干燥 再采用乙醇进行提取，可以得到传统的化学成分；对果肉采用榨汁机进行榨汁，得到水提取 物；对榨汁后所得到的肉苁蓉渣进行烘干处理，粉碎成粉，再经过碱溶酸沉法处理、酶解、超 滤纯化，最终得到的分子量为500-10000道尔顿的多肽，制备得到了有重大的药物价值的 肉苁蓉多肽提取物，提高了珍稀濒危药材肉从蓉的利用率，使其产生更高的经济价值。
[0020] (2)本发明采用酶解法制备生物活性肽，并仿效人体消化道内的正常消化条件将 肉苁蓉蛋白切割成特定的水解片段，条件温和，较无机酸、碱水解有较大的优势，避免了水 解过程中的环境污染问题。
[0021] (3)本发明利用超滤手段定向收集500-10000道尔顿内的多肽片段，并使所得多 肽组合物中该分子量范围内的多肽纯度高达99%，且工艺稳定，重现性高。
[0022] (4)本发明还通过药效实验证明本发明肉苁蓉多肽提取物和本发明药物可以显著 抑制癌细胞的生长，表明本发明的药物对癌症有显著的治疗作用。并且肉苁蓉多肽提取物 和相应的药物用于癌症以及癌症化疗引起的腹泻的治疗时疗效确切，不良反应和副作用均 明显降低，其与现有治疗癌症化疗引起的腹泻的中药在止泻方面具有显著的协同作用，并 且可以大幅度减少癌症化疗引发的腹泻症状，提高癌症病人对于化疗的接受度和用药依从 性。
【具体实施方式】
[0023] 以下通过具体实施例进一步描述本发明，但本发明不仅仅限于以下实施例。在本 发明的范围内或者在不脱离本发明的内容、精神和范围内，对本发明所述的肉苁蓉多肽提 取物、制备方法和用途仅仅进行名称上的变更、替换，对于本领域技术人员来说是显而易见 的，它们都被视为包括在本发明范围之内。
[0024] 第一部分、肉苁蓉多肽提取物的制备 实施例1、一种从肉苁蓉粉中制备肉苁蓉多肽提取物的方法： (1) 往肉苁蓉粉加入NaOH溶液至pH值为10,在45°C下浸提时间60min，然后离心处理， 即得肉苁蓉蛋白； (2) 使用步骤（1)得到的肉苁蓉蛋白配置底物浓度5%的肉苁蓉蛋白反应体系，调节肉 苁蓉蛋白反应体系的pH值至6. 0,控制温度70°C，加入酶底比4. 0%的酶解蛋白酶，恒温搅 拌酶解，酶解时间为4. 0h，即得酶解液，所述的酶解蛋白酶为木瓜蛋白酶； (3) 对步骤（2)得到的酶解液进行17min的煮沸灭酶处理，冷却后使用2 mol/L的HCL 溶液调至pH值至中性，然后离心除去沉淀，取上清液，上清液含有肉苁蓉蛋白肽； (4) 将步骤（3)所得到的含有肉苁蓉蛋白肽的上清液，在温度为40°C，pH值为7. 0,压 力为0. 7MPa下，选择500Da和IOOOODa的超滤膜对肉苁蓉蛋白肽中500-10000Da分子量的 肉苁蓉多肽进行分离，获得分离液，60°C下浓缩得到相对密度为1.20的浸膏，即为肉苁蓉 多肽提取物。
[0025] 经过检测，上述方法获得的肉苁蓉多肽提取物中的活性多肽的含量为92%。
[0026] 实施例2、一种从肉苁蓉粉中制备肉苁蓉多肽提取物的方法： (1) 往肉苁蓉粉加入NaOH溶液至pH值为8,在55°C下浸提时间40min，然后离心处理， 即得肉苁蓉蛋白； (2) 使用步骤（1)得到的肉苁蓉蛋白配置底物浓度9%的肉苁蓉蛋白反应体系，调节肉 苁蓉蛋白反应体系的pH值至7. 0,控制温度60°C，加入酶底比3. 0%的酶解蛋白酶，恒温搅 拌酶解，酶解时间为3. 0h，即得酶解液，所述的酶解蛋白酶为木瓜蛋白酶； (3) 对步骤（2)得到的酶解液进行15min的煮沸灭酶处理，冷却后使用2 mol/L的HCL 溶液调至pH值至中性，然后离心除去沉淀，取上清液，上清液含有肉苁蓉蛋白肽； (4) 将步骤（3)所得到的含有肉苁蓉蛋白肽的上清液，在温度为50°C，pH值为9. 0,压 力为0. 9MPa下，选择500Da和IOOOODa的超滤膜对肉苁蓉蛋白肽中500-10000Da分子量的 肉苁蓉多肽进行分离，获得分离液，60°C下浓缩得到相对密度为1.20的浸膏，即为肉苁蓉 多肽提取物。
[0027] 经过检测，上述方法获得的肉苁蓉多肽提取物中的活性多肽的含量在93%。
[0028] 实施例3、一种从肉苁蓉粉中制备肉苁蓉多肽提取物的方法： (1) 往肉苁蓉粉加入NaOH溶液至pH值为9,在50°C下浸提时间50min，然后离心处理， 即得肉苁蓉蛋白； (2) 使用步骤（1)得到的肉苁蓉蛋白配置底物浓度7%的肉苁蓉蛋白反应体系，调节肉 苁蓉蛋白反应体系的pH值至6. 5,控制温度65°C，加入酶底比3. 5%的酶解蛋白酶，恒温搅 拌酶解，酶解时间为3. 5h，即得酶解液，所述的酶解蛋白酶为木瓜蛋白酶； (3) 对步骤（2)得到的酶解液进行15min的煮沸灭酶处理，冷却后使用2 mol/L的HCL 溶液调至pH值至中性，然后离心除去沉淀，取上清液，上清液含有肉苁蓉蛋白肽； (4) 将步骤（3)所得到的含有肉苁蓉蛋白肽的上清液，在温度为45°C，pH值为8. 0,压 力为0. 8MPa下，选择500Da和IOOOODa的超滤膜对肉苁蓉蛋白肽中500-10000Da分子量的 肉苁蓉多肽进行分离，获得分离液，60°C下浓缩得到相对密度为1.20的浸膏，即为肉苁蓉 多肽提取物。
[0029] 经过检测，上述方法获得的肉苁蓉多肽提取物中的活性多肽的含量在99%。
[0030] 第二部分、本发明含有肉苁蓉多肽提取物的药物制剂 实施例4、本发明药物及制备工艺： 药物组分的重量份：肉苁蓉多肽提取物5份、山楂7份、红曲5份、莱菔子6份、黄连3 份、绞股蓝5份、桂花5份、三七5份、丹参8份、黄苗9份、砂仁6份、黄苳4份、飞仙藤6份、 蔷薇根5份、干姜5份和荜拔6份。取处方量的上述药材碎成细粉，肉苁蓉多肽提取物除外， 按照粗粉总重量的5倍加入体积浓度为75%的乙醇溶液，回流提取三次，回流时间为3h，过 滤，所得的滤液中加入肉苁蓉水提取物，60°C下浓缩得到相对密度为1.20的浸膏，即得到 本发明药物浸膏。通过本领域常用制剂制备工艺可制备得到临床上常用中药药物剂型，如 片剂或胶囊剂。
[0031] 实施例5、本发明药物及制备工艺： 药物组分的重量份：肉苁蓉多肽提取物16份、山楂9份、红曲8份、莱菔子14份、黄连 9份、绞股蓝9份、桂花12份、三七14份、丹参12份、黄芪15份、砂仁14份、黄芩6份、飞仙 藤12份、蔷薇根12份、干姜9份和荜拔10份。取处方量的上述药材碎成细粉，肉苁蓉多肽 提取物除外，按照粗粉总重量的7倍加入体积浓度为90%的乙醇溶液，回流提取三次，回流 时间为2h，过滤，所得的滤液中加入肉苁蓉水提取物，60°C下浓缩得到相对密度为1. 20的 浸膏，即得到本发明药物浸膏。通过本领域常用制剂制备工艺可制备得到临床上常用中药 药物剂型，如片剂或胶囊剂。
[0032] 对比例一、一种治疗癌症化疗引起的腹泻的中药组合物及制备工艺： 选取CN103585546A中药组合物在制备治疗癌症化疗引起的腹泻药物中的用途的实施 例6。
[0033] 第三部分、本发明肉苁蓉多肽提取物的药效学研究 实施例6、本发明药物对S180荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用 1、造模：选取雄性SPF级KM小鼠为实验对象，体重为20-24g，12小时光照/12小时黑 暗，自由摄取饲料和水。除正常组外，取接种7天的S180腹水小鼠，无菌条件下抽取腹水， 用生理盐水调整细胞浓度至5 X IO6Ail。将S180细胞悬液以0. 2ml/只接种在小鼠右前肢 腋部皮下。
[0034] 2、动物分组及给药 接种24小时后，将小鼠分别随机分为5组，每组10只，分别给予下述治疗药物： 对照组：生理盐水 本发明实施例3制得的肉苁蓉多肽提取物：20 mg/kg 本发明实施例4药物组：50 mg/kg 本发明实施例5药物组：50 mg/kg 上述各药物均为腹腔注射给药，每天1次，连续10天。末次给药24小时后，处死小鼠， 剥取瘤块称重，计算每组平均值，计算抑瘤率，抑瘤率=(对照组瘤重-给药组瘤重）/对照 组瘤重X 100%。
[0035] 表1各药物组合物抗肿瘤药物对腹水瘤S180体内抑制实验
【权利要求】
1. 一种从肉苁蓉粉中制备肉苁蓉多肽提取物的方法，其特征在于，包含以下步骤： (1) 往肉苁蓉粉加入NaOH溶液至pH值为8-10,在45-55°C下浸提时间40-60min，然后 离心处理，即得肉苁蓉蛋白； (2) 使用步骤（1)得到的肉苁蓉蛋白配置底物浓度5-9%的肉苁蓉蛋白反应体系，调节 肉苁蓉蛋白反应体系的pH值至6. 0-7. 0,控制温度60-70°C，加入酶底比3. 0-4. 0%的酶解 蛋白酶，恒温搅拌酶解，酶解时间为3. 0-4. 0h，即得酶解液，所述的酶解蛋白酶为碱性蛋白 酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、果胶酶和淀粉酶中的至少一种； (3) 对步骤（2)得到的酶解液进行12-17min的煮沸灭酶处理，冷却后使用2 mol/L的 HCL溶液调至pH值至中性，然后离心除去沉淀，取上清液，上清液含有肉苁蓉蛋白肽； (4) 将步骤（3)所得到的含有肉苁蓉蛋白肽的上清液，在温度为40-50°C，pH值 为7. 0-9. 0,压力为0. 7-0. 9MPa下，选择500Da和lOOOODa的超滤膜对肉苁蓉蛋白肽中 500-10000Da分子量的肉苁蓉多肽进行分离，获得分离液，60°C下浓缩得到相对密度为 1. 20的浸膏，即为肉苁蓉多肽提取物。
2. 如权利要求1所述的一种从肉苁蓉粉中制备肉苁蓉多肽提取物的方法，其特征在 于，包含以下步骤： (1) 往肉苁蓉粉加入NaOH溶液至pH值为9,在50°C下浸提时间50min，然后离心处理， 即得肉苁蓉蛋白； (2) 使用步骤（1)得到的肉苁蓉蛋白配置底物浓度7%的肉苁蓉蛋白反应体系，调节肉 苁蓉蛋白反应体系的pH值至6. 5,控制温度65°C，加入酶底比3. 5%的酶解蛋白酶，恒温搅 拌酶解，酶解时间为3. 5h，即得酶解液，所述的酶解蛋白酶为木瓜蛋白酶； (3) 对步骤（2)得到的酶解液进行15min的煮沸灭酶处理，冷却后使用2 mol/L的HCL 溶液调至pH值至中性，然后离心除去沉淀，取上清液，上清液含有肉苁蓉蛋白肽； (4) 将步骤（3)所得到的含有肉苁蓉蛋白肽的上清液，在温度为45°C，pH值为8. 0,压 力为0. 8MPa下，选择500Da和lOOOODa的超滤膜对肉苁蓉蛋白肽中500-10000Da分子量的 肉苁蓉多肽进行分离，获得分离液，60°C下浓缩得到相对密度为1.20的浸膏，即为肉苁蓉 多肽提取物。
3. -种用权利要求1或2所述的方法制备的肉苁蓉多肽提取物。
4. 如权利要求3所述的肉苁蓉多肽提取物，其特征在于，所述的肉苁蓉多肽提取物中 含有肉苁蓉多肽99%，肉苁蓉多肽的分子量为500-10000Da。
5. 如权利要求3所述的肉苁蓉多肽提取物在用于制备治疗癌症药物中的用途。
6. 如权利要求3所述的肉苁蓉多肽提取物在用于制备治疗癌症化疗引起的腹泻的药 物中的用途。
7. 如权利要求5或6任一所述的用途，其特征在于，所述药物为由如下重量份的原料组 成的组合物：肉苁蓉多肽提取物5-16份、山楂7-9份、红曲5-8份、莱菔子6-14份、黄连3-9 份、绞股蓝5-9份、桂花5-12份、三七5-14份、丹参8-12份、黄芪9-15份、砂仁6-14份、黄 苳4-6份、飞仙藤6-12份、蔷薇根5-12份、干姜5-9份和荜拔6-10份。
8. 如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述药物的制备方法包含下述步骤：取处方 量的上述药材碎成细粉，肉苁蓉多肽提取物除外，按照粗粉总重量的5-8倍加入体积浓度 为75-90%的乙醇溶液，回流提取三次，回流时间为2-4h，过滤，所得的滤液中加入肉苁蓉水 提取物，60°C下浓缩得到相对密度为1. 20的浸膏，即得到本发明药物浸膏。
9.如权利要求7或8任一所述的用途，其特征在于，所述的药物为散剂、水剂、片剂或胶 囊剂。
【文档编号】C12P21/06GK104263790SQ201410548997
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年10月17日 优先权日:2014年10月17日
【发明者】孙喜翠 申请人:北京京隆卓尚投资有限公司