一种灵芝菌固体发酵提取物的制备方法
【专利摘要】本发明提供一种灵芝菌固体发酵提取物的制备方法，属于天然药物制备领域，该方法利用提取三七总皂苷后的三七残渣、榨糖后的甘蔗渣、米糠等为培养基质，对灵芝菌种进行新型双向型固体发酵，该方法与传统的人工栽培和深层液体发酵方法相比，其优点在于生产周期短、发酵产物灵芝多糖含量≥50%，工艺简单，利于产业化，该发酵产物可作为功能性保健食品的原料。
【专利说明】一种灵芝菌固体发酵提取物的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于天然药物制备领域，具体涉及一种灵芝菌固体发酵提取物的制备方 法。
【背景技术】
[0002] 灵芝（Ganoderma Iucidum)，属于担子菌类多孔菌科赤芝或紫芝的干燥子实体，是 一种大型真菌，有"仙草"、"瑞草"之称。对人体具有双向调节作用，所治病种，涉及心脑血 管、消化、神经、内分泌、呼吸、运动等各个系统，灵芝对神经系统有抑制作用，对循环系统有 降压和加强心脏收缩力的作用，对呼吸系统有祛痰作用。此外，还有护肝、提高免疫功能，抗 菌等作用，尤其对肿瘤、肝脏病变、失眠以及衰老的防治作用十分显著。
[0003] 灵芝多糖是灵芝的主要生物活性成分，灵芝多糖存在于天然灵芝子实体和菌丝体 中，灵芝多糖具有抗肿瘤、抗氧自由基、抗衰老、提高免疫力、活血化瘀等生物活性。由于天 然子实体生产周期长，受气候影响大，产量及质量不稳定，且子实体木质化程度高，多糖提 取利用率较低。采用生物发酵技术产菌丝体，周期短、成本低、产量大，且具有工业化生产前 旦 -5^ 〇
[0004] 药用植物与药用真菌的共发酵，可综合二者的优势，可能发现新的天然药物和新 的药理活性物质，开发共发酵技术是中药和天然药物创新的方向。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种灵芝菌固体发酵提取物的制 备方法，该方法在制备过程中，培养小环境为装有提取三七总皂苷后的三七残渣、榨糖后的 甘蔗渣等培养基质的低压聚乙烯袋。该方法生产周期短、有效成分含量高、管理容易，不需 要特殊的化学试剂。
[0006] 本发明采用的技术方案如下： 一种灵芝菌固体发酵提取物的制备方法，包括如下步骤： 步骤（1 )，灵芝菌种制备：将灵芝斜面菌种于一级菌种培养液中进行活化，生长4-5天， 得到一级菌种；分离后将一级菌种转入二级菌种培养液中进行培养，4-5天后得二级菌种； 步骤（2)，固体培养基配制：按质量比1.8-2. 2:0. 9-1. 1:0. 9-1. 1:6称取三七残渣、甘 蔗渣、米糠和纯化水，充分拌匀后，将其装入培养袋中，每袋重量为I. 4-1. 7kg，灭菌后备用， 得到固体培养基； 步骤（3)，接种发酵：将步骤（1)得到的二级菌种转接至步骤（2)得到的固体培养基内， 接种量为10-30%，接种完毕扎袋时两边与外界相通以供氧；接种后将固体培养基置于温度 25-30°C，湿度60-75%的培养环境下进行暗培养； 步骤（4)，培养终点确定：待固体培养基长满灵芝菌丝体而未长子实体前即可结束培 养； 步骤（5)，共发酵提取物的制备：对长满菌丝体的固体培养基进行提取，提取液经浓 缩、干燥，得共发酵产物，即灵芝菌固体发酵提取物，该灵芝菌固体发酵提取物中灵芝多糖 含量> 50%，灰分含量< 10%。
[0007] 上述技术方案步骤（1)中所述的斜面菌种为灵芝菌种接种于PDA培养基得到的， 所述的PDA培养基为马铃薯琼脂培养基，pH值自然。
[0008] 上述技术方案步骤（1)中所述的一级、二级菌种培养液均为包括按照重量份数计 的如下组分：马铃薯200份，葡萄糖20份，蛋白胨2份，KH 2PO4I份，MgSO4O. 6份，水1000份； pH自然。
[0009] 上述技术方案步骤（2)中所述的固体培养基三七残渣、甘蔗渣和米糠的质量比为 2 :1 :1。
[0010] 上述技术方案，进一步优选的是所述的三七残渣为提取三七总皂苷后的三七残 渣，所述的甘蔗渣为榨糖后的甘蔗渣。
[0011] 上述技术方案，步骤（2)中所述的培养袋为低压聚乙烯袋。
[0012] 上述技术方案步骤（3)中所述的扎袋的具体操作为将固体培养基的两端用PTFE 无菌封口透气膜封口。
[0013] 上述技术方案步骤（3)中所述的接种的具体操作是：灭菌备用的固体培养基和二 级菌种液在无菌操作间内进行接种，用长柄镊子在固体培养基顶端均匀垂直打三个孔，每 个孔接种15_20ml的菌种液，再用培养基盖住接种的孔。
[0014] 步骤（4)中所述的培养时间为15-25天。
[0015] 上述技术方案步骤（5)中所述的提取方法为将长满菌丝体的培养基用质量倍数 1. 5-2. 5倍量，浓度为85%乙醇回流提取2-3次，过滤，合并滤液得灵芝共发酵物乙醇提取 液，浓缩至粘稠后，盛于烤盘中于70°C的鼓风干燥箱中干燥，得到干燥物A ;滤渣用质量倍 数1. 5-2. 5倍量的纯化水热回流提取2-3次，过滤，合并滤液得灵芝共发酵物水提取液，浓 缩，喷雾干燥，得到干燥物B ;将干燥物A和干燥物B合并，即得灵芝菌固体发酵提取物。
[0016] 本发明与现有技术相比，其有益效果为： 1、本发明方法与传统的人工栽培和深层液体发酵方法相比，生产周期短，产量及质量 稳定，利于产业化，本发明生产的灵芝菌固体发酵提取物可作为功能性保健食品的原料；本 发明通过在制备灵芝菌固体发酵提取物的步骤中充分利用提取皂苷后的三七残渣和榨糖 后的甘蔗渣，提高了废渣的综合利用率，降低了成本；同时一定程度上促进灵芝菌的生长和 增加发酵物的多糖含量。
[0017] 2、本发明不需要特殊的化学试剂，提取溶剂主要为水和乙醇，安全无毒，有利于产 品的安全生产及对环境的保护。
[0018] 3、本发明在制备灵芝菌固体发酵提取物的步骤中，培养大环境为特定的温湿度下 暗培养，管理容易。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
[0020] 本发明所使用的药品、试剂和仪器均为普通市售产品。
[0021] 实施例1 一种灵芝菌固体发酵提取物的制备方法，包括如下步骤： 步骤（I )，灵芝菌种制备：将灵芝菌种接种于PDA培养基得到的灵芝斜面菌种于一级菌 种培养液中进行活化，生长4天，得到一级菌种；分离后将一级菌种转入二级菌种培养液中 进行培养，4天后得二级菌种；其中，所述的一级、二级菌种培养液均为包括按照重量份数 计的如下组分：马铃薯200份，葡萄糖20份，蛋白胨2份，KH 2PO4I份，MgSO4O. 6份，水1000 份；pH自然； 步骤（2)，固体培养基配制：按质量比1.8:0.9:1. 1:6称取三七残渣、甘蔗渣、米糠和纯 化水，充分拌匀后，将其装入低压聚乙烯袋中，每袋重量为I. 4kg，灭菌后备用，得到固体培 养基； 步骤（3)，接种发酵：将步骤（1)得到的二级菌种转接至步骤（2)得到的固体培养基内， 接种量为10%，接种完毕将固体培养基的两端用PTFE无菌封口透气膜封口；接种后将固体 培养基置于温度25°C，湿度60%的培养环境下进行暗培养；所述的接种的具体操作是：灭菌 备用的固体培养基和二级菌种液在无菌操作间内进行接种，用长柄镊子在固体培养基顶端 均匀垂直打三个孔，每个孔接种15ml的菌种液，再用培养基盖住接种的孔； 步骤（4)，培养终点确定：待固体培养基长满灵芝菌丝体而未长子实体前即可结束培 养，所述的培养时间为15天； 步骤（5)，共发酵提取物的制备：将长满菌丝体的培养基用质量倍数1. 5倍量，浓度为 85%乙醇回流提取3次，过滤，合并滤液得灵芝共发酵物乙醇提取液，浓缩至粘稠后，盛于烤 盘中于70°C的鼓风干燥箱中干燥，得到干燥物A ;滤渣用质量倍数1. 5倍量的纯化水热回流 提取3次，过滤，合并滤液得灵芝共发酵物水提取液，浓缩，喷雾干燥，得到干燥物B ;将干燥 物A和干燥物B合并，即得灵芝菌固体发酵提取物。
[0022] 其中，所述的三七残渣为提取三七总皂苷后的三七残渣，所述的甘蔗渣为榨糖后 的甘蔗渣。
[0023] 本实施例共培养15袋固体培养基，得到灵芝菌固体发酵提取物1250g，多糖含量 为52. 01%，灰分含量为6. 00%。
[0024] 实施例2 一种灵芝菌固体发酵提取物的制备方法，包括如下步骤： 步骤（1 )，灵芝菌种制备：将灵芝菌种接种于PDA培养基得到的灵芝斜面菌种于一级菌 种培养液中进行活化，生长5天，得到一级菌种；分离后将一级菌种转入二级菌种培养液中 进行培养，5天后得二级菌种；其中，所述的一级、二级菌种培养液均为包括按照重量份数 计的如下组分：马铃薯200份，葡萄糖20份，蛋白胨2份，KH 2PO4I份，MgSO4O. 6份，水1000 份；pH自然； 步骤（2)，固体培养基配制：按质量比2. 2: 1. 1:0. 9:6称取三七残渣、甘蔗渣、米糠和 纯化水，充分拌匀后，将其装入低压聚乙烯袋中，每袋重量为1.7kg，灭菌后备用，得到固体 培养基； 步骤（3)，接种发酵：将步骤（1)得到的二级菌种转接至步骤（2)得到的固体培养基内， 接种量为30%，接种完毕将固体培养基的两端用PTFE无菌封口透气膜封口；接种后将固体 培养基置于温度30°C，湿度75%的培养环境下进行暗培养；所述的接种的具体操作是：灭菌 备用的固体培养基和二级菌种液在无菌操作间内进行接种，用长柄镊子在固体培养基顶端 均匀垂直打三个孔，每个孔接种20ml的菌种液，再用培养基盖住接种的孔； 步骤（4)，培养终点确定：待固体培养基长满灵芝菌丝体而未长子实体前即可结束培 养，所述的培养时间为25天； 步骤（5)，共发酵提取物的制备：将长满菌丝体的培养基用质量倍数2倍量，浓度为85% 乙醇回流提取2次，过滤，合并滤液得灵芝共发酵物乙醇提取液，浓缩至粘稠后，盛于烤盘 中于70°C的鼓风干燥箱中干燥，得到干燥物A ;滤渣用质量倍数2倍量的纯化水热回流提取 2次，过滤，合并滤液得灵芝共发酵物水提取液，浓缩，喷雾干燥，得到干燥物B ;将干燥物A 和干燥物B合并，即得灵芝菌固体发酵提取物。
[0025] 其中，所述的三七残渣为提取三七总皂苷后的三七残渣，所述的甘蔗渣为榨糖后 的甘蔗渣。
[0026] 本实施例共培养12袋固体培养基，得到灵芝菌固体发酵提取物1050g，多糖含量 为57. 11%，灰分含量为5. 70%。
[0027] 实施例3 一种灵芝菌固体发酵提取物的制备方法，包括如下步骤： 步骤（1 )，灵芝菌种制备：将灵芝菌种接种于PDA培养基得到的灵芝斜面菌种于一级菌 种培养液中进行活化，生长4. 5天，得到一级菌种；分离后将一级菌种转入二级菌种培养液 中进行培养，4. 8天后得二级菌种；其中，所述的一级、二级菌种培养液均为包括按照重量 份数计的如下组分：马铃薯200份，葡萄糖20份，蛋白胨2份，KH 2PO4I份，MgSO4O. 6份，水 1000份；pH自然； 步骤（2)，固体培养基配制：按质量比2:1:1:6称取三七残渣、甘蔗渣、米糠和纯化水， 充分拌匀后，将其装入低压聚乙烯袋中，每袋重量为1.6kg，灭菌后备用，得到固体培养基； 步骤（3)，接种发酵：将步骤（1)得到的二级菌种转接至步骤（2)得到的固体培养基内， 接种量为20%，接种完毕将固体培养基的两端用PTFE无菌封口透气膜封口；接种后将固体 培养基置于温度27°C，湿度68%的培养环境下进行暗培养；所述的接种的具体操作是：灭菌 备用的固体培养基和二级菌种液在无菌操作间内进行接种，用长柄镊子在固体培养基顶端 均匀垂直打三个孔，每个孔接种18ml的菌种液，再用培养基盖住接种的孔； 步骤（4)，培养终点确定：待固体培养基长满灵芝菌丝体而未长子实体前即可结束培 养，所述的培养时间为20天； 步骤（5)，共发酵提取物的制备：将长满菌丝体的培养基用质量倍数2. 5倍量，浓度为 85%乙醇回流提取2次，过滤，合并滤液得灵芝共发酵物乙醇提取液，浓缩至粘稠后，盛于烤 盘中于70°C的鼓风干燥箱中干燥，得到干燥物A ;滤渣用质量倍数2. 5倍量的纯化水热回流 提取2次，过滤，合并滤液得灵芝共发酵物水提取液，浓缩，喷雾干燥，得到干燥物B ;将干燥 物A和干燥物B合并，即得灵芝菌固体发酵提取物。
[0028] 其中，所述的三七残渣为提取三七总皂苷后的三七残渣，所述的甘蔗渣为榨糖后 的甘蔗渣。
[0029] 本实施例共培养15袋固体培养基，得到灵芝菌固体发酵提取物1200g，多糖含量 为54. 60%，灰分含量为5. 60%。
[0030] 表1为按本发明方法制备的灵芝菌固体发酵提取物多糖含量与其他专利方法的 比较，具体如下： 表1
【权利要求】
1. 一种灵芝菌固体发酵提取物的制备方法，其特征在于包括如下步骤： 步骤（1 )，灵芝菌种制备：将灵芝斜面菌种于一级菌种培养液中进行活化，生长4-5天， 得到一级菌种；分离后将一级菌种转入二级菌种培养液中进行培养，4-5天后得二级菌种； 步骤（2)，固体培养基配制：按质量比1. 8-2. 2:0. 9-1. 1:0. 9-1. 1:6称取三七残渣、甘 蔗渣、米糠和纯化水，充分拌匀后，将其装入培养袋中，每袋重量为1. 4-1. 7kg，灭菌后备用， 得到固体培养基； 步骤（3)，接种发酵：将步骤（1)得到的二级菌种转接至步骤（2)得到的固体培养基内， 接种量为10-30%，接种完毕扎袋时两边与外界相通以供氧；接种后将固体培养基置于温度 25-30°C，湿度60-75%的培养环境下进行暗培养； 步骤（4)，培养终点确定：待固体培养基长满灵芝菌丝体而未长子实体前即可结束培 养； 步骤（5)，共发酵提取物的制备：对长满菌丝体的固体培养基进行提取，提取液经浓 缩、干燥，得共发酵产物，即灵芝菌固体发酵提取物，该灵芝菌固体发酵提取物中灵芝多糖 含量> 50%，灰分含量< 10%。
2. 根据权利要求1所述的灵芝菌固体发酵提取物的制备方法，其特征在于步骤（1)中 所述的斜面菌种为灵芝菌种接种于PDA培养基得到的。
3. 根据权利要求1所述的灵芝菌固体发酵提取物的制备方法，其特征在于步骤（1)中 所述的一级、二级菌种培养液均为包括按照重量份数计的如下组分：马铃薯200份，葡萄糖 20份，蛋白胨2份，KH 2P041份，MgS040 . 6份，水1000份；pH自然。
4. 根据权利要求1所述的灵芝菌固体发酵提取物的制备方法，其特征在于步骤（2)中 所述的固体培养基中三七残渣、甘蔗渣和米糠的质量比为2 :1 :1。
5. 根据权利要求4所述的灵芝菌固体发酵提取物的制备方法，其特征在于所述的三七 残渣为提取三七总皂苷后的三七残渣，所述的甘蔗渣为榨糖后的甘蔗渣。
6. 根据权利要求1所述的灵芝菌固体发酵提取物的制备方法，其特征在于步骤（2)中 所述的培养袋为低压聚乙烯袋。
7. 根据权利要求1所述的灵芝菌固体发酵提取物的制备方法，其特征在于步骤（3)中 所述的扎袋的具体操作为将固体培养基的两端用PTFE无菌封口透气膜封口。
8. 根据权利要求1所述的灵芝菌固体发酵提取物的制备方法，其特征在于步骤（3)中 所述的接种的具体操作是：灭菌备用的固体培养基和二级菌种液在无菌操作室内进行接 种，用长柄镊子在固体培养基顶端均匀垂直打三个孔，每个孔接种15_20ml的菌种液，再用 培养基盖住接种孔。
9. 根据权利要求1所述的灵芝菌固体发酵提取物的制备方法，其特征在于步骤（4)中 所述的培养时间为15-25天。
10. 根据权利要求1所述的灵芝菌固体发酵提取物的制备方法，其特征在于步骤（5)中 所述的提取方法为将长满菌丝体的培养基用质量倍数1. 5-2. 5倍量，浓度为85%乙醇回流 提取2-3次，过滤，合并滤液得灵芝共发酵物乙醇提取液，浓缩至粘稠后，于70°C的鼓风干 燥箱中干燥，得到干燥物A ;滤渣用质量倍数1. 5-2. 5倍量的纯化水热回流提取2-3次，过 滤，合并滤液得灵芝共发酵物水提取液，浓缩，喷雾干燥，得到干燥物B ;将干燥物A和干燥 物B合并，即得灵芝菌固体发酵提取物。
【文档编号】A23L1/29GK104288187SQ201410551930
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年10月17日 优先权日:2014年10月17日
【发明者】康进, 侯艳波, 邵艳红, 陈金东, 任杨帆 申请人:云南维和药业股份有限公司