一种利用静息乳酸菌技术转化菜油脚料生产共轭亚油酸的方法
【专利摘要】一种利用静息乳酸菌技术转化菜油脚料生产共轭亚油酸的方法，包括：提取油脂，乳化，酶解，制备静息乳酸菌，静息乳酸菌转化菜油脚料提取油脂酶解液生成共轭亚油酸，共轭亚油酸的提取等步骤。本发明可实现农产品废弃物菜油脚料的资源化利用，具有原料成本低，转化细胞密度高，转化率可达20％-40％，转化过程不易染菌，干扰物质少，产物易分离等优点。
【专利说明】一种利用静息乳酸菌技术转化菜油脚料生产共轭亚油酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用农产品废弃物菜油脚料为原料，采用静息乳酸菌技术生产共轭亚油酸的方法。
【背景技术】
[0002]目前共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid, CLA)的制备多采用化学法,该法是以价格为3万/T的红花油或葵花油为原料，采用高温、高压、碱法异构化使油中的亚油酸发生异构化而生成共轭亚油酸，其缺点是成本高，且合成时产生的t，t异构体对人体有害。微生物细胞发酵法生产CLA，是以食用油为生产原料，微生物(如乳酸菌属、真杆菌属、丁酸弧菌属等)为生产用菌株，虽然成本较低、生物稳定性好，但是存在菌种很难达到高密度转化、生长周期长、易染菌、产物复杂等问题。
[0003]静息细胞转化生产CLA技术具有以下优点:(1)细胞处于休眠状态，可以作为亚油酸异构酶的天然透析袋，免去了酶提取纯化的繁琐过程和高额成本，产物CLA以游离形式积累在细胞外，易于提取；(2)生成的反应产物是具有生理活性的c9，tll-CLA和tlO, C12-CLA ；(3)反应只需在适宜的介质体系条件下进行，转化产物单一，CLA能以高浓度积累；(4)静息细胞可以达到很高的密度，比发酵法的细胞密度高出十多倍。
[0004]我国是世界上最大的油菜籽生产国，年产量早已突破1000万吨，在菜籽油加工过程中，油脚料每年排放量高达20万吨之多。油脚极易发酵变质、酸败发臭，是我国城镇油厂环境污染的重要源头。菜油脚料中含有25%-30%的中性油，25%-35%的磷脂，其余为蛋白质、氨基酸，糖等碳水化合物，矿质元素及色素等物质，所以油脚的利用开发成为环境治理和生物资源再利用的研究热点。目前菜油脚料主要用来制备生物柴油、饲料、农业肥料等，而从中提取中性脂肪酸，并进一步加工转化获得高附加值产品CLA，却极为少见。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供了一种利用静息乳酸菌实现农产品废弃物菜油脚料转化生产共轭亚油酸(CLA)的方法。
[0006]本发明是通过以下技术方案实现的。
[0007]本发明工艺步骤包括。
[0008](I)提取油脂:称取菜油脚料到烧杯中，放在水浴锅中60_90°C搅拌加热20-40min，期间加入少量微沸蒸馏水；将热处理后的菜油脚料4000-6000 rpm离心10-30 min，离心后上层为油层(中性油脂)，中层为水层，下层为磷脂等杂质固体，倾出上层油，即为菜油脚料中所提取的中性油脂。
[0009](2)乳化:将步骤(I)得到的中性油脂与Tween 80按照1:0.8-1.7比例混合，加入适量的蒸馏水，进行超声波乳化处理(500 W，超声10 S，间歇5 S，作用10-20次)，110-121°C灭菌20-30 min，得油脂乳化液。
[0010](3)酶解:取步骤(2)的油脂乳化液放入锥形瓶中，加入pH值7.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，添加黑曲霉脂肪酶粉至终浓度为150-270 U/mL,40-45°C, 120-150 rpm酶解30-50 min，得油脂酶解液。
[0011](4)制备静息乳酸菌:从新鲜斜面培养基上挑取乳酸菌，接种到MRS培养基中，37°C厌氧培养20-26 h，得种子液。将种子液按3%-5%的接种量接种至添加有亚油酸乳化液的MRS培养基中进行诱导增殖培养，37°C静置培养20 h ;培养液4°C，4000-6000 rpm离心15-30 min，去除上清液，底部菌体用无菌生理盐水洗涤2_3次，离心收集，制备静息乳酸菌菌悬液。
[0012](5)静息乳酸菌转化菜油脚料提取油脂酶解液生成CLA:取步骤(3)的油脂酶解液放入反应管，加入步骤(4)的静息乳酸菌菌悬液，加入适量0.1 mo I/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，使得提取油脂终浓度为70-80 mg/mL, 32-36°C,90-110 rpm转化22-26 h，得CLA转化液。
[0013](6)CLA的提取:取步骤(5)的CLA转化液与正己烷按1:2_5的比例混合，快速混匀4-6 min, 3800 -5000 rpm离心4_6min,分为三层(脂相、乳化层和水相),去除最下层水相，然后加入适量蒸馏水，混匀4-6 min，洗涤水溶性物质，离心分层去除下层水相，将脂相层通过无水硫酸钠过滤，旋转蒸发去除正己烷即得到CLA。
[0014]本发明可实现农产品废弃物菜油脚料的资源化利用，具有原料成本低，转化细胞密度高，转化效率高(转化率可达20 % -40 % )，转化过程不易染菌，干扰物质少，产物易分离等优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为本发明实施例中乳酸菌转化萃取液和提取油脂的紫外光谱扫描图。
【具体实施方式】
[0016]下面通过实施例并结合附图对本发明作详细说明。
[0017]实施例:按以下工艺流程实施。
[0018](I)提取菜油脚料中的中性脂肪酸油脂:称取20 g的菜油脚料到200 mL的烧杯中，放在水浴锅中85°C搅拌加热30 min，期间加入少量微沸蒸馏水，30min后，将菜油脚料转入50 mL离心管中，5000 rpm离心30 min,取出，可以看见离心管内容物分为3层,上层为油层(中性油脂)，中层为水层，下层为磷脂等杂质固体，倾出上层油，称重。所得上层中性油脂比菜油脚料颜色浅，透明度较好，提取率可达21.76%，所得油脂酸价为24.2 mg/g，皂化值为194.706 mg/g，碘价为69.105 g/100g。经气相色谱检测分析，可知提取油脂中的不饱和脂肪酸达到90%以上，其中亚油酸含量为15.5%，油酸含量为18.90%，亚麻酸含量为10%左右。
[0019](2)制备提取油脂乳化液:将步骤(I)的提取油脂与Tween 80按照1: 1.2比例混合，放入50 mL三角烧瓶中，加入适量的蒸馏水，进行超声波乳化处理(500 W，超声10 S，间歇5 S，作用20次)，置121°C灭菌30 min，即为提取油脂乳化液，置4°C备用。
[0020](3)制备提取油脂酶解液:取一定量的步骤(2)的油脂乳化液于50 mL锥形瓶中，加入pH值7.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，添加黑曲霉脂肪酶粉至终浓度为240 U/mL,40°C, 150 rpm酶解45 min，即为提取油脂酶解液。
[0021](4)制备静息乳酸菌:从新鲜斜面培养基上挑取一环植物乳杆菌CGMCC1.0557和嗜酸乳杆菌CGMCC1.1854，分别接种到150 mL MRS培养基中，37°C厌氧培养22 h，即为种子液。按3%-5%的接种量分别接种至添加有亚油酸乳化液的MRS培养基中进行诱导增殖培养，37°C静置培养20 h。培养液4°C，5000 rpm离心20 min，去除上清液，底部菌体用无菌生理盐水洗涤2次，离心收集，分别制备得到0.25 g/mL的静息乳酸菌菌悬液。
[0022](5)静息乳酸菌转化菜油脚料提取油脂酶解液生成CLA:往2个50 mL离心管中分别加入5 mL步骤(4)的静息植物乳杆菌菌悬液、静息嗜酸乳杆菌菌悬液，再分别加入15mL0.1 mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和3 mL步骤(3)的油脂酶解液，使得提取油脂终浓度为75 mg/mL, 35°C，100 rpm转化24 h，即得到CLA转化液。
[0023](6) CLA的提取和检测-M 3 mL步骤(5)的CLA转化液加入15 mL离心管中，力口入8 mL正己烧,快速混勻5 min, 4000 rpm离心5 min,分为三层(脂相、乳化层和水相),用移液枪吸取去除最下层水相，然后加入3 mL蒸馏水，混匀2 min，洗涤水溶性物质，离心分层去除下层水相，将脂相层通过无水硫酸钠过滤，定容至25 mL容量瓶中，即得到转化液待测样，并测定其在233 nm处吸光值。通过换算可知嗜酸乳杆菌转化而得的转化液中CLA含量为1130.17μ g/mL，转化率达到36.11% ;植物乳杆菌转化而得的转化液中CLA含量为869.33 μ g/mL，转化率达到27.77%。亚油酸在200-205 nm之间有最大吸光值，而CLA在233-234 nm之间有最大吸光值。比较乳酸菌转化24h后萃取液和菜油脚料提取油脂酶解液的光谱扫描图(见附图1)，可以看出，转化24h后萃取液在205 nm处的吸光值降低了，233nm处的吸光值升高了，说明菜油脚料提取油脂中的部分亚油酸在乳酸菌的作用下转化生成了 CLA。
【权利要求】
1.一种利用静息乳酸菌技术转化菜油脚料生产共轭亚油酸的方法，其特征是包括如下步骤: (1)提取油脂:称取菜油脚料到烧杯中，放在水浴锅中60-90°C搅拌加热20-40min，期间加入少量微沸蒸馏水；将热处理后的菜油脚料4000-6000 rpm离心10-30 min，倾出上层油，得中性油脂； (2)乳化:将步骤(I)得到的中性油脂与Tween80按照1:0.8-1.7比例混合，加入适量的蒸馏水，进行超声波乳化处理:500 W、超声10 S、间歇5 S、作用10-20次，110-121°C灭菌20-30 min，得油脂乳化液； (3)酶解:取步骤(2)的油脂乳化液放入锥形瓶中，加入pH值7.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，添加黑曲霉脂肪酶粉至终浓度为150-270 U/mL,40-45°C, 120-150 rpm酶解30-50min,得油脂酶解液； (4)制备静息乳酸菌:从新鲜斜面培养基上挑取乳酸菌，接种到MRS培养基中，37°C厌氧培养20-26 h，得种子液；将种子液按3%-5%的接种量接种至添加有亚油酸乳化液的MRS培养基中进行诱导增殖培养，37°C静置培养20 h ;培养液4°C，4000-6000 rpm离心15-30min，去除上清液，底部菌体用无菌生理盐水洗涤2-3次，离心收集，得静息乳酸菌菌悬液； (5)静息乳酸菌转化菜油脚料提取油脂酶解液生成共轭亚油酸:取步骤(3)的油脂酶解液放入反应管，加入步骤(4)的静息乳酸菌菌悬液，加入适量0.1 mo I/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，使得提取油脂终浓度为70-80 mg/mL, 32-36°C,90-110 rpm转化22-26 h，得共轭亚油酸转化液； (6)共轭亚油酸的提取:取步骤(5)的共轭亚油酸转化液与正己烷按1:2-5的比例混合，快速混勻4-6 min, 3800 -5000 rpm离心4_6min,分为三层(脂相、乳化层和水相),去除最下层水相，然后加入适量蒸馏水，混匀4-6 min，洗涤水溶性物质，离心分层去除下层水相，将脂相层通过无水硫酸钠过滤，旋转蒸发去除正己烷即得到共轭亚油酸。
【文档编号】C12P7/64GK104388482SQ201410584037
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月28日 优先权日:2014年10月28日
【发明者】巫小丹, 刘志凤, 徐尔尼, 杨欣, 黎紫含, 叶新顺, 张珊珊 申请人:南昌大学